葡萄籽原花青素對中波紫外線誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

李桂雙 卜潔瓊 龍劍文

過度的日光照射所引起的皮膚疾患和皮膚老化在皮膚科門診中占據(jù)相當(dāng)?shù)谋壤齕1,2]。紫外線(UV)輻射所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷是引發(fā)皮膚光老化，光損傷的重要因素[3]，角質(zhì)形成細(xì)胞是構(gòu)成人表皮的主要細(xì)胞，而中波紫外線(UVB)主要作用于皮膚表皮，引起角質(zhì)形成細(xì)胞氧化損傷和細(xì)胞凋亡[4]。葡萄籽原花青素(Grape seed proanthocyanidin extract, GSPE)是從葡萄籽中提取的一類化合物，具有良好的清除自由基和抗氧化活性，以及廣泛的細(xì)胞保護(hù)作用[5]。葡萄籽原花青素作為一種營養(yǎng)補劑已被廣泛使用，目前證實其能有效清除機體內(nèi)自由基，改善運動代謝、提高耐缺氧能力，具有抗疲勞、提高運動能力的功能[6]。但葡萄籽原花青素對紫外線引起的人角質(zhì)形成細(xì)胞氧化損傷是否具有保護(hù)作用，目前還不清楚。因此，本文以HaCaT 細(xì)胞系為基礎(chǔ)，觀察了葡萄籽原花青素對UVB輻射誘導(dǎo)的人角質(zhì)形成細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 UVB輻照儀為德國Waldmann Medizintechnik公司生產(chǎn)，輻射波長為280～320 nm，工作強度為1.35 mW/cm2，采用TN2340紫外線強度檢測儀(臺灣泰納)測量核實。葡萄籽原花青素(純度≥95%)購自天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司。HaCaT細(xì)胞株購于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。0.25%胰酶、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國Gibco公司。CCK-8試劑盒購于日本同仁化學(xué)公司。Hoechst 33258為美國Sigma公司產(chǎn)品。Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒，乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。超氧化物歧化酶(SOD)活力測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力測試盒、丙二醛(MDA)測定試劑盒由南京建成生物工程研究所提供?；钚匝醮?ROS)探針DCFH-DA購于北京索萊寶科技有限公司；Rhodamine 123為美國Invitrogen 公司產(chǎn)品。Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3抗體、辣根酶標(biāo)記抗兔lgG抗體購于Cell signal technology公司。辣根酶標(biāo)記的β-actin抗體為上海興悠生物科技有限公司產(chǎn)品。ECL試劑盒為Amersham Biosciences公司產(chǎn)品。3111型細(xì)胞培養(yǎng)箱購于美國熱電公司；BD FACSCanto II型流式細(xì)胞儀購于美國BD FACScan 公司。

1.2 試劑配制與實驗分組 二甲基亞砜(DMSO)稀釋制備葡萄籽原花青素工作溶液，DSMO終體積分?jǐn)?shù)<0.1%，實驗分為5組：正常對照組，UVB組，葡萄籽原花青素低濃度組(UVB+50 μg/mL GSPE)，葡萄籽原花青素中濃度組(UVB+100 μg/mL GSPE)，葡萄籽原花青素高濃度組(UVB+200 μg/mL GSPE)。

1.3 實驗方法

1.3.1 各實驗組處理方法 各組紫外線照射劑量為30 mJ/cm2[7]。將生長至80%融合的HaCaT細(xì)胞傳代于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每組設(shè)立6個平行孔。葡萄籽原花青素各濃度組處理方法：UVB照射前，先將不同濃度的葡萄籽原花青素加入培養(yǎng)皿與對數(shù)生長期HaCaT細(xì)胞于培養(yǎng)箱中共同培養(yǎng)24 h，洗滌細(xì)胞，避光處打開平皿蓋，并予以UVB輻射，加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h，收集細(xì)胞或上清，檢測相關(guān)項目；UVB組：取對數(shù)生長期HaCaT細(xì)胞于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，洗滌細(xì)胞，避光打開平皿蓋，并予以UVB輻射，加入新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，收集細(xì)胞或上清，檢測相關(guān)項目；正常對照組：取對數(shù)生長期HaCaT細(xì)胞于培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)對照。實驗重復(fù)三次。

