基于Wnt/β-catenin信號(hào)通路的涼血散瘀法對(duì)糖尿病潰瘍大鼠模型的干預(yù)作用

趙亞男，劉 明，張玉冬，王 彬，張 玥，王 冠，陳 萍

糖尿病潰瘍（dabetic ulcer, DU）是極具代表性的難愈性潰瘍。據(jù)統(tǒng)計(jì)，15%～25%的糖尿病患者會(huì)發(fā)生皮膚潰瘍，且反復(fù)發(fā)作，經(jīng)久不愈，嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致截肢或引發(fā)膿毒血癥而危及生命[1-2]。中醫(yī)中藥在DU的治療中發(fā)揮著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。前期的臨床研究發(fā)現(xiàn)涼血散瘀中藥可顯著促進(jìn)DU的愈合[3]。因此我們選擇具有涼血散瘀作用的四妙勇安湯及愈瘍靈軟膏，觀察其對(duì)DU大鼠潰瘍創(chuàng)面愈合速度、組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及Wnt信號(hào)通路相關(guān)因子的表達(dá)影響，探討涼血散瘀中藥對(duì)DU大鼠的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和試劑 雌性Wistar大鼠85只，體重160～180 g，清潔級(jí)，購(gòu)自山東大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。鏈脲佐菌素（streptozotocin, STZ, Sigma），大鼠ELISA試劑盒（R&D），T重復(fù)寡核苷酸[Oligo（dT）]、RNA 酶抑制劑（ribonuclease inhibitor）、焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate, DEPC，Bio Basic INC），逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）、Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase）、dNTP混合物（dNTP Mix）、瓊脂糖（agarose type I-B）等購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，引物由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 糖尿病大鼠模型制作 大鼠按隨機(jī)數(shù)字表分為正常對(duì)照組（15只）和糖尿病組（DM組，60只）。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，對(duì)照組給予普通飼料繼續(xù)飼養(yǎng)，DM組給予高脂高糖飼料（59%基礎(chǔ)飼料+20%

蔗糖+18%豬油+3%蛋黃，由北京科澳協(xié)力飼料有限公司加工制作）飼養(yǎng)。飼養(yǎng)4周后，兩組大鼠均禁食12 h，DM組給予1%的STZ溶液（臨用前用0.1 mol/L、pH4.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制）單次腹腔注射（30 mg/kg），對(duì)照組注射等體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。注射后第3 d采用斷尾取血法測(cè)血糖，隨機(jī)血糖≥16.67 mmol/L為糖尿病造模成功[4]；造模不成功者空腹12 h后按10 mg/kg用量再次注射1% STZ溶液。

1.3 DU大鼠模型制作 DM組大鼠在維持高血糖狀態(tài)4周后，以3%的戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射進(jìn)行麻醉，備皮消毒，在背部制作直徑約為2.5 cm的圓形創(chuàng)面，深至皮下[5]。潰瘍?cè)炷：?，隨機(jī)分為DU組、DU-四妙組、DU-愈瘍靈組及DU-四妙+愈瘍靈組，每組15只；對(duì)照組以同樣方法制備潰瘍模型，作為潰瘍對(duì)照（control ulcer, CU）組。

1.4 藥物干預(yù)與標(biāo)本采集 四妙勇安湯水煎劑由金銀花90 g，玄參90 g，當(dāng)歸60 g，甘草30 g組成，飲片購(gòu)自山東中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湯液經(jīng)過(guò)懸蒸儀濃縮至5.625 g/mL。愈瘍靈軟膏主要組成藥物有象皮粉、紫草、地骨皮、黃柏、當(dāng)歸、血竭、冰片、甘草、麻油、蜂蠟等，由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科采用先進(jìn)生產(chǎn)工藝加工成油膏制劑，批號(hào)：濟(jì)衛(wèi)藥制[97]FZ053-03。于造模后第2 d按表1給予相應(yīng)藥物處理，1次/d, 灌胃劑量為1 mL/100 g。分別于潰瘍?cè)炷：蟮?、7、14 d，每組大鼠隨機(jī)抽取5只，戊巴比妥鈉麻醉后，觀察創(chuàng)面愈合情況和組織病理學(xué)改變，并采集創(chuàng)面及創(chuàng)周2 mm的組織，應(yīng)用ELISA和RT-PCR法檢測(cè)β-catenin和糖原合成激酶-3β（GSK-3β）表達(dá)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠藥物處理

