轉(zhuǎn)化生長因子-β1 siRNA神經(jīng)干細胞后期移植對大鼠脊髓損傷修復的影響

楊利麗，李秋菊，徐長妍，王春玲，張 妍

脊髓受到直接或間接暴力傷害后，內(nèi)部出現(xiàn)出血及水腫現(xiàn)象，部分神經(jīng)元發(fā)生凋亡，進而導致神經(jīng)傳導中斷，急性脊髓損造模后早期微循環(huán)障礙導致局部缺血缺氧并發(fā)生免疫炎癥反應，小膠質(zhì)細胞及星形膠質(zhì)細胞的活化、增殖、遷徙，造成了繼發(fā)細胞毒性并導致瘢痕形成，持續(xù)的脊髓缺血缺氧及代謝紊亂，不利于神經(jīng)元及軸突的再生，最終導致繼發(fā)性脊髓損傷[1-2]。故脊髓損傷后, 提高神經(jīng)元的存活質(zhì)量、促進神經(jīng)元軸突的生長及定向分化是恢復脊髓功能的關鍵, 而受損神經(jīng)元的存活及軸突的再生受內(nèi)、外環(huán)境多種因素的影響。盡量減少神經(jīng)元凋亡的數(shù)量，無疑可保留脊髓損傷后的神經(jīng)功能[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，在脊髓損傷區(qū)植入的神經(jīng)干細胞（neural stem cells，NSCs）能夠誘導損傷區(qū)的微血管再生，使細胞定向分化為神經(jīng)前體細胞，釋放生長因子，促進軸突的再形成，使神經(jīng)細胞得到再生和重建，從而使脊髓損傷得到修復[5]。故有學者提議一致的理想供體可由NSCs來充當[6]。

轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factorβ,TGF-β)是集多種生物功能于一體的蛋白多肽，能夠誘導細胞表型發(fā)生改變，亦可影響正常以及瘤細胞的分化。NSCs是指具有分化為神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞和星型膠質(zhì)細胞能力，且能夠自我更新并形成神經(jīng)組織的細胞[7]。NSCs的定向遷移能力對于脊髓損傷這種存在著廣泛病變而沒有明確定位的疾病，具有重大意義[8]。NSCs具有的定向遷移、組織融合及免疫豁免性，使其在損傷移植后可以很好的存活[9]。且研究已證實NSCs移植安全有效，對大鼠的正常生長發(fā)育無明顯影響[10]。因此，本實驗擬探討TGF-β基因沉默NSCs后期移植對大鼠脊髓損傷修復的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 SD大鼠78只，體質(zhì)量為(250±20)g（動物質(zhì)量合格證號：SCXK(津)20050001），購自中國醫(yī)學科學院動物實驗室。

1.2 試劑與儀器 胰蛋白酶(美國Santa Cruz 公司)；CM-Dil（美國 Invitrogen公司）；慢病毒包裝試劑盒（美國GeneCopoeia）；嘌呤霉素（上海宇玫博生物科技有限公司）；兔抗鼠T GF - β1多克隆抗體、兔抗鼠Syn多克隆抗體（美國sigma）；Western blot蛋白檢測試劑盒（美國 Santa Cruz 公司）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒 （Beyotime 公司）；化學發(fā)光檢測試劑盒（美國Pierce）；Trizol試劑（美國Invitrogen公司）；QuantiTect逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（德國QIAGEN公司）；掃描分析軟件系統(tǒng)（Labworks Analysis Software， 美 國 ）；JEM-1200EX 系 統(tǒng)（JOEL，日本東京）。

