甘肅省玉米鐮孢莖腐病病原 鑒定及其生物學(xué)特性

崔凌霄，楊成德，田有輝，張收霞，張 莉，薛 莉，任寶倉(cāng)

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅省農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究院，甘肅 武威 733000)

玉米(Zeamays)是全球主要的糧食作物之一，也是世界上產(chǎn)量較高的糧食作物之一[1]，同時(shí)，玉米具有投入少、產(chǎn)出高的特點(diǎn)，光合產(chǎn)物總量有50%～60%貯存于秸稈當(dāng)中，是理想的飼料和工業(yè)原料[2-3]。隨著我國(guó)農(nóng)業(yè)向種植業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)和加工業(yè)的三元結(jié)構(gòu)發(fā)展，特別是畜牧業(yè)的快速發(fā)展，玉米的重要地位將更加突出，并且飼用玉米的比例將不斷上升。20世紀(jì)90年代后，全世界飼用玉米占玉米總產(chǎn)量的70%以上[4]，因其蛋白含量高、產(chǎn)量高和適口性好等特點(diǎn)，已成為畜牧業(yè)的支柱作物。飼用玉米的種植緩解了天然草地的壓力，解決了長(zhǎng)期以來(lái)的草畜矛盾，未來(lái)會(huì)是我國(guó)重要的栽培飼草之一。由于農(nóng)業(yè)發(fā)展對(duì)飼用玉米的強(qiáng)烈需求、大面積推廣種植和重茬等原因，導(dǎo)致普通糧用玉米上發(fā)生的土傳病害在飼用玉米上也嚴(yán)重發(fā)生，尤其是莖腐病(又稱玉米莖基腐病)。自20世紀(jì)初，玉米莖腐病初次報(bào)道以來(lái)，該病已成為世界上玉米種植區(qū)普遍發(fā)生的一種重要土傳病害[5]，美國(guó)、加拿大、印度和南斯拉夫等國(guó)家發(fā)生較重[6]。70年代中期至今，該病先后在我國(guó)廣西、浙江、湖南、陜西、河北、山東、遼寧等省區(qū)發(fā)生，一般年份發(fā)病率10%～20%，遇到多雨年份，發(fā)病嚴(yán)重，發(fā)病率可達(dá)80%以上，減產(chǎn)25%，嚴(yán)重者甚至絕收[7-10]，該病在飼用玉米上的嚴(yán)重發(fā)生制約了我國(guó)畜牧業(yè)的發(fā)展。目前該病害仍呈擴(kuò)展趨勢(shì)，危害逐年加劇，并已成為玉米生產(chǎn)上亟待研究解決的重要問(wèn)題。玉米作為甘肅省主要的糧飼兼用作物被大面積種植，據(jù)調(diào)查顯示，玉米莖腐病已在張掖、武威及蘭州等地發(fā)生，致使玉米葉鞘及莖稈腐爛、枯死，植株倒伏，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致整株死亡，對(duì)玉米的產(chǎn)量和飼用品質(zhì)均有嚴(yán)重影響。玉米莖腐病由多種病原菌單獨(dú)或復(fù)合侵染引起，主要病原為腐霉菌和鐮刀菌。在多雨地區(qū)，玉米莖腐病一般以腐霉菌型莖基腐為主，而在干旱地區(qū)以鐮刀菌型莖基腐為主[11]；其中鐮孢屬主要以禾谷鐮孢菌(Fusariumgraminearum)、層出鐮孢菌(F.proliferatum)和輪枝鐮孢菌(F.verticillioides)為主[12]，以藤倉(cāng)鐮孢菌(F.fujikuroi)引起的玉米莖腐病未見系統(tǒng)報(bào)道。本研究首次分離鑒定得到了引起玉米莖腐病的病原——藤倉(cāng)鐮孢霉菌，并對(duì)其進(jìn)行了病害癥狀描述和生物學(xué)特性測(cè)定，以期為該病害的診斷和綜合防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料采自甘肅省張掖市臨澤縣玉米田。供試培養(yǎng)基為PDA通用培養(yǎng)基和孟加拉紅選擇培養(yǎng)基[13]。

