利用SSR標(biāo)記構(gòu)建枸杞品種分子身份證

尹躍 趙建華 安巍 李彥龍 何軍 曹有龍

（寧夏農(nóng)林科學(xué)院國(guó)家枸杞工程技術(shù)研究中心，銀川 750002）

中國(guó)是世界上枸杞生產(chǎn)大國(guó)，2012年枸杞栽培面積和產(chǎn)量分別為1.454×105hm2和2.049×105t，均居世界第一［1］。寧夏是世界枸杞發(fā)源地和正宗原產(chǎn)地，品種資源豐富，現(xiàn)已審定枸杞品種有20個(gè)，收集保存種質(zhì)資源2 000份以上［2］。隨著枸杞品種選育和推廣速度加速，各地品種資源交流更加頻繁，造成同物異名和同名異物現(xiàn)象非常普遍。另外，枸杞品種選育主要采用群體選優(yōu)方式，使得核心骨干親本反復(fù)利用，如從“大麻葉”生產(chǎn)園中先后選育出“寧杞1號(hào)”、“寧杞2號(hào)”、“寧杞4號(hào)”和“精杞4號(hào)”等［3-6］品種，造成品種間遺傳差異變小，遺傳背景狹窄，為枸杞品種的準(zhǔn)確鑒定提出更高的要求。

傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)、同工酶等品種鑒定方法易受環(huán)境的影響，不僅需要具備扎實(shí)的專(zhuān)業(yè)理論知識(shí)，而且耗時(shí)費(fèi)力。隨著DNA分子標(biāo)記技術(shù)快速發(fā)展，SSR標(biāo)記具有共顯性、多態(tài)性高、擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定及重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，已被國(guó)際植物品種保護(hù)聯(lián)盟（UPOV）納入農(nóng)作物品種制定DUS（Distinctness，uniformity，stability）指南內(nèi)容，確定為植物新品種保護(hù)最廣泛應(yīng)用的分子標(biāo)記體系［7］。目前，利用SSR標(biāo)記構(gòu)建了葡萄、梨、棉花、水稻及蘋(píng)果等［8-12］植物分子身份證。

近年來(lái)，基于高通量測(cè)序技術(shù)開(kāi)發(fā)了大量的枸杞SSR引物，篩選出了一批多態(tài)性好的引物。黨少飛等［13］對(duì)大麻葉枸杞進(jìn)行簡(jiǎn)化基因組測(cè)序（RAD-seq），分析了SSR基元分布特點(diǎn)，其中三堿基重復(fù)單元最豐富，占重復(fù)序列總數(shù)的66.5%。王瑛等［14］通過(guò)對(duì)寧夏枸杞和黑果枸杞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序開(kāi)發(fā)了ESTSSR引物，從中篩選出10對(duì)EST-SSR引物可將7個(gè)枸杞品種逐一區(qū)分開(kāi)來(lái)。尹躍等［15］從11對(duì)SSR引物中篩選出4對(duì)引物可將12個(gè)枸杞品種完全區(qū)分開(kāi)來(lái)，構(gòu)建了12個(gè)品種指紋圖譜。邵千順等［16］利用4對(duì)SSR引物構(gòu)建了17份枸杞種質(zhì)的DNA指紋圖譜。Chen等［17］基于枸杞果實(shí)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，開(kāi)發(fā)了一批EST-SSR引物并對(duì)11份枸杞種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析。上述研究主要是基于轉(zhuǎn)錄組和簡(jiǎn)化基因組測(cè)序開(kāi)發(fā)的SSR標(biāo)記，這些標(biāo)記沒(méi)有定位到染色體和連鎖群上，在進(jìn)行枸杞品種鑒定及遺傳多樣性分析時(shí)所反映供試材料的信息不夠全面。然而，基于枸杞全基因組水平的SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用還未見(jiàn)報(bào)道。

本研究是基于枸杞全基因組測(cè)序結(jié)果（未公布）基礎(chǔ)上，從600對(duì)SSR引物中篩選出多態(tài)性高、穩(wěn)定性好、均勻分布在枸杞12條染色體上的24對(duì)引物，以16個(gè)枸杞品種為試材，建立枸杞品種SSR分子身份證，以期枸杞品種鑒定及知識(shí)產(chǎn)權(quán)的保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