1.3 培養(yǎng)和標記NSCs 將SD大鼠中乳鼠消毒30 s，打開大腦皮層，暴露兩側(cè)的海馬組織，將其取出并放在已準備好的冷的培養(yǎng)基中，將組織剪碎，并用吹打法對其進行吹打，直到無明顯的塊狀組織。用濾網(wǎng)進行過濾。 設 置 離 心 機 參 數(shù) 為1000 r/min、5 min，隨后將濾液移至離心管中，并放入4 ℃預冷的離心機中進行離心，畢后再次對其進行重懸。將重懸液移至25 cm2的培養(yǎng)瓶中，并調(diào)整細胞密度為1×105～5×105個/mL，于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每2～3 d將原有培養(yǎng)基丟棄，并添加新培養(yǎng)基，5 d后進行傳代。對收集的細胞進行消化、離心，棄去上清液，向其中添加200 μL新培養(yǎng)液，用槍頭對其進行吹打至單細胞懸液，計數(shù)，隨后將其接種到培養(yǎng)瓶，再次進行上述密度調(diào)整。每2～3 d更換1次培養(yǎng)液， 5 d進行1次傳代。自第2代NSCs開始對其實施干預處理。 將1 mL完全培養(yǎng)基和5μL的CM-Dil添加到1.5 mL的EP管中，反復進行吹打直至混勻，得到CM-Dil標記液。對細胞進行觀察，當貼壁數(shù)達90%時，將其中的培養(yǎng)液丟棄，用PBS反復進行沖洗3次，將表面液體去除，向其中添加上述已配置液體，繼續(xù)培養(yǎng)20 min，畢后將其中的液體丟棄,并添加5 mL的完全培養(yǎng)基,并進行溫育，10 min后將其丟棄,再次向其中添加培養(yǎng)基，反復沖洗2次。連續(xù)進行培養(yǎng)，用于后續(xù)實驗。

1.4 基因轉(zhuǎn)染與實驗分組 取生長狀態(tài)良好的P3代NSCs，更換新的培養(yǎng)基。TGF-β1小干擾RNA(siRNA)最佳序列見參考文獻[11]，將含有TGF-β1基因的慢病毒添加到培養(yǎng)基中。將其放在恒溫培養(yǎng)箱中，8 h后將含有病毒的培養(yǎng)基棄去，并用PBS液洗滌2次。畢后添加完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)72 h。隨后將其替換成含1 μg/mL嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基。每天于固定時間觀察細胞，將未轉(zhuǎn)染成功的細胞去除，更換培養(yǎng)基，在顯微鏡下觀察直至死亡細胞不再增加。向其中添加完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，直至實驗所需時間為止，并進行后續(xù)相關指標的測定。

依據(jù)干預方式的不同分為3組：對照組——NSCs未經(jīng)任何特殊處理，單轉(zhuǎn)染慢病毒組——NSCs轉(zhuǎn)染對照慢病毒，TGF-β1-siRNA組——NSCs轉(zhuǎn)染TGF-β1-siRNA慢病毒。

1.5 測定指標及方法

1.5.1 Western blot檢測轉(zhuǎn)染后第3 d和第14 d的TGF-β1蛋白的表達 分別于轉(zhuǎn)染后的第3 d和14 d，對細胞濃度進行調(diào)整，使其滿足5×105/mL，隨后進行接種， 1 mL/孔，培養(yǎng)24 h，隨后饑餓12 h。參照說明書收集蛋白。對蛋白樣品依據(jù)BCA 蛋白濃度檢測試劑盒進行定量。TGF-β1蛋白表達采用Western blot蛋白檢測試劑盒測定，簡述之，取收集的蛋白50μg，經(jīng)10% 聚丙烯酰胺凝膠電泳跑分離。取纖維膜用半干式電印跡將蛋白進行轉(zhuǎn)膜，室溫封閉1 h，向其中添加TGF-β1、GAPDH一抗4 ℃過夜，次日洗膜，后添加二抗，1h后再次進行上述溫育及洗膜處理。ECL化學發(fā)光法暗室曝光。重復以上操作步驟3次。用Quantity one處理系統(tǒng)進行結(jié)果的處理。

1.5.2 模型建立及實驗分組 對大鼠進行適應性喂養(yǎng)3 d后進行實驗，麻醉、固定、剃毛，背部正中區(qū)域皮膚消毒并切口，暴露棘突和椎板，切除T8-T9棘突及部分椎板，并切除黃韌帶，顯露出硬腦膜。按照改良Allen法設計打擊錘重量為10 g、打擊高度為2.5 cm進行脊髓打擊，當觀察到鼠尾及雙后肢可見痙攣性伸直片刻后又松弛則表示造模成功。隨后注射青霉素20萬U/d，接連3 d，以防發(fā)生感染。于脊髓損傷模型建立后至排尿反射恢復前，人工擠尿3次/ d。

