異物創(chuàng)傷性動脈瘤犬模型構建的初步探討

文穎 楊秀軍 李婷婷 樂萱

人體軟組織異物損傷和存留較常見，其發(fā)病率隨工業(yè)化、城市化進程加快、工業(yè)機械化程度提高和全球不和諧因素的增加而呈明顯上升趨勢。其發(fā)病人群以青壯年為主，兒童軟組織異物損傷患病率并非少見[1-3]。其治療主要包括異物取出和并發(fā)癥處理（如抗感染、血管修補）等。目前，盡管異物取出仍以開放式外科手術或X線透視引導下開放式手術直接暴露并取出異物為主，但微創(chuàng)介入治療也越來越多地應用到異物臨床診療中了，方式主要有在X線透視或超聲實時成像定位、導向下經皮經軟組織直接異物摘除或聯(lián)合應用CT、透視引導下介入取出異物，異物完全取出率達95%、介入治療失敗發(fā)生率僅約0.2%[2-3]，采用經皮經軟組織結合經皮經腔雙介入技術更能安全、有效地取出緊鄰重要血管甚或伴非致命性血管損傷的復雜異物[4-5]。

然而，血管外異物伴毗鄰大血管損傷如假性動脈瘤（尤其異物部分甚至全部位于假性動脈瘤壁上）、動靜脈瘺、異物貫穿血管等，因介入取出異物同時無法有效止血及血管修復，至今仍是微創(chuàng)介入治療的主要技術禁忌[2-5]。隨著血管介入技術的日益進步和介入材料的不斷革新，建立組織學、血流動力學、病理結構與人體異物創(chuàng)傷性血管疾病相似的動物模型，并基于疾病動物模型探索新的介入療法，攻克或伴血管損傷軟組織異物微創(chuàng)治療及技術，全面突破軟組織異物介入治療禁區(qū)與瓶頸，顯得尤為迫切。為此，本研究擬通過頸靜脈局部離斷、剖開、縫合于同側頸動脈前壁上并以斷針穿破靜、動脈壁且斷針部分留置其間的技術與方法，構建異物創(chuàng)傷性動脈瘤模型，為進一步研究、理解異物創(chuàng)傷性動脈瘤的發(fā)生機制、治療、預后，探討經皮經軟組織介入鉗取異物的可行性提供異物血管損傷動物模型和研究基礎。

材料與方法

一、實驗動物

選取約2年齡的清潔級健康雄性比格犬 [供應單位：上海交通大學農學院教學實驗實習場，生產許可證編號：SCXK（滬）2017-0007]7只，體質量14～16 kg，隨機分為動脈瘤造模5只和未造模2只，造模于犬右側頸動脈共5支血管為研究組，其左側5支頸動脈及未造模2只犬的兩側頸動脈共9支血管為對照組。在上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院動物室使用、飼養(yǎng)、觀察[實驗動物使用許可證SYXK（滬）2016-0020]。

