4種鐵線蓮屬植物種子萌發(fā)特性

楊 藝，王 娜，馬穎杰，王奎玲，劉慶華，劉慶超

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園林與林學(xué)院，山東 青島 266109； 2.威海水木原景觀設(shè)計(jì)有限公司，山東 威海 264205)

毛茛科(Ranunculaceae)鐵線蓮屬(Clematis)植物多為木質(zhì)或草質(zhì)藤本，少數(shù)為多年生草本、亞灌木或灌木[1]。該屬植物在我國各地均有分布，常見于低山區(qū)的丘陵處灌木叢中[2-5]，其花量大，花期長，觀賞價值較高，養(yǎng)護(hù)管理方便，具有廣泛的園林應(yīng)用前景。該屬植物主要以種子進(jìn)行繁殖，但多需經(jīng)過春化作用才能萌發(fā)，且該屬植物種子發(fā)芽率普遍較低，發(fā)芽時間較長，某些雜交種的種子甚至需要3年時間才能萌發(fā)[6]，不利于引種、雜交等研究的進(jìn)行，限制了該屬植物在園林中的應(yīng)用，其野生種質(zhì)資源利用率較低。目前，國內(nèi)外關(guān)于鐵線蓮屬植物的研究主要集中于系統(tǒng)分類及藥用價值研究，而對該屬植物種子萌發(fā)特性的研究較少。

植物生長調(diào)節(jié)劑對種子的萌發(fā)具有一定調(diào)控作用，赤霉素(GA3)可打破種子休眠，細(xì)胞分裂素(6-BA)能促進(jìn)細(xì)胞分裂和植物生長，二者常用于調(diào)節(jié)種子萌發(fā)。除此之外，溫水浸種也是促進(jìn)種子萌發(fā)、提高種子發(fā)芽率的方法之一。本研究以轉(zhuǎn)子蓮(C.patens)、棉團(tuán)鐵線蓮(C.hexapetala)、大葉鐵線蓮(C.heracleifolia)和齒葉鐵線蓮(C.serratifolia)4種野生鐵線蓮屬植物種子為試驗(yàn)材料，研究不同濃度GA3和6-BA及浸種溫度對其萌發(fā)的影響，以期獲得提高4種鐵線蓮屬植物種子發(fā)芽率的方法，從而為野生鐵線蓮屬植物的資源保存、雜交育種、引種栽培等提供一定理論依據(jù)，擴(kuò)大該屬植物在園林中的應(yīng)用。

1 材料與方法

轉(zhuǎn)子蓮和大葉鐵線蓮采于遼寧省丹東市草莓溝，棉團(tuán)鐵線蓮與齒葉鐵線蓮采于吉林省磐石市煙筒山。4種野生鐵線蓮屬植物均于2014年引種于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園林與林學(xué)院試驗(yàn)地(120°12′ E， 36°20′ E，暖溫帶季風(fēng)大陸性氣候，年平均氣溫12.6 ℃，年平均降水量約700 mm)。2016年采集成熟種子備用。

1.1 鐵線蓮屬植物種子基本參數(shù)測定

1.1.1種子形態(tài)觀察 參考《中國植物志》及《中國植物種子形態(tài)學(xué)研究方法和術(shù)語》中的描述方法對種子形態(tài)進(jìn)行觀察描述。

隨機(jī)選取50粒成熟種子，在體視顯微鏡下觀察其形狀及表面特性，利用游標(biāo)卡尺測定種子(去宿存花柱)長、寬及厚度，利用英國皇家園藝協(xié)會比色卡測定成熟種子的顏色。

1.1.2種子千粒重測定 種子經(jīng)肉眼檢測，去除破粒、蟲蝕粒和其他雜質(zhì)，除去頂端宿存花柱后稱千粒重。采取百粒法測定，重復(fù)8次，計(jì)算平均值，結(jié)果擴(kuò)大10倍后獲得種子千粒重。

1.1.3種子含水量測定 隨機(jī)選取100粒種子放入稱量瓶中，置于105 ℃恒溫箱中2 h后放入干燥器中冷卻30 min，稱取重量，計(jì)算其含水量，重復(fù)3次。

1.2 鐵線蓮屬植物種子萌發(fā)試驗(yàn)