成年雌性SD大鼠78只，體質(zhì)量(250±20)g，造模成功72只，隨機分為3組，每組24只，單獨放于3個籠子里。進一步將各組隨機分為脊髓損傷后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d共6個時間點，各時間點4只。保持動物良好的衛(wèi)生條件，允許其自由進食水。脊髓損傷6h后，對照組0.9%氯化鈉注射液20 μL注入；NSCs移植組予以等量CM-Dil標記的NSC懸液（3×106/L）注入；TGF-β1-siRNA組予以等量CM-Dil標記的TGF-β1-siRNANSC懸液（3×106/L）注入。

1.5.3 檢測各組大鼠脊髓損傷后運動功能的恢復情況 3組大鼠均于脊髓損傷前及后不同時期應用BBB評分、斜板試驗、改良Tarlov評分對后肢運動功能做出評判。

BBB評分方法：將待檢大鼠置于室溫、光線適宜、安靜環(huán)境中，于上午9點前將其膀胱尿量排空，隨后對其進行觀察，共持續(xù)5 min。由兩人獨立對其表現(xiàn)進行評分，將兩人所得分數(shù)的均值作為終值來評定損傷后運動功能的恢復情況。評分細則[11]：共22級，0級：后肢完全癱瘓，21級：功能正常。觀察關節(jié)活動次數(shù)，運動負荷、范圍，前肢、后肢及前爪、后爪、尾巴的協(xié)調(diào)程度。

斜板試驗：將大鼠置于光滑的木板上，頭部面向木板的高側(cè)端，體軸垂直于板的垂直軸，每個試驗斜板的角度增加5°，當最大角度時大鼠可停留5 s，則認為有功能價值[12]。每個角度均進行3次測量，將得到的平均數(shù)作為最終結(jié)果。

改良Tarlov評分：0分：完全癱瘓，刺激下肢沒有反應；1分：完全癱瘓，刺激有反應，但無法活動；2分：能夠活動，但站立不穩(wěn)或不能站立；3分：能站立，卻不能走動；4分：能走動幾步，但步態(tài)不穩(wěn)；5分：能慢慢走動，但不靈活；6分：正常。

1.5.4 RT-PCR、Western blot檢測突觸素（Syn）及TGF-β1基因和蛋白的表達 脊髓損傷后1周將大鼠麻醉，迅速取出包含損傷區(qū)域在內(nèi)的脊髓組織約10mm，按照Trizol試劑說明書中的具體步驟提取組織樣品的總RNA,空白對照采用三蒸水。隨后進行反轉(zhuǎn)錄及測定。引物設計及合成按照已報道的序列設計并合成Syn、TGF-β1及內(nèi)參照GAPDH的特異性引物。各引物的序列為：Syn上游引物5’-CCAGAGACCTCTAA CCACCCGACAC-3’，下 游 引 物 5’-TAAACAACCTTGGGGAGGTG GGCG-3’， 擴 增 長 度 為 240bp；TGF-β1上 游引 物 5’-CTGTAATTCTGCTGTAATA-3’， 下游 引 物 5’-GGCT TAGT ATTCTGGGAAA-3’，擴 增 長 度296bp；GAPDH上 游 引 物5’-GTCAACGG ATTTGGTGGTATT-3’，下游引物 5’-AGTCTTCTGGGTGGCAGTCAT-3’，擴增長度為499bp。根據(jù)標準曲線將各樣品測得的Ct值換算成拷貝數(shù)，分析各檢測樣本中目的基因拷貝數(shù)相對于陽性定量參考樣品的基因拷貝數(shù)，分析方法采用2-△△Ct方法。對損傷區(qū)取得的脊髓組織的總蛋白進行提取，隨后應用二辛可寧酸法定量試劑盒進行測定。Western blot具體操作方法如前所述，其中抗Syn 1按1000稀釋，抗TGF-β1按1:50稀釋，二抗按1:5000稀釋，DAB顯色15 min，用掃描分析軟件系統(tǒng)測定各條帶的積分灰度值。

1.5.5 HE染色及CM-Dil熒光顯微鏡 3組各隨機選4只大鼠，在脊髓損傷后的第4周，行麻醉后迅速從病變部位取長約1 cm的完整脊髓，經(jīng)分級系列酒精脫水，縱向切片，厚約20 μm。行HE染色，并觀察。隨機取10個視野，用高倍熒光顯微鏡（200×）觀察，計數(shù)每個視野內(nèi)CM-Dil的>陽性細胞數(shù)，并取其平均值作為CM-Dil的細胞數(shù)。以了解CM-Dil標記的NSCs的分布及存活情況。