二、動物模型的建立

比格犬術前禁食12 h，靜脈全身麻醉（3%～5%戊巴比妥鈉，30～40 mg/kg靜脈給藥），予以氣管插管并連接氧氣管，開放靜脈通路，全程無創(chuàng)心電監(jiān)護。實驗步驟包括：①取仰臥位，頸部及腹股溝區(qū)去毛、備皮；②頸部常規(guī)絡合碘消毒、鋪單，觸及右側頸動脈搏動及行程，于其右旁縱行切開皮膚（長約6 cm）及皮下組織，暴露、游離局部右側頸靜脈，選中間無屬支的長約1.5～2 cm的靜脈段，以2-0手術縫線結扎并離斷其兩端，將該靜脈段剪開、修圓整成靜脈片并置于肝素生理鹽水器皿中備用；③繼續(xù)鈍性分離頸部皮下組織及肌肉，小心暴露、線段標記局部頸動脈（長約2 cm）；④應用血管連續(xù)縫合法，以6-0手術縫線及配套彎針（聚丙烯不可吸收縫合線，普理靈，Ethicon LLC），將離體靜脈片完整地縫合、移植于同側頸總動脈或頸內動脈局部前壁上（圖1），并用血管夾臨時阻斷兩端血流；⑤以2 ml注射器在縫合后靜脈片與頸動脈前壁之間的腔隙注射肝素鹽水（禁用對比劑，以避免影響后續(xù)腦血管造影結果尤其對比劑殘留形成動脈瘤假象）約2 ml，充盈該間腔形成"瘤體"，觀察動脈瘤膨隆及有無滲漏并適當處置，同時預防血栓形成與粘連；⑥再以尖段被"老虎鉗"咬斷的彎型縫針同時直接穿破靜脈片和動脈前壁（斷針前端在頸動脈前壁上，盡可能多地上下、左右適度穿戳、"搗鼓"幾次，以加大對動脈壁的破壞力，擴大動脈前壁的破口），靜脈片因動脈出血血流充盈而膨隆、漲大并見與頸動脈一致的搏動（動脈瘤造模成功的重要標志），斷針前段留在瘤腔及動脈腔內（圖2）；⑦逐層縫合頸部切開的組織，觀察、防止出血；⑧右側腹股溝區(qū)（1例右側穿刺失敗改左側）消毒、鋪單，經皮股動脈穿刺并置入5F血管鞘（日本泰爾茂株式會社），經血管鞘置入5F獵人頭導管（美國COOK公司），超選擇性右側頸動脈造影包括旋轉采集3D-DSA，證實動脈瘤、斷針異物且動脈瘤制作處無明顯對比劑外溢征象（圖3），拔出導管及血管鞘，局部壓迫止血。所有造影器材尤其導管、導絲、導管鞘使用前肝素化處理（浸泡于1 000 ml的混入12 500 U肝素鈉生理鹽水液體中，并用肝素鹽水沖洗管內腔），造影后經導管推注肝素鹽水5 ml；⑨實驗犬回上海市六醫(yī)院動物房復蘇、觀察，術后每日常規(guī)給予阿司匹林25 mg進行抗凝處理。對照組僅以持針器夾持針尖斷離之彎型縫針，經皮膚深刺、扎傷頸動脈旁軟組織，并且觀察無明顯出血及血腫，斷針隨即拔出。

圖1 將長約15 mm離斷并縱行切開的頸靜脈片完整地縫合于同側頸總動脈前壁上

圖2 用尖段咬斷的彎型縫針同時穿破靜脈片和動脈前壁（斷針前端需多次"搗鼓"以擴大動脈前壁破口），靜脈片因血流充盈而膨隆、漲大，并可見與頸動脈一致的搏動——動脈瘤造模成功重要標志，斷針前段留在瘤腔及動脈腔內

圖3 右側頸總動脈DSA，動脈瘤（右箭頭）呈囊狀突起影像改變，斷針（下箭頭）部分留置于瘤體及動脈腔內，載瘤動脈可見局部血管輕度痙攣與狹窄

三、影像學檢查與評估

于造模前、后對實驗犬行頸部X線攝影及CTA檢查，術中行DSA檢查。

X線攝影應用包括GMM平板DR拍片和東芝Infinix-i INFX-8000V單C臂機透視與點片。

CTA檢查主要應用Siemens Force雙源CT機、GE LightSpeed VCT或 Toshiba Aquilion 64 CT，掃描參數(shù)：管電壓 70～100 kV，管電流 180～210 mA，螺旋掃描層厚2.5 mm，重建層厚0.5 mm或0.625 mm，常規(guī)軟組織算法加骨算法重建；對比劑為350或370 gI/L濃度的碘佛醇（Liebel-Flarsheim Canada Inc）或碘海醇注射液[先靈（廣州）藥業(yè)有限公司]，使用劑量為2 ml/kg體質量，注射速率為2.5～3.0 ml/s，采用自動高壓注射器（Accutron HP 832 Injector，德國MEDTRON或Optivantage高壓注射器，美國Mallinckrodt）經左前肢靜脈快速團注，選擇主動脈弓ROI閾值（120 HU）自動觸發(fā)掃描，掃描范圍包括主動脈弓和頸部動脈入顱處，首次掃描完成后重復上述掃描一次，源影像數(shù)據(jù)主要傳輸至GE AW 4.6影像工作站，進行冠狀位、矢狀位多平面重建（multiplanar reformation，MPR）及3D最大密度投影（maximum intensity projection，MIP）和（或）容積重建技術（volume rendering，VR）等圖像后處理。

DSA應用東芝Infinix-i INFX-8000V單C臂X線血管造影系統(tǒng)，5F獵人頭導管選擇性插入頸總動脈后，采用320 gI/L濃度碘帕醇注射液（上海博萊科信誼藥業(yè)有限責任公司）以4 ml/s速率、總量7 ml作3幀/s普通DSA采集，旋轉采集3D DSA以50°/s的角速度進行旋轉，旋轉范圍 206°（+103°～-103°），旋轉時間4 s，應用MIP和VR等方法進行3D圖像重建，以顯示并證實動脈瘤及瘤內針狀異物和瘤周有無對比劑外溢等。