選取飽滿健康的種子，去除果皮后，使用2%次氯酸鈉浸泡15 min，蒸餾水沖洗3次。

1.2.1浸種溫度對4種鐵線蓮屬植物種子萌發(fā)的影響 本研究分別對4種鐵線蓮種子設(shè)置了6個浸種溫度梯度，以15 ℃室溫條件為對照。將種子分別置于15、20、25、30、35和40 ℃的恒溫水中浸種處理24 h后，取出種子置于直徑11 cm培養(yǎng)皿中。以雙層濾紙作為發(fā)芽床，大葉鐵線蓮放置于20 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，棉團(tuán)鐵線蓮于25 ℃/20 ℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其余兩種置于25 ℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[7-8]。發(fā)芽過程中用蒸餾水保濕。每個處理50粒種子，重復(fù)3次。

1.2.2激素種類及濃度對4種鐵線蓮屬植物種子萌發(fā)的影響 對4種鐵線蓮種子設(shè)置了7個不同濃度梯度的6-BA和GA3處理(表1)。將種子放置于不同激素處理液中，清水作為對照，20 ℃下浸種24 h后置于培養(yǎng)皿中，放置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行全光照培養(yǎng)，各種子培養(yǎng)條件同1.2.1。每處理50粒種子，重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

按照下列公式計(jì)算種子含水量、發(fā)芽率、發(fā)芽勢[9-11]：

種子含水量=(初始重量-烘干重量)/初始重量×100%；

發(fā)芽率=發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%；

發(fā)芽勢=規(guī)定時間內(nèi)發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%。

表1 4種鐵線蓮種子激素處理濃度Table 1 The concentration of hormone treatments of four species of Clematis

以胚根長度為種子長度的1/2作為種子發(fā)芽的標(biāo)志，以第1粒種子開始發(fā)芽作為種子開始發(fā)芽時間，連續(xù)7 d無種子發(fā)芽作為發(fā)芽結(jié)束標(biāo)志。采用發(fā)芽后第7天的發(fā)芽情況計(jì)算發(fā)芽勢。每天定時觀察并記錄種子發(fā)芽狀況。

利用SPSS 22進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及單因素方差分析，并采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種鐵線蓮屬植物種子形態(tài)及基本參數(shù)

4種鐵線蓮種子均為瘦果，花柱宿存，果皮與宿存花柱表面均被白色絨毛(圖1)，以棉團(tuán)鐵線蓮種子表面被白色長柔毛最多。4種鐵線蓮種子的千粒重及含水量均差異顯著(P<0.05)(表2)，不同鐵線蓮種子的長、寬及厚度也有差異。除棉團(tuán)鐵線蓮種子較扁平外，其余3種鐵線蓮種子兩面均凸起，有明顯背脊(圖1)。

圖1 4種鐵線蓮屬植物種子形態(tài)Fig. 1 The morphology of four species of Clematis seeds

指標(biāo)Parameter轉(zhuǎn)子蓮 C. patens棉團(tuán)鐵線蓮 C. hexapetala大葉鐵線蓮 C. heracleifolia齒葉鐵線蓮 C. serratifolia種子形態(tài)Seed morphology瘦果闊卵形Achene broadly ovate瘦果倒卵形、卵形,扁平Achenes flat,obovoid or ovoid瘦果卵形Achene, ovoid瘦果卵形Achene, ovoid成熟果色 Seed colour灰-橙色系166AGreyed-orange group 166A灰-橙色系175BGreyed-orange group 175B褐色系200BBrown group 200B灰-橙色系165CGreyed-orange group 165C長Length/mm5.17±0.37b6.16±0.39a3.73±0.15c3.34±0.32c寬Width/mm4.51±0.24a3.87±0.28b2.48±0.19c1.44±0.10d長∶寬Length∶width1.27±0.11c1.60±0.14b1.51±0.17b2.34±0.34a厚Thickness/mm1.81±0.02a1.21±0.01b0.98±0.01b0.63±0.01c千粒重Kilograin weight/g20.77±0.31a7.12±0.18b4.23±0.07c0.93±0.07d含水量 Water content/%18.47±0.36a12.46±0.32b8.80±0.11c6.90±0.15d

同行不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。果實(shí)顏色以英國皇家園藝協(xié)會比色卡中的組名、表名和大寫字母表示。

Different lowercase letters within the same row indicate significant difference at the 0.05 level. Seed color is specified by a group name,a sheet name and a capital letter e.g. in RHS color chart.

