人呼吸道卡他莫拉菌快速檢測膠體金試紙的研制

黃瑩琪 張秋 陶冶 胡征，2，3 張改平 張華山，2，3

（1. 湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，武漢 430068；2. 發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（湖北工業(yè)大學(xué)），武漢 430068；3. 工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430068；4. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，鄭州 450002）

卡他莫拉菌（Moraxella catarrhalis，M. catarrhalis）屬革蘭氏陰性、兼性厭氧雙球菌，是慢性肺病患者中引起下呼吸道感染的重要病原體［1］。該菌不僅引起兒童中耳炎（Otitis media，OM），還引起成年人慢性阻塞性肺疾病（Chronic obstructive pulmonary disease，COPD），甚至?xí)?dǎo)致急性加重感染患者死亡［1-2］。目前已分離出可產(chǎn)生β-內(nèi)酯胺酶的M.catarrhalis臨床菌株，該菌的抗生素耐藥性更令人恐慌［3-4］。由于M. catarrhalis引起的臨床癥狀與其他呼吸道病原體感染類似，因此精確的診斷、對癥用藥是臨床治療的重要環(huán)節(jié)。目前，M. catarrhalis感染的診斷方法主要有血清學(xué)檢測法、核酸檢測法［5］和病原體培養(yǎng)檢測法［6］，但都存在檢測時間長、操作步驟復(fù)雜、成本較高等缺陷，因此尋找快速、簡便且準(zhǔn)確的檢測方法具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)選定M. catarrhalis中具有種屬特異性和保守性的表面抗原蛋白UspA1［7-8］，通過生物信息學(xué)預(yù)測UspA1蛋白胞外結(jié)構(gòu)域單一線性表位，制備UspA1Line-KLH復(fù)合蛋白及重組蛋白UspA1-His多克隆抗體，經(jīng)純化后分別用于膠體金的標(biāo)記及檢測線的包被，采用檸檬酸三鈉還原法制備40 nm膠體金顆粒，建立卡他莫拉菌膠體金試紙條檢測方法，旨在為快速檢測呼吸道病原菌提供檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒 本實(shí)驗(yàn)中所有病原菌株均購自美國菌種保藏中心（ATCC），重組質(zhì)粒pET-28a（+）-uspa1，感受態(tài)細(xì)胞E.coliRosetta（DE3）均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物 免疫用新西蘭大白兔由湖北省疾控中心提供。

1.1.3 主要試劑及耗材 Ni SepharoseTM6 Fast Flow，Sephadex G25（10/350） 購 自 GE healthcare公 司；Protein At Beads 4FF，PabPur Sulfolink Beads購 自Smart公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑均購自Sigma公司；硝酸纖維素膜（CN140）購自Sartorius公司；玻璃纖維（CB08）、聚酯纖維（DL42）、吸水紙（CH37K）和PVC板購自上海良信技術(shù)有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、氯金酸（HAuCl4·3H2O）和檸檬酸三鈉購自國藥集團(tuán)；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG購自武漢博士德生物工程有限公司；牛血清白蛋白（BSA）購自BioFroxx公司；羧基水溶性量子點(diǎn)（12-18 nm）購自武漢珈源量子點(diǎn)技術(shù)開發(fā)有限責(zé)任公司。

1.1.4 生物信息學(xué)分析 UspA1蛋白表面可及性預(yù)測及線性表位預(yù)測均由武漢百意欣生物技術(shù)有限公司提供技術(shù)服務(wù)。

1.2 方法

1.2.1 UspA1蛋白胞外結(jié)構(gòu)域單一線性表位的預(yù)測及合成 利用ABCpred軟件，對UspA1蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)結(jié)構(gòu)分析，選定672-685位（GenBank序列號AAF36416.1）的14個氨基酸組成的短肽NTDRIAKNKAEADA（此序列命名為UspA1Line）作為制備兔抗UspA1蛋白抗體的線性抗原表位，將UspA1Line的N端添加一個半胱氨酸后，用多肽自動合成儀合成多肽并純化，純化后的多肽與載體蛋白KLH偶聯(lián)，形成UspA1Line-KLH復(fù)合蛋白。