1.5.6 辣根過氧化物酶（HRP）逆行示蹤評估神經(jīng)纖維再生情況 每組隨機取4只大鼠，于造模成功后第4周用10%水合氯醛麻醉，在T12脊髓背側(cè)正中神經(jīng)兩側(cè)1 mm處進針1.5 mm，10 min內(nèi)注射50% HRP 0. 1μL，留針15 min。飼養(yǎng)3 d后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，將脊髓T3～T11段浸泡在4 ℃、30%的蔗糖溶液中20 h。切片用DAB處理。取脊髓橫斷面，用光學顯微鏡觀察并記錄HRP陽性的纖維個數(shù)。

1.5.7 透射電鏡觀察各組脊髓損傷區(qū)超微結(jié)構以損傷區(qū)為中心截取長約1 cm的脊髓組織，將其放在2%的戊二醛中進行固定過夜，行超薄切片后透射電鏡觀察，采用JEM-1200EX系統(tǒng)進行拍照，觀察脊髓的超微結(jié)構，并采用Image J軟件進行分析。

2 結(jié)果

2.1 NSCs體外培養(yǎng)、鑒定及標記 培養(yǎng)1 d后NSCs增多、較小、形狀不規(guī)則，小部分細胞團貼壁；培養(yǎng)5 d后NSCs增多，為較大、形狀規(guī)則的球形，見圖1A。免疫熒光染色顯示，NSCs球呈Nestin強陽性表達，Nestin免疫熒光化學染色陽性，見圖1B。CM-Dil標記的NSCs在熒光顯微鏡下呈紅色熒光，見圖1C。研究證實，CM-DiI標記熒光在胞內(nèi)表達穩(wěn)定，標記的陽性率達97%以上，標記細胞形態(tài)良好，能有效地觀察細胞在體外的誘導分化情況。

2.2 TGF-β1蛋白的表達 于TGF-β沉默NSCs轉(zhuǎn)染3 d后檢測各組TGF-β1蛋白表達，發(fā)現(xiàn)TGF-β1 呈低表達，第14 d再次對各組TGF-β1表達量進行比較，蛋白仍呈現(xiàn)低表達水平（圖2）。

2.3 檢測各組大鼠脊髓損傷后運動功能的恢復情 況 對脊髓損傷前后運動功能進行評估。損傷前各組BBB、改良Tarlov評分及斜板試驗結(jié)果近似。于脊髓損傷后的1d、3d、7d、14d、21d、28d再次進行判讀，結(jié)果顯示，與對照組相比，NSCs移植組以及TGF-β1-siRNA組均較高，且TGF-β1-siRNA組較NSCs移植組高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。表1、表2、表3。

圖1 NSCs的培養(yǎng)、鑒定和標記

圖2 轉(zhuǎn)染后3 d、14 d各組TGF-β1蛋白的表達情況（）

表1 三組大鼠各時相點BBB評分比較（± s，n=5）

表1 三組大鼠各時相點BBB評分比較（± s，n=5）

注：與對照組相比，aP＜0.05；與NSCs移植組相比，bP＜0.05

組別 脊髓損傷前脊髓損傷后1 d 3 d 7 d 14 d 21 d 28 d對照組 21.00±0.34 0.20±0.06 0.21±0.04 3.20±0.23 6.20±0.34 9.34±0.34 10.23±0.23 NSCs移植組 21.00±0.37 0.45±0.09a 0.60±0.13a 5.37±0.34a 8.95±0.34a 10.10±0.24a 15.30±0.31a TGF-β1-siRNA 組 21.00±0.42 0.62±0.13a、b 1.30±0.32a、b 1267±0.42a、b 17.52±0.36a、b 19.00±0.34a、b 20.00±0.45a、b