1.2 方法

1.2.1田間癥狀 對(duì)大田自然條件下玉米莖腐病的癥狀進(jìn)行觀察和描述。

1.2.2病原菌的分離與致病性測(cè)定 采用常規(guī)組織分離方法在PDA培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基上進(jìn)行分離培養(yǎng)。選取癥狀典型的新鮮標(biāo)本，從病斑、病健交界處用刀片切取約0.5 cm2的病組織塊，在70%乙醇內(nèi)消毒約10 s，然后在0.1%的升汞水溶液中消毒2 min，再用無(wú)菌水清洗5次后置于平板上培養(yǎng)，對(duì)分離物進(jìn)行單孢分離純化和保存?zhèn)溆肹9]。

玉米幼苗3-4葉齡用針刺致傷幼苗莖稈，將分離物制成孢子(菌絲)懸浮液于致傷處噴霧接種，以噴清水為對(duì)照，在相對(duì)濕度100%條件下保濕48 h后，置于室內(nèi)常規(guī)條件下連續(xù)觀察玉米植株發(fā)病情況，按照柯赫氏法則[9]確定病原菌。

1.2.3病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定 將菌株接于PSA培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)待產(chǎn)孢后，在顯微鏡下觀察分生孢子和分生孢子梗的形態(tài)特征；在40倍鏡下分別測(cè)定大、小分生孢子，厚垣孢子大小(50個(gè))，并進(jìn)行顯微拍照。根據(jù)病原菌形態(tài)特征，參照文獻(xiàn)[14]和[15]進(jìn)行鑒定。

1.2.4ITS基因序列分析鑒定 DNA的提取、PCR擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建參考文獻(xiàn)[16]進(jìn)行。

1.2.5生物學(xué)特性測(cè)定 將菌株分別置于不同溫度、pH、碳源、氮源和濕度條件下培養(yǎng)，并測(cè)定各條件對(duì)菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)的影響，具體方法參考文獻(xiàn)[10]進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Mega 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；采用SPSS 19.0軟件對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤表示測(cè)定結(jié)果，分別對(duì)不同條件下菌絲生長(zhǎng)結(jié)果、不同條件下孢子萌發(fā)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan法對(duì)各測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較；采用Excel 2010制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間癥狀

在田間，玉米莖腐病主要發(fā)生于6-8月，即一般為灌漿期和乳熟期達(dá)發(fā)病高峰，受害玉米植株莖部葉鞘表皮呈圓形、近圓形或不規(guī)則形病斑，邊緣深褐色或黑褐色，中央灰白色，后期病斑部位漸溢縮變硬，病部莖稈空松，內(nèi)部腐爛，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)病斑繞莖桿一圈；濕度大時(shí)可見白色或粉色霉層，濕度小時(shí)失水枯縮，且葉片變黃，萎蔫，致植株早衰(圖1)。

圖1 玉米莖腐病癥狀Fig.1 Symptoms of maize stalk rot

2.2 病原菌的分離純化及致病性測(cè)定

從受害5株玉米植株病部通過(guò)組織分離獲得3株真菌分離物，編號(hào)分別為Y1、Y2和Y3，單孢分離純化后保存?zhèn)溆谩?/p>

將分離物制成孢子懸浮液，用致傷噴霧法接種于室內(nèi)盆栽的玉米植株上(以清水噴霧為對(duì)照)，保持100%相對(duì)濕度，48 h后置于室內(nèi)常溫條件下連續(xù)觀察，2周后接種Y1的玉米植株葉鞘及莖稈部位出現(xiàn)灰褐色或褐色不規(guī)則病斑，葉片發(fā)黃，與田間典型癥狀一致(圖2)，在發(fā)病部位再次分離得到接種菌；對(duì)照和Y2、Y3處理沒有形成任何癥狀。根據(jù)柯赫氏法則，確定Y1為引起玉米莖腐病的病原菌。