1.2.2 重組蛋白UspA1-His的誘導(dǎo)表達(dá)及純化 參照文獻(xiàn)［9］方法，誘導(dǎo)表達(dá)UspA1-His重組蛋白，并用GE公司的His Trap親和層析柱，按照說明書方法得到純化的UspA1-His重組蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

1.2.3 動物免疫實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)［9］方法對新西蘭大白兔進(jìn)行免疫。UspA1-His重組蛋白和UspA1Line-KLH復(fù)合蛋白的首次免疫計量均為1 mg/只，加強(qiáng)免疫計量均為0.5 mg/只。將效價符合要求的新西蘭大白兔經(jīng)頸動脈采血，分離血清，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 UspA1-His重組蛋白多克隆抗體的純化 采用GE公司的rProtein A親和層析柱，按照其說明書收集洗脫液，用磷酸鹽緩沖體系超濾濃縮，得到UspA1-His抗體（AbUspA1-His）。超微量分光光度計測濃度定量，分裝凍干，-80℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 UspA1Line-KLH復(fù)合蛋白多克隆抗體的純化 參照UspA1-His重組蛋白多克隆抗體的純化步驟得到除鹽后的UspA1Line-KLH復(fù)合蛋白抗體。

采用SMART公司的PabPur Sulfolink Beads多肽親和層析柱，按照其說明書偶聯(lián)肽鏈UspA1Line，得到UspA1Line多肽親和層析柱。加入除鹽后的UspA1Line-KLH復(fù)合蛋白抗體，按照說明書純化抗體，得到高純度的UspA1Line抗體（AbUspA1Line），超微量分光光度計測濃度定量，分裝凍干，-80℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 多克隆抗體效價及特異性檢測 采用間接ELISA法測定抗體效價［9］，測定AbUspA1-His和AbUspA1Line對M. catarrhalis的識別能力。根據(jù)450nm 處吸光值（OD450）判斷結(jié)果。判定方法：S/N=（待檢 OD450）/（陰性對照 OD450），S/N＞2.1 為陽性。

利用直接免疫熒光法鑒定AbUspA1-His和AbU-spA1Line對M. catarrhalis抗原的識別能力。按說明書方法用可溶性羧基量子點(diǎn)標(biāo)記AbUspA1-His和AbUspA1Line。以標(biāo)記抗體作為特異性熒光抗體標(biāo)記M. catarrhalis。將標(biāo)記好的菌液固定在載玻片上，滴加Hoechst 33342染料染核。用激光共聚焦顯微鏡觀察M. catarrhalis菌體與量子點(diǎn)標(biāo)記抗體的結(jié)合情況。

1.2.7 膠體金標(biāo)記免疫層析試紙條的制備 采用檸檬酸鈉還原法［10］制備40 nm膠體金。取1 mL制備好的膠體金加2 μL的0.2 mol/L K2CO3調(diào)pH，1 mL膠體金標(biāo)記4 μg AbUspA1Line，標(biāo)記好后離心重懸至100 μL，以0.3 μg/cm的量噴涂于玻璃纖維膜上，37℃鼓風(fēng)干燥箱放置1 h以上。

將上述制備的AbUspA1-His和羊抗兔IgG用磷酸鹽緩沖液調(diào)整至終濃度分別為2.0 mg/mL、0.5mg/mL。將 AbUspA1-His裝以 1.0 μL/cm 的量在硝酸纖維素膜上劃線，形成檢測線；將稀釋好的羊抗兔IgG以 1.0 μL/cm的量在硝酸纖維素膜上劃線作為質(zhì)控線，其與檢測線間距為0.5 cm。硝酸纖維素膜37℃真空干燥12 h以上，制得檢測層，4℃密封干燥保存。

按照圖1對檢測卡進(jìn)行組裝后（結(jié)合處均交接2 mm），用斬切機(jī)將試紙切割成4 mm的試紙條，與干燥劑一同封裝在鋁箔袋內(nèi)保存。

1.2.8 檢測方法與判定標(biāo)準(zhǔn) 將待檢樣品溶于生理鹽水，取150 μL滴在樣品墊上進(jìn)行層析，檢測結(jié)果以10 min為準(zhǔn)。若質(zhì)控線（C線）和檢測線（T線）均顯色，則檢測結(jié)果判定為陽性；若C線顯色，T線不顯色，則檢測結(jié)果判定為陰性；若均不顯色，或只有T線顯色，則說明試紙已失效，結(jié)果無效。