1.5 指標(biāo)檢測(cè) 創(chuàng)面愈合情況觀察，主要包括創(chuàng)面顏色、腫脹程度、滲液量等，并用數(shù)碼相機(jī)拍照，通過(guò)Photoshop軟件，記錄創(chuàng)面面積，計(jì)算創(chuàng)面愈合率[6]。

創(chuàng)面組織病理觀察，4%多聚甲醛固定組織后，制成組織切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色（HE染色），觀察創(chuàng)面的組織學(xué)變化，包括毛細(xì)血管、膠原蛋白、成纖維細(xì)胞等的變化。

創(chuàng) 面 組 織 β-catenin、GSK-3β蛋 白 和mRNA表達(dá)的檢測(cè)，將創(chuàng)面組織進(jìn)行研磨，應(yīng)用ELISA染色法按照試劑盒說(shuō)明檢測(cè)創(chuàng)面組織中β-catenin、GSK-3β蛋白的含量。應(yīng)用RTPCR法檢測(cè)創(chuàng)面組織中β-catenin、GSK-3β mRNA的含量。β-catenin引物序列：上游：5-CTGACCAAACTGCTAAATGACG-3， 下 游：5-GTGGTGATGGCGTAGAACAGTA-3；GSK-3β引物序列：上游：GGACCTCGGAGCAAGTTTCA，下游：AGGCTCCCTCCAAGATCCAT。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況的變化 糖尿病造模后，DM組大鼠毛色逐漸灰暗、枯黃、雜亂，皮膚及皮下脂肪變薄，多飲、多食、多尿明顯。而CU組大鼠毛發(fā)細(xì)密、光亮，皮下脂肪豐滿，體質(zhì)量逐漸增加。

2.2 大鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量、飲水量、排泄量、血糖的變化 注射STZ后，DM組大鼠平均每日進(jìn)食量、飲水量、排泄量均增加，體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，血糖升高，與CU組相比均有顯著差異（P＜0.05，表2）。

表2 大鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量、飲水量、排泄量及血糖的變化（）

表2 大鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量、飲水量、排泄量及血糖的變化（）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05

時(shí)間體重（g） 進(jìn)食量（g） 飲水量（g） 排泄量（g） 血糖（mmol/L）CU組 DM組 CU組 DM組 CU組 DM組 CU組 DM組 CU組 DM組造模前 165.76±5.04 167.12±5.07 16.29±0.67 16.29±0.68 30.06±2.28 29.93±2.61 12.82±1.44 12.58±1.87 6.06±0.30 6.11±0.30 STZ 注射前 237.24±4.78 238.59±5.21 16.75±0.61 16.70±0.69 26.87±2.85 30.06±2.46 13.22±1.77 13.75±1.55 6.09±0.29 6.12±0.28創(chuàng)面造模前 301.12±5.49 250.02±5.26a16.81±0.67 26.62±0.72a26.31±2.47 87.30±3.84a13.60±1.95 88.87±5.63a 5.99±0.15 26.28±3.05a

2.3 創(chuàng)面愈合率 DU組大鼠各時(shí)間點(diǎn)的創(chuàng)面愈合率均低于CU組，治療組各時(shí)間點(diǎn)的創(chuàng)面愈合率均高于DU組，而低于CU組。創(chuàng)面造模后第3 d各治療組創(chuàng)面愈合率按由高到低依次排列為：DU-四妙+愈瘍靈組、DU-四妙組、DU-愈瘍靈組；第7、14 d各治療組創(chuàng)面愈合率由高到低依次排列為：DU-四妙+愈瘍靈組、DU-愈瘍靈組、DU-四妙組。見(jiàn)表3。

表3 大鼠創(chuàng)面愈合率的變化（%， ）

2.4 創(chuàng)面組織的HE染色 與CU組相比，DU組大鼠創(chuàng)面造模后第3 d炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較少，而第7、14 d炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)仍較多，成纖維細(xì)胞、毛細(xì)血管等則較少。與DU組相比，各治療組創(chuàng)面愈合早期炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)均增加，且以DU-四妙組及DU-四妙+愈瘍靈組為著；各治療組創(chuàng)面愈合后期成纖維細(xì)胞、毛細(xì)血管增加，且以DU-愈瘍靈組及DU-四妙+愈瘍靈組最明顯。