結 果

研究組5支右側頸動脈斷針創(chuàng)傷性動脈瘤均成功造模，平均手術操作時間約1 h，技術成功率100%，無動物意外及死亡發(fā)生。異物創(chuàng)傷性動脈瘤造模成功主要表現(xiàn)為：①用尖段咬斷的彎型縫針同時穿破靜脈片和動脈前壁后，肉眼可見靜脈片整體膨隆、漲大并與頸動脈同步搏動，斷針前段留在瘤腔及動脈腔內，動脈瘤周緣無滲漏（圖2）；②頸動脈DSA發(fā)現(xiàn)局部頸動脈囊狀突起，針狀異物部分留置于瘤體及動脈腔內，且對比劑未見明顯外溢征象（圖 3）。

DSA清晰顯示了頸動脈局部破口、經破口凸向動脈腔外的動脈瘤樣局部隆起及其間斷針異物（圖3），動脈瘤樣突起即創(chuàng)傷性動脈瘤模型的瘤頸寬度為（2.1±1.3）mm，瘤體寬（9.7±1.1）mm，瘤體高（4.2±1.7）mm，所有載瘤動脈均見輕度局部痙攣及狹窄改變。CTA對動脈瘤的顯示效果不如DSA佳，瘤體較DSA小；但可任意角度旋轉重建顯示動脈瘤、載瘤動脈及異物之間的關系（圖4），載瘤動脈局部輕度狹窄顯示較好。1例術后2周復查CTA，發(fā)現(xiàn)瘤口（動脈破口）已閉，僅發(fā)現(xiàn)異物（圖5），未見明確動脈瘤征象，血管狹窄狀況改善和好轉。術前數(shù)字化直接成像系統(tǒng)（DR）主要篩查頸部不透X線異物，本組均未發(fā)現(xiàn)異物存在（圖6）；術后DR主要用以發(fā)現(xiàn)頸部不透X線異物，本組均發(fā)現(xiàn)手術縫針狀異物存在（圖7），血管改變及動脈瘤無法顯示。對照組頸動脈影像學未見明顯異常改變。

討 論

一、動脈瘤動物模型的制作方法及注意事項

各種類型動脈瘤模型研究文獻很多，但至今尚未見到異物創(chuàng)傷性動脈瘤尤其創(chuàng)傷性動脈瘤合并瘤壁穿透性異物的動物模型研究報告，在一定程度上影響了或伴血管損傷軟組織異物微創(chuàng)介入治療的創(chuàng)新研究與技術突破。