1.2.9 試紙條的性能測定 特異性檢測：用試紙條 分 別 檢 測M. catarrhalis（ATCC 49619）、 肺 炎鏈 球 菌S. pneumoniae（ATCC 25238）、 肺 炎 支 原體M. Pneumonia（ATCC 15531）、流感嗜血桿菌H.influenzae（ATCC 9007）、嗜肺軍團(tuán)菌L. pneumophila（ATCC 33152）等呼吸道常見病原菌稀釋液（10mmol/L PBS將菌體濃度稀釋至1×108CFU/mL），鑒定試紙條的特異性。

圖1 膠體金檢測卡組裝圖

靈敏性測試：將M. catarrhalis用10 mmol/L PBS分別稀釋至 1×109、1×108、1×107、1×106、1×105及1×104CFU/mL，觀察陽性結(jié)果的最低菌濃度。

短期穩(wěn)定性測試：將同一批次的試紙條置于55℃儲存，每2 d用陽性樣本進(jìn)行檢測，同時將該批次的試紙條進(jìn)行3次冷凍到復(fù)融的循環(huán)，用陽性樣本進(jìn)行檢測。每個樣品檢測3次以觀察穩(wěn)定性和重復(fù)性。

穩(wěn)定性和重復(fù)性測試：將3個不同批次的試紙條置于24℃儲存6個月，每30 d用陽性樣本和陰性樣本進(jìn)行檢測，且每個樣本檢測3次以觀察穩(wěn)定性和重復(fù)性。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白UspA1-His的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

重組質(zhì) 粒pET-28a（+）-uspa1轉(zhuǎn)化至E.coliRosetta（DE3）后，37℃經(jīng)IPTG過夜誘導(dǎo)表達(dá)，將收集的菌體超聲破碎，取上清和沉淀進(jìn)行SDSPAGE電泳。由圖2可知，在約24 kD處有明顯的條帶，大小與預(yù)期相符，誘導(dǎo)表達(dá)成功，目的蛋白以可溶的形式存在在上清中。

重組蛋白經(jīng)鎳柱親和純化，收集洗脫峰。由圖3可知，含40 mmol/L咪唑和含100 mmol/L咪唑的洗脫液可將目標(biāo)蛋白洗脫且純度達(dá)90%以上。經(jīng)超濾管濃縮，洗去咪唑后，測定濃度為0.56 mg/mL，總量超過7.8 mg。

圖2 重組蛋白的SDS-PAGE分析

圖3 親和純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

2.2 多克隆抗體的效價

采用間接ELISA法測定抗體的效價。在1∶512 000稀釋度 下，AbUspA1Line和AbUspA1-His的S/N值為13.529、11.838，數(shù)值均大于2.1，抗體滴度均達(dá)到1∶512 000（圖4）。

2.3 多克隆抗體的特異性

用激光共聚焦顯微鏡觀察到羧基量子點(diǎn)標(biāo)記的抗體可特異性識別M. catarrhalis（圖5）。

圖4 間接ELISA法測定抗體效價

圖5 免疫熒光法測抗體特異性

2.4 膠體金試紙?zhí)禺愋詼y試

檢測M. catarrhalis的試紙條，C線和T線均顯色，結(jié)果為陽性；陰性對照及其他呼吸道常見病原菌（如肺炎鏈球菌、肺炎支原體、流感嗜血桿菌、嗜肺軍團(tuán)菌）檢測結(jié)果（圖6）均為陰性，說明制備的M.catarrhalis檢測試紙條特異性較高。

圖6 卡他莫拉菌膠體金免疫層析試紙條的特異性檢測

2.5 膠體金試紙靈敏性測試

結(jié)果（圖7）表明，制備的試紙條可檢測菌濃度為1×106CFU/mL的M. catarrhalis稀釋液。

圖7 卡他莫拉菌膠體金免疫層析試紙條的靈敏性檢測

2.6 膠體金試紙短期穩(wěn)定性測試

結(jié)果（圖8）表明，55℃儲存4 d試紙條的靈敏性與新制備的試紙條相比無差別，儲存6 d后檢測線顯色變淺。經(jīng)3次冷凍到復(fù)融循環(huán)的試紙條與新制備的試紙條檢測無差別。