2.2 浸種溫度對4種鐵線蓮屬植物種子萌發(fā)的影響

4種鐵線蓮種子在不同浸種溫度作用下，各發(fā)芽指標(biāo)均表現(xiàn)出較大差異。隨著浸種溫度的升高，轉(zhuǎn)子蓮種子發(fā)芽率呈現(xiàn)先降后增的趨勢，但與對照相比，浸種溫度的變化對該種子的發(fā)芽勢無顯著影響(P>0.05)(表3)。各處理下，35～40 ℃溫水更有利于轉(zhuǎn)子蓮種子萌發(fā)，以35 ℃處理下種子發(fā)芽情況最好。

對于棉團(tuán)鐵線蓮而言，其適宜萌發(fā)的溫度范圍較廣，各溫度處理均能顯著促進(jìn)鐵線蓮種子的萌發(fā)(P<0.05)(表3)。隨著浸種溫度的上升，棉團(tuán)鐵線蓮種子發(fā)芽率呈現(xiàn)先增后降的趨勢。除25 ℃外，各溫度處理下種子的發(fā)芽勢與對照相比無顯著差異(P>0.05)。以25 ℃處理下種子發(fā)芽率最高，在90%以上。

大葉鐵線蓮種子在25 ℃處理下發(fā)芽率和發(fā)芽勢最高，隨后隨著浸種溫度的升高，種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢均顯著下降(表3)。水溫過高不利于大葉鐵線蓮種子的萌發(fā)，以25 ℃為最適浸種溫度。該處理下，大葉鐵線蓮種子發(fā)芽率與對照相比顯著增加(P<0.05)，發(fā)芽勢無顯著差異(P>0.05)。

對于齒葉鐵線蓮，種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢均隨著浸種溫度的升高均先增后減(表3)。與轉(zhuǎn)子蓮不同，25～30 ℃更有利于促進(jìn)該種子萌發(fā)，以25 ℃為最適浸種溫度。該處理下種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢均較其他溫度處理顯著增加(P<0.05)。

表3 不同浸種溫度對4種鐵線蓮屬植物種子萌發(fā)的影響Table 3 Influence of soaking seeds under different water temperatures on the germination characteristics of four species of Clematis

同列不同小寫字母表示不同溫度間差異顯著(P<0.05)，下同。

Different lowercase letters within the same column indicate significant difference between different temperatures at the 0.05 level; similarly for the following tables.

2.3 不同激素處理對鐵線蓮屬植物種子萌發(fā)的影響

不同植物對激素的敏感度不同。隨著6-BA及GA3濃度的增加，轉(zhuǎn)子蓮種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢基本呈現(xiàn)先增后減趨勢(表4)。當(dāng)6-BA濃度達(dá)40 mg·L-1及以上或GA3濃度達(dá) 800 mg·L-1時，轉(zhuǎn)子蓮種子發(fā)芽率均下降至0。各處理中，以400 mg·L-1GA3較好，該處理下種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢顯著高于除10 mg·L-1GA3外的其余處理(P<0.05)。

對于棉團(tuán)鐵線蓮，不同濃度6-BA及GA3處理下種子萌發(fā)情況存在較大差異(表4)。各濃度6-BA處理下，種子發(fā)芽率及發(fā)芽勢基本呈現(xiàn)下降趨勢。當(dāng)GA3濃度逐漸增加時，種子發(fā)芽率無規(guī)律變化，但變化顯著(P<0.05)，發(fā)芽勢則無顯著變化(P>0.05)。各處理中，低濃度的6-BA和GA3均能顯著提高棉團(tuán)鐵線蓮種子的發(fā)芽率(P<0.05)，5 mg·L-16-BA和500 mg·L-1GA3處理為最適激素濃度，兩種處理均顯著提高種子發(fā)芽率(P<0.05)，但對發(fā)芽勢無顯著影響(P>0.05)。