2.5 創(chuàng)面組織中β-catenin、GSK-3β蛋白的表達(dá) ELISA結(jié)果顯示，創(chuàng)面造模后第3、7 d，各組大鼠創(chuàng)面組織中β-catenin蛋白表達(dá)水平由高到低依次排列為：CU組＞DU-四妙+愈瘍靈組＞DU-四妙組＞DU-愈瘍靈組＞DU組；第14 d，β-catenin蛋白表達(dá)水平由高到低依次排列為：CU組＞DU-四妙+愈瘍靈組＞DU-愈瘍靈組＞DU-四妙組＞DU組。

創(chuàng)面造模后第3 d，組織中GSK-3β蛋白的表達(dá)水平由高到低依次排列為：DU組＞DU-愈瘍靈組＞DU-四妙組＞DU-四妙+愈瘍靈組＞CU組；第7、14 d，GSK-3β蛋白的表達(dá)水平由高到低依次排列為：DU組＞DU-四妙組＞DU-愈瘍靈組＞DU-四妙+愈瘍靈組＞CU組。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的組織β-catenin、GSK-3β蛋白比較（×102pg/g,, n=5）

2.6 創(chuàng)面組織中β-catenin、GSK-3β mRNA的表達(dá) RT-PCR結(jié)果顯示，創(chuàng)面造模后第3、7 d，組織中β-catenin mRNA的表達(dá)量由高到低依次排列為：CU組＞DU-四妙+愈瘍靈組＞DU-四妙組＞DU-愈瘍靈組＞DU組；第14 d，β-catenin mRAN的表達(dá)量由高到低依次為：CU組＞DU-四妙+愈瘍靈組＞DU-愈瘍靈組＞DU-四妙組＞DU組。

創(chuàng)面造模后第3 d，組織中GSK-3β mRNA的表達(dá)量由高到低依次排列為：DU組＞DU-愈瘍靈組＞DU-四妙組＞DU-四妙+愈瘍靈組＞CU組；第7、14 d，GSK-3β mRNA的表達(dá)量由高到低依次排列為：DU組＞DU-四妙組＞DU-愈瘍靈組＞DU-四妙+愈瘍靈組＞CU組。見(jiàn)表5，圖1。

表5 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的組織β-catenin、 GSK-3β mRNA比較（ng/μL,, n=5）

圖1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的組織β-catenin、GSK-3β mRNA的表達(dá)

3 討論

DU是糖尿病的常見(jiàn)并發(fā)癥之一，具有發(fā)病原因復(fù)雜、病程長(zhǎng)、治療困難、預(yù)后較差的特點(diǎn)，嚴(yán)重者可導(dǎo)致膿毒血癥或截肢。Dohmen等[7]報(bào)道，在德國(guó)每年有40 000例截肢患者中70%為糖尿病患者。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約70%～84%的糖尿病潰瘍患者需要截肢，而截肢后患者5年生存率僅為30%[8]。

四妙勇安湯是臨床治療糖尿病潰瘍的常用方劑，其內(nèi)容最早見(jiàn)于華佗《神醫(yī)秘傳》，原文載：“此疾發(fā)于手指或足趾之端，先癢而后痛，甲現(xiàn)黑色，久則潰敗，節(jié)節(jié)脫落。內(nèi)服藥用金銀花3兩、玄參3兩、當(dāng)歸2兩、甘草1兩，水煎服。”方中金銀花清熱解毒，玄參滋陰涼血清熱，共為君藥；當(dāng)歸養(yǎng)血活血為臣；甘草為使，清熱解毒、調(diào)和諸藥；全方共奏清熱解毒、活血通脈之功。研究證實(shí)，四妙勇安湯可降低糖尿病足患者血清炎癥因子的水平，保護(hù)糖尿病患者血管內(nèi)皮細(xì)胞[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用四妙勇安湯干預(yù)后，大鼠創(chuàng)面組織中β-catenin蛋白及mRNA水平均較DU組有所提高，GSK-3β蛋白及mRNA水平均較DU組有所下降，說(shuō)明四妙勇安湯有可能通過(guò)對(duì)Wnt/β-catenin通路進(jìn)行干預(yù)而實(shí)現(xiàn)了創(chuàng)面的促愈作用。與DU-愈瘍靈組相比，DU-四妙組的主要作用時(shí)間在創(chuàng)傷早期，且隨著時(shí)間的推移，四妙勇安湯對(duì)各指標(biāo)的作用略有減弱，考慮形成此現(xiàn)象的原因可能由于創(chuàng)面早期以炎癥反應(yīng)為主，而四妙勇安湯能有效糾正DU早期炎癥反應(yīng)紊亂的狀態(tài)，故而主要發(fā)揮效用的時(shí)間在創(chuàng)面修復(fù)的早期。