圖8 卡他莫拉菌膠體金免疫層析試紙條的短期穩(wěn)定性檢測

2.7 膠體金試紙穩(wěn)定性和重復(fù)性測試

將試紙條在24℃儲存6個月后，其特異性和靈敏性與新制備的試紙條相比無差別，且平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定。

3 討論

M. catarrhalis作為引起兒童中耳炎和成人慢性肺阻塞疾病的重要病原菌，它不僅單獨(dú)致病，同時會與其他病原微生物共同作用，導(dǎo)致病情的加重及交叉感染［11-13］。由于M. catarrhalis會產(chǎn)生 β-內(nèi)酰胺酶，所以其對β-內(nèi)酰胺抗生素敏感的細(xì)菌如肺炎鏈球菌等提供保護(hù)，使得患者嚴(yán)重感染并加大治療難度［14-15］。據(jù)統(tǒng)計，在美國，每年治療OM的成本約3-5億美元，而每年治療COPD的成本為約3萬美元/人，快速診斷和精確用藥尤為重要［16］。目前臨床診斷M. catarrhalis感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”為病原體培養(yǎng)檢測法［17］。但是檢測時間過長，不能及時指導(dǎo)治療，導(dǎo)致患者病情加重或出現(xiàn)過度用藥的情況。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)雖可檢測卡他莫拉菌，但靈敏度極高，易出現(xiàn)假陽性，不能作為感染診斷依據(jù)［18-19］。因此，尋找檢測快速、操作簡單、特異性高的檢測方法具有重要意義。

本研究以M. catarrhalis標(biāo)準(zhǔn)菌株為研究對象，經(jīng)結(jié)構(gòu)生物學(xué)分析迅速找到了UspA1蛋白上14個氨基酸組成的M. catarrhalis表面抗原的單一線性抗原表位，偶聯(lián)KLH后免疫新西蘭兔子，得到抗血清。通過Protein A親和層析和多肽親和層析兩步來純化抗體，提高了多克隆抗體的特異性，使之達(dá)到了接近單克隆抗體的效果。將其作為金標(biāo)抗體與膠體金顆粒結(jié)合，特異性識別菌體表面UspA1蛋白胞外結(jié)構(gòu)域中線性抗原決定簇，用識別菌體不同表面表位的AbUspA1-His捕獲菌體，形成雙抗體夾心，使T線出現(xiàn)肉眼可見的顏色反應(yīng)，無假陽性且與其他呼吸道常見病原菌無交叉反應(yīng)，可檢測呼吸道感染病人呼吸道內(nèi)是否存在M. catarrhalis大量增殖。

本研究建立的雙抗夾心免疫層析法可在10 min內(nèi)得到準(zhǔn)確結(jié)果，相較于其他傳統(tǒng)檢測M. catarrhalis的方法，具有快速、簡便、特異、靈敏的特點(diǎn)，不需要專業(yè)人員的培訓(xùn)和昂貴的儀器設(shè)備，尤其適用于醫(yī)院對吸道感染病人的實(shí)時診斷。由于呼吸道感染常伴隨多種細(xì)菌合并感染［20］，該方法不受其他病原菌的干擾，可為之后的呼吸道病原菌快速的檢測提供參考。

4 結(jié)論

本研究經(jīng)結(jié)構(gòu)生物學(xué)分析迅速找到了M.catarrhalis特異性表面蛋白UspA1上由14個氨基酸組成的單一線性抗原表位，偶聯(lián)KLH后免疫新西蘭兔子，得到抗血清。通過Protein A親和層析和多肽親和層析兩步純化抗體，得到特異性識別菌體表面UspA1蛋白胞外結(jié)構(gòu)域中線性抗原決定簇的抗體AbUspA1Line，用識別菌體不同表面表位的AbUspA1-His捕獲菌體，形成雙抗體夾心，成功研制出可快速檢測卡他莫拉菌的膠體金試紙。