2.3 病原菌的鑒定

2.3.1培養(yǎng)性狀及形態(tài)特征 菌株Y1在PDA培養(yǎng)基上菌落致密，灰白色(圖3)；菌絲有隔，有分枝。大型分生孢子呈鐮刀形，多細(xì)胞無(wú)色，3～5隔，大小為4.54～11.74 μm×1.96～4.27 μm；小型分生孢子數(shù)量多，卵圓形或橢圓形，單胞無(wú)色，大小為1.25～5.50 μm×1.25～3.75 μm。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，參考文獻(xiàn)[11]、[12]初步鑒定該病原菌為鐮孢霉屬真菌(圖3)。

2.3.2病原菌ITS基因序列分析 提取病原菌Y1的基因組DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增和測(cè)序，該序列全長(zhǎng)553 bp，所測(cè)序列與GenBank中的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行Blast相似性分析，經(jīng)同源性比較，該病原菌與鐮刀菌屬藤倉(cāng)鐮孢霉菌的同源性達(dá)99%(圖4)。通過(guò)Clustal X1.83程序多重序列比對(duì)，用Mega7.0軟件采用鄰接法(neighbor-joining)建立ITS基因的系統(tǒng)發(fā)育樹，病原菌ITS基因序列與藤倉(cāng)鐮孢霉菌(KJ000440.1)在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚在一起，結(jié)合形態(tài)特征，鑒定病原菌Y1為藤倉(cāng)鐮孢霉菌。

2.4 生物學(xué)特性測(cè)定

2.4.1溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 病原菌Y1在5～40℃內(nèi)均可生長(zhǎng)，5～25 ℃時(shí)生長(zhǎng)速度快，25 ℃時(shí)達(dá)最大，且菌落平均直徑達(dá)6.40 cm，25和30 ℃間差異不顯著(P>0.05)，高于30 ℃后生長(zhǎng)速度較25和30 ℃顯著降低(P<0.05)，低于5 ℃和高于40 ℃菌落不生長(zhǎng)。綜上，該病原菌的最適生長(zhǎng)溫度為25～30 ℃(圖5)。

圖2 致病性測(cè)定Fig. 2 Pathogenicity test

圖3 菌株Y1形態(tài)特征Fig. 3 Morphological characteristics of strain Y1

圖4 菌株Y1系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 Phylogenetic tree of strainY1

2.4.2溫度對(duì)孢子萌發(fā)的影響 病原菌Y1的孢子在5～40 ℃范圍內(nèi)均可萌發(fā)，5～25 ℃時(shí)孢子萌發(fā)率顯著增長(zhǎng)，25 ℃時(shí)孢子萌發(fā)率達(dá)到70%以上，顯著高于其他溫度處理(P<0.05)(圖6)。25～40 ℃孢子萌發(fā)率較20和25 ℃顯著降低(P<0.05)。因此，該病原菌的孢子最適萌發(fā)溫度為25 ℃。

2.4.3pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 病原菌Y1在pH為4～10內(nèi)均生長(zhǎng)，在pH為8時(shí)菌落直徑顯著大于其他pH(P<0.05)，且菌落平均直徑達(dá)6.65cm(圖7)。因此，該菌在中性偏堿的環(huán)境下生長(zhǎng)良好，最適生長(zhǎng)pH為8。

圖5 溫度對(duì)菌株Y1菌絲生長(zhǎng)的影響Fig. 5 Effect of temperature on hyphae growth of strain Y1

不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)。下同。

Different lowercase letters show significant differences at the 0.05 level; similarly for the following figures.