1.3.2 葡萄籽原花青素對HaCaT細(xì)胞增殖活力的影響 實驗分為空白對照組，試驗對照組(葡萄籽原花青素0 μg/mL劑量組)，試驗組(葡萄籽原花青素50 μg/mL劑量組、葡萄籽原花青素100 μg/mL劑量組、葡萄籽原花青素200 μg/mL劑量組、葡萄籽原花青素400 μg/mL劑量組、葡萄籽原花青素800 μg/mL劑量組)。將生長至80%融合的HaCaT細(xì)胞傳代于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每組設(shè)立6個平行孔，常規(guī)培養(yǎng)24 小時后，洗滌細(xì)胞，試驗對照組和各試驗組中加入CCK-8 10 μL，顯色后，以各孔450 nm 波長的吸光值(Absorbance，A)顯示細(xì)胞的存活數(shù)量。細(xì)胞的存活率(%)=[(A1-A3)/(A2-A3)]×100%。 A1～A3分別為試驗組、試驗對照組、空白對照組A值。實驗重復(fù)三次。

1.3.3 LDH、SOD、GSH-Px活性及MDA含量檢測 各組HaCaT細(xì)胞處理后，收集各組細(xì)胞或上清，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行相關(guān)操作，分光光度計測量光密度值，根據(jù)說明書公式，計算各組LDH、SOD、GSH-Px和 MDA的活力或含量。

1.3.4 細(xì)胞凋亡檢測 各組HaCaT細(xì)胞處理后，消化，洗滌，收集細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，冰浴避光中操作如下：采用結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，使其濃度為5×104/L，后加入Annexin-FITC和PI，共同孵育15 min染色，1 h內(nèi)，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡水平。實驗重復(fù)三次。

1.3.5 細(xì)胞凋亡形態(tài)的觀察 制備HaCaT細(xì)胞懸液，調(diào)整密度為109個/L，接種于6孔培養(yǎng)板中。進(jìn)行相關(guān)處理后，收集細(xì)胞并洗滌，4%多聚甲醛溶液固定后，PBS洗滌，Hoechst33258染色15 min。采用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并照相保存結(jié)果。實驗重復(fù)三次。

1.3.6 葡萄籽原花青素對HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS和線粒體膜電位水平的影響 各組HaCaT細(xì)胞處理后，消化，洗滌，收集細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液。葡萄籽原花青素對HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響：各組加入ROS探針DCFH-DA 10 μmol/L，共同孵育60 min，PBS洗滌3次，消化，重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測。將處理后細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察拍照。細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位水平的檢測：各組加入羅丹明123 1 mmol/L，共同培養(yǎng)30 min，重懸細(xì)胞，上機檢測線粒體膜電位變化并記錄。實驗重復(fù)三次。

1.3.7 Western blotting檢測蛋白表達(dá) 各組HaCaT細(xì)胞處理后，消化，洗滌，收集細(xì)胞，提取總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量檢測，上樣，采用SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，PBS洗膜，5%脫脂牛奶封閉l h；洗膜后加入一抗；4℃過夜；PBS洗膜；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育0.5 h；洗膜；增強化學(xué)發(fā)光試劑盒處理。結(jié)果用Quantity one圖像分析軟件光密度分析，用各目的蛋白灰度值與β肌動蛋白灰度值的比值代表各檢測蛋白的相對表達(dá)量。實驗重復(fù)三次。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度葡萄籽原花青素對HaCaT細(xì)胞增殖活力的影響 與正常對照組比較(98.04±1.28)%，50 μg/mL GSPE組、100 μg/mL GSPE組、200 μg/mL GSPE組HaCaT細(xì)胞增殖活力無明顯差異(存活率分別為(96.57±1.09)%、(96.54±1.46)%、(96.01±1.60)%，且四組組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.422，P=0.096)。而400 μg/mL GSPE組、800 μg/mL GSPE組，HaCaT細(xì)胞存活率分別為(91.00±3.65)%、(82.69±2.27)%，較正常對照組明顯降低(F=58.570,P=0.000)。因此，選定葡萄籽原花青素的工作濃度為50 μg/mL，100 μg/mL，200 μg/mL。