當(dāng)6-BA濃度逐步提高，大葉鐵線蓮種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢均逐漸下降。6-BA對大葉鐵線蓮種子萌發(fā)存在明顯抑制現(xiàn)象。而伴隨GA3濃度的增加，大葉鐵線蓮種子發(fā)芽率總體上呈現(xiàn)上升趨勢(表4)。對于大葉鐵線蓮而言，低濃度6-BA及高濃度GA3均有利于種子萌發(fā)，以10 mg·L-16-BA處理下種子發(fā)芽情況最好。

與之相似，隨著6-BA濃度的增加，齒葉鐵線蓮種子發(fā)芽率也顯著下降(P<0.05)。而隨著GA3濃度的上升，種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢總體呈現(xiàn)先降后增的趨勢(表4)。6-BA及GA3均對齒葉鐵線蓮種子存在一定抑制作用，各處理中以5 mg·L-1GA3處理下種子發(fā)芽情況較好。

表4 不同激素處理對4種鐵線蓮屬植物種子萌發(fā)的影響Table 4 Influence of two kinds of hormone treatment on the germination characteristics of four species of Clematis

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)子蓮最適浸種溫度為35 ℃，棉團(tuán)鐵線蓮、大葉鐵線蓮及齒葉鐵線蓮種子萌發(fā)的最適浸種溫度均為25 ℃，而黎彩霞等[12]發(fā)現(xiàn)毛蕊鐵線蓮最適浸種溫度為20 ℃，說明不同植物的種子最適浸種溫度存在差異，可能與種胚對高溫的耐受能力有關(guān)。溫水浸種可以起到與激素相似的促進(jìn)作用，有效提高4種鐵線蓮屬植物種子的發(fā)芽率，這與紅芪(Hedysarumpolybotrys)[13]、蘿芙木(Rauvolfiaverticillata)[14]、云南石梓(Gmelinaarborea)[15]及白皮松(Pinusbungeana)[16]等種子的研究結(jié)果相一致。

影響種子萌發(fā)的因素較多，其中大多由于種子的自身原因?qū)е滦菝摺８鶕?jù)發(fā)生部位和誘因，種子休眠的類型可分為三大類，分別是內(nèi)源性休眠、外源性休眠和綜合性休眠[17]。內(nèi)源性休眠指由胚導(dǎo)致的休眠，如胚發(fā)育不全，種子內(nèi)抑制物質(zhì)的存在，內(nèi)源激素間的相互作用，或缺少必要的激素刺激其萌發(fā)；外源性休眠指胚以外的包被組織引致的休眠，如種子結(jié)構(gòu)特征導(dǎo)致種子受到機(jī)械阻礙，從而限制了種子的萌發(fā)；綜合性休眠則為內(nèi)源和外源結(jié)合引致的休眠。目前對于鐵線蓮屬植物種子休眠相關(guān)研究較少，僅許世泉等[18]對不同層積天數(shù)處理的東北鐵線蓮(C.ternifloravar.mandshurica)種胚進(jìn)行切片觀察發(fā)現(xiàn)該植物種子屬于胚后熟類型，即內(nèi)源性休眠，必須經(jīng)過一定的后熟處理才能打破休眠。植物外源激素一方面可以解除種子休眠，如GA3可刺激胚芽的營養(yǎng)生長，誘導(dǎo)相關(guān)酶的合成，促進(jìn)種子內(nèi)部貯藏物質(zhì)的降解[19-20]，另一方面可以調(diào)節(jié)種子內(nèi)部激素平衡，如GA3能使內(nèi)源吲哚-3-乙酸(IAA)含量增加，從而促進(jìn)種子萌發(fā)[21]，因此植物外源激素在調(diào)節(jié)種子萌發(fā)過程中具有重要意義。許世泉等[22]通過比較東北鐵線蓮種子發(fā)芽過程中內(nèi)源激素含量變化，發(fā)現(xiàn)處理初期種子內(nèi)脫落酸(ABA)含量明顯下降，生理成熟期后GA與玉米素核苷(ZR)含量持續(xù)升高，抑制萌發(fā)物質(zhì)含量的減少與促進(jìn)萌發(fā)物質(zhì)含量的上升是解除東北鐵線蓮種胚的主要原因。鄒竣竹等[23]發(fā)現(xiàn)適宜激素濃度浸種后，野牛草(Buchloedactyloides)內(nèi)源生長素、GA及ABA含量上升，可溶性糖與淀粉的累積促使種子發(fā)芽率大大提高。本研究中各激素處理下轉(zhuǎn)子蓮種子的發(fā)芽率均較低，發(fā)芽時間長達(dá)2個月，這可能有以下幾個方面的原因：一是種胚可能與東北鐵線蓮相似存在胚后熟的過程，當(dāng)該過程完成后才能具備發(fā)芽的能力[18]；二是轉(zhuǎn)子蓮可能與結(jié)縷草(Zoysisjaponica)、Sandersoniaaurantiaca和細(xì)葉鳶尾(Iristenuifolin)等[24-26]植物相似，其種子體內(nèi)含有某些物質(zhì)抑制種子萌發(fā)；三是轉(zhuǎn)子蓮種胚對試驗(yàn)中使用的外源激素種類不敏感[27]，種子內(nèi)源激素及相關(guān)酶的含量變化不明顯。導(dǎo)致轉(zhuǎn)子蓮發(fā)芽率低的原因及如何提高轉(zhuǎn)子蓮種子的萌發(fā)能力有待進(jìn)一步研究。