圖6 溫度對(duì)菌株Y1孢子萌發(fā)的影響Fig. 6 Effect of temperature on spore germination of strain Y1

圖7 pH 值對(duì)菌株Y1菌絲生長(zhǎng)的影響Fig. 7 Effect of pH on hyphae growth of strain Y1

2.4.4碳源對(duì)菌絲及孢子萌發(fā)的影響 從培養(yǎng)特性看，供試10種碳源及對(duì)照所培養(yǎng)病原菌Y1菌落均為淡粉色，在D-果糖、D-半乳糖、D-木糖、阿拉伯糖培養(yǎng)基上菌絲稠密，菌落生長(zhǎng)速度快，是該菌菌絲生長(zhǎng)的良好碳源，且顯著高于其他供試碳源(P<0.05)；但在L-山梨糖、蔗糖培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)速度較差，第4 天時(shí)菌落直徑分別僅為4.46和5.42 cm，顯著低于對(duì)照(P<0.05)，但均可以生長(zhǎng)，表明該病菌可以利用單糖、雙糖和多糖等多種碳源(圖8)。

在9種碳源中，病原菌Y1的孢子均能萌發(fā)，其中L-山梨糖萌發(fā)率最高，顯著高于其他碳源(P<0.05)，其次為阿拉伯糖和D-木糖，在葡萄糖中的萌發(fā)率最低(圖9)。

2.4.5氮源對(duì)菌落及孢子萌發(fā)的影響 從培養(yǎng)特性看，病原菌Y1在胰蛋白胨培養(yǎng)基上菌絲淡紅褐色，菌絲層較緊密呈絮狀；碳酸銨培養(yǎng)基上菌絲灰色或土褐色，菌絲呈索狀；其他氮源培養(yǎng)基菌絲稀疏，無(wú)色或皿底略顯淡褐色；在以氯化銨和硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)速度顯著高于其他氮源(P<0.5)，且4 d后菌落直徑達(dá)7.53和7.46 cm，表明氯化銨和硫酸銨有利于菌絲生長(zhǎng)；其他(除干酪素)氮源培養(yǎng)基菌落直徑均小于對(duì)照，表明該菌株對(duì)其利用能力差，尤其以碳酸銨效果最差(圖10)。

圖8 碳源對(duì)菌株Y1菌落生長(zhǎng)的影響Fig. 8 Effect of C-source on hyphae growth of strain Y1

圖9 碳源對(duì)菌株Y1孢子萌發(fā)的影響Fig. 9 Effect of C-source on spore germination of strain Y1

病原菌Y1的孢子能在不同的氮源中萌發(fā)，但在干酪素中的萌發(fā)率較高，顯著高于其他氮源(P<0.05)，在牛肉膏和蛋白胨中的萌發(fā)效果較差(圖11)。

2.4.6濕度對(duì)孢子萌發(fā)的影響 病原菌Y1的孢子只有在相對(duì)濕度大于90%時(shí)才能萌發(fā)，在相對(duì)濕度達(dá)到100%時(shí)萌發(fā)效率最好，顯著高于其他濕度(P<0.05)(圖12)。

圖10 氮源對(duì)菌株Y1菌絲生長(zhǎng)的影響Fig. 10 Effect of N-source on hyphae growth of strain Y1

圖11 氮源對(duì)菌株Y1孢子萌發(fā)的影響Fig. 11 Effect of N-source on spore germination of strain Y1

圖12 濕度對(duì)菌株Y1孢子萌發(fā)的影響Fig. 12 Effect of humidity on spore germination of strain Y1