表2 三組大鼠各時相點改良Tarlov評分比較（± s，n=5）

表2 三組大鼠各時相點改良Tarlov評分比較（± s，n=5）

注：與對照組相比，aP＜0.05；與NSCs移植組相比，bP＜0.05

脊髓損傷后1 d 3 d 7 d 14 d 21 d 28 d對照組 41.15±1.32 12.13±1.33 14.51±1.44 15.17±1.25 20.47±2.13 21.74±2.08 24.82±2.15 NSCs移植組 41.16±1.64 12.46±1.76 15.43±2.15a 17.53±1.24a 23.27±2.15a 28.95±2.19a 33.25±2.03a TGF-β1-siRNA 組 41.16±2.23 13.03±2.06 17.16±1.24a、b 17.16±1.27a、b 24.10±2.27a、b 32.14±2.43a、b 37.17±2.45a、b組別 脊髓損傷前

表3 三組大鼠各時相點斜板試驗角度比較（± s，n=5）

表3 三組大鼠各時相點斜板試驗角度比較（± s，n=5）

注：與對照組相比，aP＜0.05；與NSCs移植組相比，bP＜0.05

脊髓損傷后1 d 3 d 7 d 14 d 21 d 28 d對照組 68.60±0.89 20.10±0.73 20.40±0.84 20.80±0.53 21.02±0.68 20.96±0.63 21.14±0.54 NSCs 移植組 68.60±1.52 21.00±0.84 23.00±1.00a 25.03±0.73a 27.00±1.04a 28.70±0.54a 31.04±0.95a TGF-β1-siRNA 組 68.60±0.71 22.60±0.68 23.40±0.89ab 26.20±0.84ab 29.32±0.85ab 33.03±0.59ab 37.34±0.64ab組別 脊髓損傷前

2.4 Syn及TGF-β1基因轉(zhuǎn)錄表達 如表4、圖3所示，TGF-β1-siRNA組大鼠脊髓組織中Syn基因表達顯著高于對照組、NSCs移植組(P＜0.05)；而與對照組相比，NSCs移植組大鼠脊髓組織中Syn mRNA相對表達水平亦顯著提高(P＜0.05)。在TGF-β1基因表達水平方面，TGF-β1-siRNA組顯著低于其他各組(P＜0.05)。

表4 大鼠脊髓組織Syn和TGF-β1mRNA表達()

圖3 大鼠脊髓組織Syn和TGF-β1基因表達

2.5 Syn及 TGF-β1蛋白 表5、圖 4所示為TGF-β1基因沉默神經(jīng)干細胞移植對脊髓損傷模型大鼠脊髓組織中Syn和TGF-β1兩個蛋白分子相對蛋白表達水平的影響。如表中所示在Syn蛋白表達方面，TGF-β1-siRNA組與其他二組相比顯著較高(P＜0.05)；與脊髓損傷模型組相比，NSCs移植組顯著提高了大鼠脊髓組織中Syn蛋白相對表達水平(P＜0.05)。而TGF-β1蛋白表達在TGF-β1-siRNA組則顯著低于對照組和NSCs移植組 (P＜0.05)。

表5 大鼠脊髓組織Syn和TGF-β1蛋白表達()

圖4 大鼠脊髓組織Syn和TGF-β1蛋白表達

2.6 HE染色觀察 損傷后4周，取大鼠脊髓組織切片行HE染色觀察，發(fā)現(xiàn)對照組可觀察到脊髓組織的缺失以及脊髓空洞的形成，并且無神經(jīng)軸索通過。而NSCs移植組能看到脊髓損傷區(qū)有少量的神經(jīng)軸索樣結(jié)構通過，并且脊髓空洞明顯減小。TGF-β1-siRNA組神經(jīng)軸索樣結(jié)構明顯增多，脊髓空洞幾乎消失。見圖5。

圖5 各組脊髓組織HE染色結(jié)果（×40）

2.7 熒光顯微鏡觀察CM-Dil標記的NSCs CMDil標記后在熒光顯微鏡觀察可見NSCs呈現(xiàn)紅色熒光。對照組看不到紅色熒光，NSCs移植組脊髓損傷區(qū)可見CM-Dil陽性細胞，（22.38±3.45）個/高倍視野，TGF-β1-siRNA組可見較多CM-Dil陽性細胞，（38.68±4.89）個/高倍視野，差異有統(tǒng)計學意義。見圖6。