2.2 葡萄籽原花青素處理抑制了UVB輻射誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞凋亡 在工作濃度范圍內(nèi)，葡萄籽原花青素對由UVB誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞凋亡有明顯抑制作用。比較正常對照組，在UVB組中，HaCaT細(xì)胞凋亡率顯著增加(t=32.900,P=0.000)，說明UVB輻射能誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞凋亡。比較UVB組，在葡萄籽原花青素低濃度組、葡萄籽原花青素中濃度組、葡萄籽原花青素高濃度組中，HaCaT細(xì)胞凋亡率漸減少，且組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=105.067,P=0.000)(圖1a)。同時，Hoechst 33258染色后，熒光顯微鏡下觀察顯示，存活HaCaT細(xì)胞胞核為橢圓形，顯示為較暗的均一藍(lán)色；而凋亡HaCaT細(xì)胞染色質(zhì)凝聚，表現(xiàn)為亮藍(lán)色(圖1b)。圖中結(jié)果表明，與正常對照組比較，UVB輻射后，凋亡細(xì)胞顯著增加，而葡萄籽原花青素的處理抑制了UVB輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

注：1：正常對照組，2：葡萄籽原花青素高濃度組，3：葡萄籽原花青素中濃度組，4：葡萄籽原花青素低濃度組，5：UVB組。#：對比UVB組，P<0.01，*：P<0.01

圖1 葡萄籽原花青素抑制UVB輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(×400)

2.3 葡萄籽原花青素對UVB輻射條件下HaCaT細(xì)胞ROS水平的影響 DCFH-DA染色結(jié)果表明，與正常對照組比較(熒光強度為9.165±2.797)，UVB組ROS的熒光增強(熒光強度為93.39±6.051)。證實UVB輻射增強了HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS水平(t=30.948,P=0.000)。經(jīng)不同濃度葡萄籽原花青素處理后， HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS熒光強度明顯減弱(熒光強度為67.66±6.07、54.60±5.93、26.12±4.80)，提示葡萄籽原花青素處理能夠顯著抑制UVB輻射條件下ROS的生成(F=142.651,P=0.000)。

2.4 葡萄籽原花青素對UVB輻射條件下HaCaT細(xì)胞線粒體膜電位水平的影響 羅丹明123染色結(jié)果表明，與正常對照組比較(熒光強度為100.68±10.03)，UVB組 HaCaT細(xì)胞線粒體膜電位水平明顯降低(熒光強度為19.03±3.93)。證實UVB輻射降低了HaCaT細(xì)胞線粒體膜電位(t=18.561,P=0.000)。經(jīng)不同濃度葡萄籽原花青素處理后， HaCaT細(xì)胞線粒體膜電位熒光強度明顯增強(熒光強度為35.49±5.61、61.52±7.68、78.92±6.60)，與UVB組比較,組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=114.088,P=0.000)。

2.5 葡萄籽原花青素對UVB輻射條件下HaCaT細(xì)胞LDH，SOD，GSH-Px和MDA水平的影響 與正常對照組比較，UVB組中 HaCaT細(xì)胞中MDA水平，上清中LDH水平顯著增高(t=14.528,P=0.000;t=20.535,P=0.000)，同時SOD，GSH-Px水平顯著減少(t=18.829,P=0.000;t=11.394,P=0.000)。與UVB組比較，低，中，高劑量葡萄籽原花青素能夠明顯降低UVB輻射條件下HaCaT細(xì)胞中的MDA水平和上清中LDH水平(F=58.954,P=0.000;F=103.929,P=0.000)，且能夠提高細(xì)胞中的SOD，GSH-Px含量(F=81.320,P=0.000;F=18.113,P=0.000)。

2.6 葡萄籽原花青素對UVB輻射條件下HaCaT細(xì)胞Bcl-2，Bax和Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)的影響 比較正常對照組，UVB組HaCaT細(xì)胞的Bax和Cleaved-caspase3蛋白水平顯著增高(t=51.071,P=0.000;t=39.166,P=0.000)；比較UVB組，低，中，高劑量葡萄籽原花青素處理后，HaCaT細(xì)胞的Bax和Cleaved-caspase3蛋白水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=246.836,P=0.000;F=368.861,P=0.000)。比較正常對照組，UVB組HaCaT細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下降(t=26.585,P=0.000)；與UVB組比較，低，中，高劑量葡萄籽原花青素處理后，HaCaT細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=206.557,P=0.000)。