圖4 術后1 h內CT血管成像顯示頸動脈局限性突起凸向血管腔外及針狀異物（箭頭），局部輕度血管狹窄

圖5 術后2周復查CT血管成像僅示針狀異物，未見明顯動脈瘤影像，血管狹窄明顯改善

在各種各樣動脈瘤模型制作方法中，靜脈移植法最為常用，其多采用顯微外科技術將靜脈袋端-側吻合移植至動脈不同位置，以構建側壁型、分叉型和末梢型等不同類型動脈瘤的兔、犬、豬等動物模型[7-8]，該方法主要不足在于外科操作造成的血管內皮損傷、炎性反應及瘢痕形成，且靜脈袋縫合形成的動脈瘤壁的內彈力層、中膜完整，與自然狀態(tài)下形成的動脈瘤組織結構差別較大，故而其主要用于動脈瘤血流動力學和栓塞治療材料研究等。動脈移植法次之，其常將動脈袋尤其經彈性蛋白酶處理后的動脈端-側縫合到動脈上，以形成側壁型動脈瘤。再有其主要通過物理破壞法和酶解法建立動脈瘤模型[9-10]，前者采用CO2激光切開術破壞動脈壁、成功建立動脈瘤模型，或通過使用氮芥、氰基丙烯酸酯注射到動脈壁中建模但未獲成功；后者主要利用彈性蛋白酶破壞血管壁的內彈力層，模擬人類腦動脈瘤內彈力層和中膜缺如這一重要的病理生理學特征而誘發(fā)動脈瘤豬、兔等動物模型。這種動脈瘤模型更接近動脈瘤組織病理和血流動力學改變，為大多數(shù)學者所接受的動脈瘤發(fā)生、發(fā)展和破裂機制及栓塞材料治療效果研究模型。同時，也有研究者采用動、靜脈聯(lián)合移植法成功制作了高流量靜脈袋巨大動脈瘤兔模型[11]，也有采用改變血流動力學、升高血壓等病因誘導法構建動脈瘤小鼠[12]、大鼠模型[13]和球囊阻塞、擴張及血管內層結構損傷等血管介入法制作動脈瘤兔模型等的報道[14]。動脈瘤造模所用動物包括鼠、兔、犬、豬、猴等，這些動物的椎-基動脈系統(tǒng)發(fā)達，不易在頸動脈制作動脈瘤的過程中因前循環(huán)臨時阻斷或術后動脈出現(xiàn)狹窄甚至閉塞而發(fā)生缺血性腦梗死。其中，猴、猩猩等靈長動物是制作人類腦動脈瘤模型最理想的材料，但其來源少、價格昂貴、不易管理，難以廣泛應用于實驗研究。大鼠的優(yōu)勢在于其繁殖快、價格低，頸動脈容易暴露且動脈搏動快、不易形成血栓，也不易因機械刺激而發(fā)生血管痙攣，適合動脈瘤發(fā)病機制及血流動力學研究。兔的優(yōu)勢在于非靈長類動物中其血栓形成和纖溶系統(tǒng)與人類最為接近，且頸總動脈與人類大腦中動脈始段幾乎等粗，約有25%的動脈瘤實驗采用兔制作模型，但兔的手術耐受能力較差，麻醉意外和死亡率較高。犬由于訓練、麻醉、手術耐受性好，意外死亡率和術后并發(fā)癥發(fā)生率低，其動脈直徑和血流動力學特征與人類的非常接近，便于導管置入和血管內操作，凝血和纖溶系統(tǒng)活躍，因此動脈瘤犬模型占比高達33.1%[7]，不僅適用于血管內治療研究，而且還適合用于療效長期觀察研究。本項目及前期研究均發(fā)現(xiàn)，選用的實驗動物犬暴露其頸動、靜脈方便，頸部及股部血管粗細合適，經皮股動脈穿刺置管及血管介入操作方便[15-16]，即使右側穿刺失敗改為左側穿刺股動脈插管也容易操作成功。

圖6 術前平片顯示頸部未見異物影

圖7 術后平片顯示頸部氣管右旁軟組織內針狀異物影（箭頭）

同時，不同于既往將頸靜脈囊端-側吻合于臨時阻斷血流并切開小口的頸動脈側壁上的動脈瘤建模方法，本研究采用非阻斷血流條件下將離體頸靜脈片“補丁”樣吻合于頸動脈前壁上，頸動脈尤其內膜幾乎無損傷，也無需顯微外科技術支撐，然后模擬真實異物損傷血管情景，以斷針直接穿破血管壁，從而造成頸動脈血流流入靜脈片與動脈前壁間的人造間腔，形成異物創(chuàng)傷性動脈瘤。本方法制作的動脈瘤的瘤口較小，瘤體內血液流動性不佳，血流速度較慢，容易出現(xiàn)血液滯留和血栓形成等情況（為此，術中常規(guī)以2 ml小注射器先行注射肝素鹽水，在預防血栓形成的同時觀察有無縫緣滲漏），導致動脈瘤模型穩(wěn)定性欠佳（1例建模2周后復查CTA發(fā)現(xiàn)，動脈瘤瘤口近乎閉塞、瘤體顯示不佳，盡管造模后一直采用低分子肝素抗凝），但非常適合本研究的需緊急處置的異物及其創(chuàng)傷性動脈瘤研究，應用在其他研究目的的動脈瘤模型構建上或許不是非常適合。當然，該動脈瘤模型仍有一些可以進一步改良的地方，如以動脈瘤夾兩端暫時阻斷血流后，頸動脈前壁先行剪開一小缺口，再補丁樣側-側吻合，并刺入斷針且斷針部分留置于瘤腔，如此建模的異物創(chuàng)傷性動脈瘤瘤內血液流動性好、模型穩(wěn)定性改善；也可采用靜脈袋側-動脈端吻合[17]尤其靜脈袋端-側吻合于2支動脈缺口上[11]，再刺入斷針且斷針部分留置于瘤腔、血管腔內，以形成動脈瘤內高流量，建立更適合長期觀察的異物損傷性動脈瘤模型。必須一提的是，血管縫合是建模過程中最重要且最具難度的步驟之一，合適間隔的血管連續(xù)縫合法能夠有效防止縫緣滲漏，縫合操作時輕拉慢提也可有效預防所用6-0縫合線對血管壁產生的銳性切割損傷。標記頸動脈宜用粗線如2-0縫合線，提拉血管也需輕柔，謹防動脈痙攣和損傷。此外，縫針斷頭宜毛糙些，小心穿過靜脈片后應粗暴些穿破動脈壁，并適當上下、左右拉扯、旋轉穿戳以擴大創(chuàng)口，增大流入間腔血流速度，充分充盈瘤體，減少血栓形成。而且，術后抗凝治療非常重要，抗凝藥物常用低分子肝素，其能阻斷凝血酶原向凝血酶轉變，抑制凝血活酶形成與作用，從而促進凝血過程延長，以預防瘤內血栓形成及其造成的動脈瘤模型構建（部分）失敗。