愈瘍靈軟膏主要組成藥物有紫草、地骨皮、當(dāng)歸、血竭、象皮粉、黃柏、冰片、甘草、麻油、蜂蠟。方中紫草清熱涼血、活血化瘀為君藥；地骨皮、黃柏助君藥清熱涼血，當(dāng)歸、血竭助君藥活血散瘀，血竭、象皮均可斂瘡生肌，以促進(jìn)創(chuàng)面愈合，上五味共為臣藥；冰片、蜂蠟、麻油共用，既可促進(jìn)藥物吸收，又可加快創(chuàng)面愈合，助君臣藥發(fā)揮作用，麻油又可作為油膏之基質(zhì)，共為佐藥；甘草調(diào)和諸藥，為使藥[11]。全方共奏涼血散瘀、斂瘡生肌之效。前期研究已證實(shí)，愈瘍靈軟膏可促進(jìn)慢性潰瘍創(chuàng)面愈合，改善創(chuàng)周氣血瘀滯狀態(tài)，雙向調(diào)節(jié)創(chuàng)面分泌物，抑制創(chuàng)面細(xì)菌生長(zhǎng)，改善局部血液循環(huán)，促進(jìn)肉芽新生，加速創(chuàng)面愈合[12-13]。在本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)愈瘍靈軟膏治療后，大鼠創(chuàng)面組織中β-catenin蛋白在創(chuàng)面造模后第7、14 d表達(dá)增加，GSK-3β蛋白表達(dá)水平下降，但創(chuàng)面造模后第3d各蛋白表達(dá)水平較DU組無(wú)明顯差異，說(shuō)明愈瘍靈軟膏有可能通過(guò)對(duì)Wnt/β-catenin通路進(jìn)行干預(yù)而實(shí)現(xiàn)了促進(jìn)愈合的作用，且這種干預(yù)作用主要體現(xiàn)在創(chuàng)面修復(fù)的后期，即創(chuàng)面愈合的增殖期及重塑期。

DU隸屬于中醫(yī)“脫疽”、“癰疽”的范疇，其病機(jī)為“因虛感邪，邪氣致瘀，瘀久化熱，瘀熱互結(jié)，肉腐致?lián)p”。DU的發(fā)病與血熱、氣血瘀滯關(guān)系最為密切[14-15]。血瘀是貫穿DU始終的關(guān)鍵病機(jī)，血熱是導(dǎo)致潰瘍發(fā)生的直接因素，“瘀”、“熱”是創(chuàng)面難以愈合的主因。針對(duì)于血熱、血瘀而設(shè)的涼血散瘀法成為DU的有效治法。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，我們證實(shí)四妙勇安湯及愈瘍靈軟膏均對(duì)DU大鼠Wnt信號(hào)通路產(chǎn)生作用，但兩者發(fā)揮效用的時(shí)間點(diǎn)并不完全相同，四妙勇安湯側(cè)重于在創(chuàng)面愈合的早期干預(yù)Wnt通路，而愈瘍靈軟膏側(cè)重于在創(chuàng)面愈合的中后期發(fā)揮作用。據(jù)此我們推測(cè)，四妙勇安湯主要影響創(chuàng)面愈合的炎癥階段，而愈瘍靈軟膏主要影響創(chuàng)面愈合的增殖及重塑階段。DU-四妙+愈瘍靈組在創(chuàng)面愈合率、創(chuàng)面肉芽組織病理染色和干預(yù)Wnt通路相關(guān)蛋白及mRNA表達(dá)等方面，均優(yōu)于DU-四妙組及DU-愈瘍靈組，這說(shuō)明內(nèi)服四妙勇安湯配合外用愈瘍靈軟膏治療DU優(yōu)于單獨(dú)內(nèi)服四妙勇安湯或單獨(dú)外用愈瘍靈軟膏。

綜上所述，涼血散瘀法無(wú)論從傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對(duì)DU病因病機(jī)認(rèn)識(shí)的角度，還是從現(xiàn)代分子生物學(xué)對(duì)Wnt信號(hào)通路干預(yù)的角度，均可促進(jìn)DU的愈合，是治療DU的有效治法，且在DU的治療中，應(yīng)內(nèi)治外治并重。