圖6 各組脊髓組織CM-Dil熒光顯微鏡觀察結(jié)果（×200）

2.8 HRP逆行示蹤評估神經(jīng)纖維再生情況 移植后28d，TGF-β1-siRNA組陽性神經(jīng)纖維數(shù)明顯多于對照組和NSCs移植組（P＜0.05）。見表6 、圖7。

表6 各組HRP逆行示蹤標記神經(jīng)纖維數(shù)（個/高倍視野）

圖7 各組HRP逆行示蹤標記的神經(jīng)纖維數(shù)（×200）

2.9 透射電鏡觀察各組脊髓損傷區(qū)超微結(jié)構 在透射電鏡下對各組脊髓損傷處進行觀察，對照組僅見少量的有髓神經(jīng)纖維，并可見膠質(zhì)瘢痕；NSCs移植組有髓神經(jīng)纖維增多，且可見無髓神經(jīng)纖維；相對于前兩組而言，TGF-β1-siRNA組可見大量有髓及無髓神經(jīng)纖維，且周圖數(shù)量較多，再生的軸突髓鞘完整。見圖8。

圖8 透射電鏡下HRP逆行示蹤各組神經(jīng)纖維超微結(jié)構（×10 000）

3 討論

NSCs是一種較易獲得、培養(yǎng)、增殖，臨床應用前景又廣泛的干細胞。其具有定向分化為神經(jīng)細胞或膠質(zhì)細胞、移植免疫排斥小及不受倫理學問題困擾的優(yōu)勢，且經(jīng)多次傳代后仍能保持干細胞的特性，并能在移植入體內(nèi)后保持長期存活[12]。有研究表明NSCs在移植部位能夠分裂增殖，并在局部微環(huán)境作用下分化為相應的細胞作為受損細胞的替代[12]。另有研究認為在脊髓損傷的相關區(qū)域，如果移植的NSCs是體外培養(yǎng)成的神經(jīng)前體細胞，將有利于干細胞的存活及相應功能的形成[13]。但多項研究表明，單純的移植NSCs對損傷的脊髓組織功能修復作用并非很理想，如能結(jié)合基因生物工程材料及藥物等其他手段將會更好的進行綜合治療。TGF-β在調(diào)節(jié)細胞生長方面有突出作用[14]。目前NSCs移植被視為神經(jīng)系統(tǒng)治療的重要手段[15]。脊髓損傷區(qū)行NSCs移植能夠形成突觸連接。大量實驗[16]說明細胞移植是修復脊髓損傷的有效方法之一。于局部微環(huán)境的作用下，移植區(qū)的NSCs會增生、分化，進而取代受損的組織。許多學者認為，該細胞要想在移植區(qū)發(fā)揮作用，需要先在體外條件下培養(yǎng)，當分化為神經(jīng)前體細胞后再移植到受損部位，才會發(fā)揮相應的作用[17]。

本研究將TGF-β1-siRNA轉(zhuǎn)染NSCs后移植入脊髓損傷大鼠體內(nèi)，經(jīng)熒光顯微鏡觀察可見CM-Dil標記的NSCs，證明移植成功。隨后對脊髓損傷后的運動功能進行觀察，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染TGF-β1-siRNA的NSCs較單純NSCs及對照組對大鼠運動功能改善更明顯。說明TGF-β1沉默聯(lián)合NSCs移植效果優(yōu)于單純NSCs移植的作用。1周后對脊髓損傷區(qū)Syn及TGF-β1的mRNA及蛋白表達情況進行比較，TGF-β1-siRNA組Syn表達明顯高于其他兩組，而TGF-β1顯著降低。這提示TGF-β1表達下降有助于脊髓損傷后的修復。NSCs具多向分化潛能。進一步對各組神經(jīng)纖維的再生情況進行觀察發(fā)現(xiàn)，TGF-β1-siRNA組陽性神經(jīng)纖維數(shù)最多。而應用透射電鏡對脊髓損傷區(qū)的超微結(jié)構進行觀察發(fā)現(xiàn)，TGF-β1-siRNA組的神經(jīng)纖維明顯增多，軸突數(shù)目增加，且再生軸突的髓鞘完整。

綜上，轉(zhuǎn)染TGF-β1-siRNA 的NSCs移植相對于單純NSCs移植而言，對脊髓損傷后功能的修復作用更顯著，前者能夠有效的降低脊髓損傷區(qū)TGF-β1的表達，同時促進Syn表達，并對神經(jīng)突觸的再生有積極作用，使大鼠的運動功能得以改善。