二、動脈瘤模型的影像學評估

無論術中或術后，經皮經腔股動脈入路的選擇性插管至載瘤動脈行DSA檢查，無疑是評估異物創(chuàng)傷性動脈瘤模型的最好方法，而且還可實施旋轉采集、實現(xiàn)3D DSA全方位及多種形式的后處理，以顯示瘤體、瘤頸及其與載瘤動脈和異物的關系等，準確測量瘤頸寬度、瘤體寬度、高度及載瘤動脈近、遠端內徑等，尤其建模后即刻術中DSA揭示的動脈瘤形態(tài)、結構、大小及其與載瘤動脈關系等最為真實、準確，也能發(fā)現(xiàn)血管損傷、血管痙攣等改變并及時行介入性血管內治療與干預。其中，3D-DSA具有更高的空間分辨率及靈敏度，能準確揭示直徑2 mm以內的常規(guī)DSA無法顯示的微小動脈瘤，不但清晰顯示動脈瘤位置、大小、數(shù)目、形態(tài)及血流動力學信息，還無需正、側、斜位多體位投照、多次造影即可有效避免血管之間尤其動脈瘤與載瘤動脈及其他血管之間的相互重疊遮蓋，同時精準顯示異物與動脈瘤、載瘤動脈的關系，尤其籍以評估異物拔出出血等風險程度等。但DSA屬有創(chuàng)性檢查[2]，技術要求高且操作繁瑣，也有一定風險，因此除非血管內介入治療需要，一般主張以無創(chuàng)性CTA檢查來進行診斷尤其動脈瘤建模術后評估。本研究結果顯示，CTA尤其多種3D重建圖像較好地顯示了動脈瘤、載瘤動脈及異物關系，同時清晰顯示了瘤內血栓形成及頸動脈狹窄改變。CTA顯示的動脈瘤體積較小，主要可能由于瘤內血栓形成、載瘤動脈及瘤頸口部狹窄所致。為此，閾值觸發(fā)自動CTA掃描后，延遲30 s左右再次復掃CTA，能夠提高動脈瘤、載瘤動脈的顯示及評估效果。MRI及增強MRA對動脈瘤及非磁性異物診斷的價值肯定[2，6，18]，但因 MRI可致磁性金屬異物遷移、金屬偽影等問題而屬其檢查禁忌[2-3]。本研究僅在異物取出及可降解覆膜支架置入封堵瘤口、異物損傷口后做了MRI及MRA檢查與評估。最近也有研究者發(fā)現(xiàn)，微CT及超高場MRI、MRA評價動脈瘤模型及其介入治療并發(fā)癥獲得良好效果[6]。超聲包括多普勒超聲對非金屬異物及其血管損傷的診斷、定位頗有價值[19]，但對金屬異物尤其深部異物的并發(fā)癥診斷作用有限[6]。X線平片包括DR主要用以發(fā)現(xiàn)不透X線異物，無法評估異物創(chuàng)傷性動脈瘤等并發(fā)癥。

總之，采用頸靜脈片補丁樣側-側吻合于同側頸動脈前壁上，并以斷針穿破靜、動脈壁且斷針部分留置于其間的方法，成功構建了犬的異物創(chuàng)傷性動脈瘤模型，且其基本類同人體異物創(chuàng)傷性動脈瘤發(fā)生過程及病理改變，為異物創(chuàng)傷性動脈瘤發(fā)病機制、血流動力學特點及新型治療手段等進一步研究提供了動物模型、也夯實了研究基礎。術中DSA證實建模成功非常重要，是模型研究不可或缺的重要步驟。術后CTA檢查，可進一步證實成功建模并評估動脈瘤、載瘤動脈、異物及其關系，為隨后可降解覆膜支架無縫合輔助雙介入異物取出等微創(chuàng)治療提供決策依據(jù)。