所用的16個(gè)枸杞品種（表1），其中包括果用品種14個(gè)和菜用品種2個(gè)，均采自寧夏農(nóng)林科學(xué)院國(guó)家枸杞工程技術(shù)研究中心枸杞種質(zhì)資源圃（38°38′49″N，106°9′10″E）。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取與檢測(cè) 采用試劑盒法（天根，DP320）提取枸杞葉片基因組DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，用BioPhotometer plus核酸蛋白儀（德國(guó)，Eppendorf）測(cè)定DNA濃度和純度，并用滅菌的ddH2O將溶液稀釋至50 ng/μL，用于后續(xù)PCR試驗(yàn)。

1.2.2 引物來(lái)源、設(shè)計(jì)與合成 SSR引物來(lái)源于枸杞全基因組測(cè)序（數(shù)據(jù)未公布）序列所開(kāi)發(fā)，利用Primer Premier5.0軟件隨機(jī)設(shè)計(jì)引物600對(duì)，由ABI公司合成，并分別用FAM（藍(lán)色）和HEX（綠色）2種熒光集團(tuán)修飾上游引物5′端。

1.2.3 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè) PCR擴(kuò)增體系15 μL，含 有 50 ng/μL DNA 模 板 1 μL、10×Buffer 1.5 μL、10 μmol/L dNTP 1.2 μL、5 μmol/L 上游引物 1 μL、5μmol/L 下游引物 0.2 μL、5 μmol/L M13熒光引物0.8 μL、TaqDNA 聚合酶（5 U/μL）0.1 μL 和 ddH2O 9.2 μL。PCR擴(kuò)增在GeneAmp PCR System 9600（Perkin Elmer，USA）儀上進(jìn)行，擴(kuò)增程序?yàn)?4℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，25 個(gè)循環(huán) ；94℃30 s，53℃ 30 s，72℃ 30 s，10個(gè)循環(huán)；最后60℃30 min。

在96孔板中每孔加入分子量?jī)?nèi)標(biāo)和甲酰胺混合液（0.5∶8.5）9 μL，PCR 產(chǎn)物 1.0 μL，95℃變性 3 min，用ABI3730進(jìn)行自動(dòng)熒光檢測(cè)。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 利用GeneMapper4.0軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得不同樣品擴(kuò)增片段長(zhǎng)度。利用SSR數(shù)據(jù)格式轉(zhuǎn)換軟件DataFormater 2.7［18］將擴(kuò)增片段轉(zhuǎn)換為PowerMarker、Popgene和NTSYS輸入文件。利用PowerMarker V 3.25［19］軟件計(jì)算等位基因數(shù)（Number of alleles，NA）、基因型數(shù)（Number of genotype，NG）和多態(tài)信息含量（Polymorphism Information Content，PIC）。利用 Popgene 32 軟件［20］計(jì)算Shannon’s 信息指數(shù)（Shannon’s information index，I）。利用在線條形碼生成器（http://barcode.cnaidc.com/html/BCGcode128.php）構(gòu)建枸杞品種條形碼身份證。

表1 供試16個(gè)品種及分子身份證編碼

2 結(jié)果

2.1 引物篩選

通過(guò)600對(duì)引物對(duì)遺傳背景和表型性狀差異較大2個(gè)品種（寧杞1號(hào)和寧杞菜1號(hào)）進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，最終確定多態(tài)性高且分別位于12條染色體上的24對(duì)SSR引物（表2）用于分子身份證的構(gòu)建。

2.2 SSR引物擴(kuò)增多態(tài)性

24對(duì)引物在16個(gè)枸杞品種中共檢測(cè)到等位基因155個(gè)，每對(duì)引物檢測(cè)到的等位基因在3（LBSSR0480）-10（LBSSR0076 和 LBSSR0112），平均為6.5個(gè)（表3）。24對(duì)引物在16個(gè)枸杞品種中共檢測(cè)到基因型數(shù)208個(gè)，每對(duì)引物檢測(cè)到基因型數(shù)在3（LBSSR0480）-14（LBSSR0112），平均為8.7個(gè)。多態(tài)信息含量（PIC）變幅在0.461（LBSSR01-18）-0.848（LBSSR0338），平均為 0.682。Shannon’s信息指數(shù)變幅在0.939（LBSSR0480）-2.055（LBSSR0112），平均為1.487。表明所篩選出的引物具有較高的多態(tài)性。