3 討論與結(jié)論

玉米莖腐病是世界玉米產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生的一種土傳病害，其病原存在多樣性，各地區(qū)報(bào)道的病原種類也各不相同。據(jù)報(bào)道，該病主要由腐霉菌和鐮刀菌單獨(dú)或復(fù)合侵染造成玉米根系和莖基腐爛[17]。美國(guó)玉米莖腐病主要致病菌以亞月牙鐮刀菌(F.subglutinas)、禾谷鐮刀菌(F.graminearum)和玉米干腐菌(Diplodiamaydis)為主[18]。俄羅斯、烏克蘭主要以禾谷鐮刀菌為主。西歐國(guó)家多以玉米穗粒干腐菌(F.zeae)和串珠鐮刀菌(F.moniliforme)為主。禾生腐霉菌(Pythiumgraminicola)和瓜果腐霉(P.aphanidermatum)是日本玉米莖腐病的主要致病菌。據(jù)晉齊鳴等[19-21]、吳全安等[22]的研究與報(bào)道，在大田自然條件下，瓜果腐霉(P.aphanidermatum)、禾谷鐮刀菌、禾生腐霉菌和鏈狀腐霉菌(P.catemulatum)對(duì)玉米植株均有致病性，引起玉米莖腐病，且致病性強(qiáng)弱各有不同，田間癥狀多呈青枯、黃化和青黃枯。但本研究所得藤倉(cāng)鐮孢霉菌病原菌所引起玉米的癥狀與上述幾種病原菌略有不同，與玉米鞘腐病(F.proliferatum)主要危害玉米葉鞘中下部位，形成不規(guī)則褐色糜爛狀病斑[23]和糧用玉米莖腐病導(dǎo)致葉鞘和莖稈髓部出現(xiàn)腐爛, 葉鞘內(nèi)側(cè)和緊靠莖稈皮層呈鐵銹色腐爛等癥狀[24]也存在差異。藤倉(cāng)鐮孢霉菌主要引起玉米莖稈變枯、變褐及腐爛，該癥狀可能由于寄主品種不同，或者病原菌菌株差異等引起。本研究對(duì)田間采集的、具有典型玉米莖腐病癥狀的玉米標(biāo)本，進(jìn)行了分離培養(yǎng)和致病性測(cè)定，得到致病菌Y1，結(jié)合其形態(tài)特征和ITS基因序列分析結(jié)果，將其鑒定為鐮孢霉屬藤倉(cāng)鐮孢霉菌，即藤倉(cāng)鐮孢霉菌可引起甘肅玉米發(fā)生莖腐病，該菌引起玉米莖腐病為首次報(bào)道。

甘肅玉米莖腐病多集中發(fā)生于6-8月，平均氣溫為24.2 ℃[25]，本研究中病原菌菌絲生長(zhǎng)最適溫度為25～30 ℃，即玉米莖腐病發(fā)病的環(huán)境溫度與本研究溫度對(duì)該菌菌絲及孢子萌發(fā)的影響趨勢(shì)相一致。該病菌在pH為4～10均能生長(zhǎng)，最適pH為8，說(shuō)明該菌較適宜在偏堿土壤中生長(zhǎng)，最適pH與張志博等[26]報(bào)道的該菌最適生長(zhǎng)pH相吻合。因此，可選擇略偏酸土壤種植，施肥改善土壤酸堿性，減少病害發(fā)生。由該病原菌最適生長(zhǎng)的溫度范圍和pH得知，該菌是一種具有較強(qiáng)適應(yīng)性、耐熱性的強(qiáng)抗逆性致病菌。

本研究結(jié)果表明，不同碳、氮源營(yíng)養(yǎng)條件對(duì)藤倉(cāng)鐮刀菌菌落生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)也有不同的影響，且此病菌能利用多種碳源，在本研究所用的9種碳源中，病菌對(duì)D-半乳糖的利用效果最好，菌絲生長(zhǎng)最快，對(duì)L-山梨糖利用較差，菌絲生長(zhǎng)緩慢。該結(jié)果與張志博等[26]報(bào)道玉米莖腐病菌的最適碳源為葡萄糖存在差異，可能是由于病原菌種不同所致。該病菌孢子萌發(fā)的最適碳源為L(zhǎng)-山梨糖，與病原菌菌絲生長(zhǎng)截然相反，即適合菌絲生長(zhǎng)的物質(zhì)條件并不一定適合其孢子萌發(fā)。在多數(shù)無(wú)機(jī)氮、有機(jī)氮條件下生長(zhǎng)不良，尤以碳酸銨抑制作用顯著(P<0.05)。因此，在生產(chǎn)中可以適量使用碳酸銨等肥料發(fā)揮其對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制作用，有利于對(duì)病害的控制。該菌的孢子在相對(duì)濕度為100%時(shí)萌發(fā)效果最好，低于100%萌發(fā)率顯著降低，因此可通過(guò)控制田間的相對(duì)濕度，來(lái)減少玉米莖腐病害的發(fā)生。