由于植物種類的差異，不同植物種子萌發(fā)適宜的激素種類不同，同屬植物間適宜的激素濃度范圍也大不相同[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，6-BA對轉(zhuǎn)子蓮、大葉鐵線蓮及齒葉鐵線蓮種子萌發(fā)均存在一定抑制作用，GA3較6-BA更有利于3種種子的萌發(fā)，這與野菊花(Dendranthemaindicum)、羊草(Leymuschinensis)和粉綠鐵線蓮(C.glauca)等種子[28-30]的研究結(jié)果相似。高濃度GA3能顯著促進(jìn)大葉鐵線蓮種子萌發(fā)(P<0.05)，而低濃度的6-BA或GA3更有利于棉團(tuán)鐵線蓮和齒葉鐵線蓮種子萌發(fā)，這與女萎(C.apiifolia)、毛蕊鐵線蓮(C.lasiandra)和山木通(C.finetiana)等[31]鐵線蓮屬植物種子的研究結(jié)果相似。4種植物對激素種類及濃度的敏感性均存在差異。一定范圍的激素濃度能提高種子活力，促進(jìn)種子萌發(fā)。當(dāng)激素濃度高于或低于該范圍時，可能會使種子內(nèi)部生理平衡被打亂，從而抑制種子萌發(fā)。

本研究中，大葉鐵線蓮種子發(fā)芽過程中并未出現(xiàn)發(fā)芽不穩(wěn)定的情況，且發(fā)芽率相對較高，這與王娜等[32]研究結(jié)果不一致，可能是由于去除果皮過程中減少了空?；虬l(fā)育不良的種子對試驗(yàn)的影響。5 mg·L-1GA3和500 mg·L-1GA3分別為齒葉鐵線蓮和棉團(tuán)鐵線蓮種子萌發(fā)最適濃度，該結(jié)果與王非等[33]結(jié)論一致，但與其所得發(fā)芽率及發(fā)芽勢相差較大，可能與本研究去除果皮并使用蒸餾水而非激素處理液保濕有關(guān)。

與對照相比，一定程度的溫水浸種及激素處理均能顯著提高棉團(tuán)鐵線蓮及齒葉鐵線蓮種子發(fā)芽率(P<0.05)，因此在實(shí)際育苗過程中可以考慮兩種方法結(jié)合使用，進(jìn)一步促進(jìn)種子萌發(fā)。對于轉(zhuǎn)子蓮而言，盡管激素處理在一定程度上能顯著提高轉(zhuǎn)子蓮種子的發(fā)芽率(P<0.05)，但與對照相比種子發(fā)芽率提高幅度仍較小，因此在轉(zhuǎn)子蓮的育苗過程中建議使用溫水浸種的方式。大葉鐵線蓮種子在清水處理或25 ℃溫水浸種下發(fā)芽率均高達(dá)80%，因此育苗過程中采用25 ℃溫水浸種即可。

本研究基本明晰了浸種溫度及兩種激素對4種鐵線蓮屬植物種子萌發(fā)特性的影響，為今后4種鐵線蓮屬植物的資源保存、種苗繁育、雜交育種等提供了一定的理論依據(jù)。