2.3 最佳引物組合篩選與指紋圖譜

基于最少引物鑒定最多種質(zhì)的原則。從24對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果中篩選出等位基因數(shù)、基因型數(shù)、PIC值均大于平均值，且Shannon’s信息指數(shù)＞1.7引 物 共 有 6對(duì)， 即 LBSSR0313、LBSSR0338、LBSSR0052、LBSSR0423、LBSSR0076 和LBSSR0112。引物兩兩組合，鑒定其對(duì)供試枸杞品種的區(qū)分率。引物組合LBSSR0052+LBSSR0423鑒定效率最高，可將16個(gè)品種全部區(qū)分開(kāi)來(lái)，區(qū)分率均為100%，其次是引物組合LBSSR0052+LBSSR0112可以鑒定15個(gè)品種，區(qū)分率為93.8%（表4）。利用LBSSR0052和LBSSR0423這2對(duì)SSR引物構(gòu)建供試品種分子身份證。其中，寧杞1號(hào)在這2個(gè)SSR位點(diǎn)指紋圖譜見(jiàn)圖1。

2.4 分子身份證編碼

將供試品種全部區(qū)分開(kāi)的2對(duì)引物L(fēng)BSSR0052和LBSSR0423獲得的等位基因按照小到大的順序排列，并用阿拉伯?dāng)?shù)字01開(kāi)始賦值（表5）。例如，引物L(fēng)BSSR0052對(duì)16個(gè)品種擴(kuò)增共獲得8個(gè)等位基因，最小的為114 bp，賦值為01，依次類(lèi)推，最大的為191 bp賦值08，記為A的位點(diǎn)賦值為09。將每個(gè)品種在2個(gè)位點(diǎn)獲得的等位基因按照賦值數(shù)字編碼獲得每個(gè)品種獨(dú)有的字符串（表1）。

再利用條形碼技術(shù)將每個(gè)品種的按照相同位點(diǎn)順序排列的編碼字符串轉(zhuǎn)化成每個(gè)品種獨(dú)特的條形碼標(biāo)識(shí)即分子身份證（圖2）。

表2 24對(duì)SSR引物信息

3 討論

3.1 分子標(biāo)記的選擇

隨著枸杞全基因組測(cè)序開(kāi)展，構(gòu)建高通量、準(zhǔn)確性高，易操作的覆蓋全基因組的枸杞種質(zhì)資源DNA分子身份證構(gòu)建將越來(lái)越收到重視。一種理想的DNA分子標(biāo)記具有重現(xiàn)性好、多態(tài)性高、易操作、共顯性且覆蓋整個(gè)基因組等特點(diǎn)。DNA分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)展經(jīng)歷了3個(gè)發(fā)展階段：第一階段以雜交為基礎(chǔ)的標(biāo)記（RFLP）；第二個(gè)階段以PCR為基礎(chǔ)的標(biāo)記（RAPD、ISSR和SSR等）；第三階段以單核苷酸為基礎(chǔ)的標(biāo)記（SNP）［21］。近年來(lái)，分子標(biāo)記廣泛應(yīng)用各種物種鑒定，國(guó)際植物品種保護(hù)聯(lián)盟在BMT測(cè)試指南草案中將構(gòu)建DNA指紋數(shù)據(jù)庫(kù)的標(biāo)記確定為SSR和SNP［22］。隨著高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)展，開(kāi)發(fā)了大量的SNP，但由于SNP高額費(fèi)用限制了應(yīng)用。相比較，SSR標(biāo)記成為了最廣泛應(yīng)用的標(biāo)記。本研究是基于枸杞全基因組測(cè)序基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)600對(duì)SSR引物，從中篩選24對(duì)多態(tài)性高的SSR引物，構(gòu)建了16個(gè)枸杞品種的分子身份證。