3 討論

葡萄籽原花青素是由黃烷-3-醇或黃烷-3, 4二醇聚合而成的一類多酚化合物，具有特殊抗氧化活性[8]，在運動保健領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用，它可以顯著改善運動員免疫功能，提高運動成績[9]，目前的研究表明原花青素對皮膚具有物理隔離紫外線的作用[10]，還具有美白等美容效果[11]，但具體機制研究并不深入。紫外線輻射對皮膚的損傷中，氧化損傷發(fā)揮重要作用，本文就原花青素對紫外線輻射所致的HaCaT細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用進(jìn)行了研究。

通過對葡萄籽原花青素不同濃度組對HaCaT細(xì)胞增殖活力的檢測，結(jié)果表明，50 μg/mL GSPE組、 100 μg/mL GSPE組、 200 μg/mL GSPE組對HaCaT細(xì)胞增殖活力無明顯影響。因此，葡萄籽原花青素的工作濃度采用50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL。30 mJ/cm2UVB照射后，HaCaT細(xì)胞凋亡率明顯上升，說明UVB輻射能誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡。結(jié)果與Salucci的報道一致[12]。進(jìn)一步細(xì)胞內(nèi)ROS和線粒體膜電位的檢測表明，UVB輻射導(dǎo)致HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS明顯升高，和線粒體膜電位的下降。以前的研究表明過量的ROS可以損傷細(xì)胞線粒體，引起線粒體氧化還原狀態(tài)失衡，導(dǎo)致線粒體膜電位水平下降，激活線粒體凋亡通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。Bcl-2和Bax是調(diào)節(jié)凋亡的上游信號，通過調(diào)控線粒體的通透性來調(diào)節(jié)細(xì)胞色素C的釋放，Bcl-2抑制細(xì)胞色素C的釋放，而Bax促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放。線粒體細(xì)胞色素C釋放后能激活Caspase 9，進(jìn)而激活Caspase 3，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]。為此，我們進(jìn)一步檢測了HaCaT細(xì)胞內(nèi)Bcl-2，Bax，Cleaved caspase3的變化情況，結(jié)果證實，HaCaT細(xì)胞在受到UVB輻射后，Bax，Cleaved caspase3的水平明顯上升，而Bcl-2水平則顯著下降。在經(jīng)過50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL葡萄籽原花青素處理后，比較UVB組，HaCaT細(xì)胞凋亡顯著減少，細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著下降，而線粒體膜電位明顯上升。同時，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著上升，Bax，活化Caspase3的水平明顯下降。說明葡萄籽原花青素可以通過抑制UVB輻射導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)ROS過量產(chǎn)生，保護(hù)線粒體膜電位水平，進(jìn)而抑制UVB輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

為了闡明葡萄籽原花青素對UVB輻射導(dǎo)致的細(xì)胞氧化損傷的具體作用機制，我們又檢測了細(xì)胞中SOD、GSH-Px、MDA，以及上清中LDH的水平，以往的研究表明MDA 是氧化應(yīng)激的主要產(chǎn)物， 它們反映了細(xì)胞受自由基損傷的水平[15]，而SOD、GSH-Px具有顯著的抗氧化功能[16]。30 mJ/cm2UVB輻射后，UVB組與正常對照組相比，MDA含量增高，而抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性顯著下降。但HaCaT細(xì)胞經(jīng)過不同濃度的葡萄籽原花青素處理后，細(xì)胞SOD和GSH-Px活性增高，MDA含量下降，說明葡萄籽原花青素能促進(jìn)抗氧化酶活性，減少氧化應(yīng)激產(chǎn)物的產(chǎn)生。紫外線輻射產(chǎn)生的過量ROS使細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)氧化，通透性增加，細(xì)胞內(nèi)LDH通過受損的細(xì)胞膜進(jìn)入到上清中[17]，因此，上清中LDH的含量是細(xì)胞膜氧化損傷的重要標(biāo)志，比較正常對照組，UVB組上清中LDH水平顯著升高，而經(jīng)過不同濃度葡萄籽原花青素處理后，上清中LDH水平顯著下降，結(jié)果進(jìn)一步證明，葡萄籽原花青素對UVB引起的細(xì)胞膜氧化損傷也具有明顯保護(hù)作用。

綜上所述，本研究證實了葡萄籽原花青素能拮抗中波紫外線誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡，其機制可能與葡萄籽原花青素能促進(jìn)抗氧化酶的活性，減少ROS的產(chǎn)生，維持線粒體膜電位，抑制線粒體凋亡途徑的活化有關(guān)。本研究為葡萄籽原花青素在皮膚科學(xué)中的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供了一定的依據(jù)。