3.2 SSR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)方法的確定

SSR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)方法主要有兩種：聚丙烯酰胺凝膠銀染技術(shù)和毛細(xì)管電泳熒光標(biāo)記技術(shù)。郝晨陽(yáng)等［23］對(duì)這兩項(xiàng)技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行詳細(xì)的比較，得出熒光標(biāo)記技術(shù)具有高通量、數(shù)據(jù)收集與處理效率高、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、不同實(shí)驗(yàn)室易整合等優(yōu)點(diǎn)。邵千順等［16］利用15對(duì)引物對(duì)17份枸杞種質(zhì)擴(kuò)增，采用采用傳統(tǒng)的銀染技術(shù)，15對(duì)引物的平均Shannon’s信息指數(shù)I為0.311，本研究24對(duì)熒光SSR引物在16個(gè)枸杞品種檢測(cè)到平均Shannon’s信息指數(shù)I為1.487，顯著高于前者。說(shuō)明本研究采用熒光SSR檢測(cè)效率高，數(shù)據(jù)更為精確可靠，為后續(xù)建立枸杞分子指紋數(shù)據(jù)庫(kù)更科學(xué)合理。

表4 兩對(duì)引物組合對(duì)枸杞品種的區(qū)分

圖1 寧杞1號(hào)在2個(gè)SSR位點(diǎn)的SSR指紋圖譜

表5 等位基因賦值標(biāo)準(zhǔn)

圖2 寧杞1號(hào)身份證條形碼

3.3 分子身份證的編碼方法

近年來(lái)，基于SSR標(biāo)記構(gòu)建分子身份證的編碼方法在不斷地創(chuàng)新與發(fā)展，主要有3類(lèi)［9，11-12］：（1）篩選出可以區(qū)分所有種質(zhì)的引物組合，將這些引物擴(kuò)增到的帶型從小到大排序，依次編碼，按照固定引物順序，串聯(lián)帶型編碼，組成一串?dāng)?shù)據(jù)，也就是品種分子身份證；（2）篩選出可區(qū)分所有種質(zhì)的核心引物，將核心引物所獲得等位基因從小到大排序，依次用數(shù)字編碼，組成特有字符串構(gòu)成分子身份證；（3）在第2種方法基礎(chǔ)上進(jìn)行創(chuàng)新，身份證由商品碼、指紋碼和補(bǔ)充碼3部分組成，構(gòu)建身份證信息更加全面，且能真實(shí)反映品種的信息。針對(duì)不同的物種及擴(kuò)增結(jié)果采用相對(duì)應(yīng)的編碼方法。本研究采用第2種方法，從24對(duì)引物中篩選出等位基因數(shù)、基因型數(shù)和PIC值大于平均值，且Shannon’s信息指數(shù)大于1.7，最終確定引物L(fēng)BSSR0052和LBSSR0423組合，可將供試品種全部區(qū)分開(kāi)。將這2對(duì)引物在所有品種擴(kuò)增獲得等位基因由小到大排序，用數(shù)字編碼賦值，構(gòu)建17個(gè)枸杞品種分子身份證，為后續(xù)構(gòu)建枸杞分子指紋數(shù)據(jù)庫(kù)提供合理的科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

這2對(duì)引物組合可區(qū)分全部供試品種。根據(jù)這2對(duì)引物對(duì)所有品種擴(kuò)增獲得等位基因按照由小到大排序，然后將每個(gè)品種在這兩個(gè)SSR位點(diǎn)的賦值依次組合，構(gòu)建16個(gè)枸杞品種的分子身份證。結(jié)果表明SSR標(biāo)記技術(shù)可以作為枸杞品種鑒定和分子身份證構(gòu)建的有效技術(shù)手段。

本研究是基于枸杞全基因組測(cè)序結(jié)果（未公布）基礎(chǔ)上，從600對(duì)SSR引物中篩選出多態(tài)性高、穩(wěn)定性好、均勻分布在枸杞12條染色體上的24對(duì)引物，并對(duì)16個(gè)枸杞品種進(jìn)行SSR擴(kuò)增分析，共檢測(cè)到155個(gè)等位基因，平均為6.5個(gè)和208個(gè)基因型，平均為8.7個(gè)。平均多態(tài)信息含量（PIC）和Shannon’s信息指數(shù)分別為0.682和1.487?；谧钌僖镨b定最多種質(zhì)的原則，需要同時(shí)滿足2個(gè)條件：（1）檢測(cè)到等位基因數(shù)、基因型數(shù)和PIC值均大于平均值，（2）Shannon’s信息指數(shù)＞1.7。最終確定引物L(fēng)BSSR0052和LBSSR0423符合要求，而且