金屬-有機(jī)骨架介導(dǎo)的功能核酸檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

李舒婷 賀萬崇 許文濤，2

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2. 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)（食用）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

金 屬-有 機(jī) 骨 架（Metal-organic frameworks，MOFs）也稱為配位聚合物（Coordination polymers，CPs）或配位網(wǎng)絡(luò)，是一類由金屬離子或簇與有機(jī)連接基團(tuán)在相對(duì)溫和的條件下自組裝形成的混合材料［1-3］。胺、羧酸、硝酸鹽、磺酸鹽和磷酸鹽等是最為常用的有機(jī)配體，其中，陰離子羧酸鹽與金屬離子的結(jié)合性更高［4］。MOFs屬于一種新興的結(jié)晶分子功能材料，特性包括：超高的孔隙率，優(yōu)異的結(jié)構(gòu)可調(diào)性，巨大的內(nèi)部表面積，結(jié)構(gòu)多樣性，高的化學(xué)穩(wěn)定性和強(qiáng)大的熱穩(wěn)定性等［5-6］。MOFs的結(jié)構(gòu)可以從一維（1D）、二維（2D）到三維（3D）［7］。MOFs中的有機(jī)配體通常含有共軛π-電子系統(tǒng)，允許通過π-π相互作用與單鏈DNA（ssDNA）結(jié)合，這種機(jī)制類似于氧化石墨烯（GO）和生物分子之間的相互作用［8］。如今，MOFs已被廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥等各個(gè)領(lǐng)域，其中包括均相催化、氣體儲(chǔ)存與分離、作為藥物遞送載體、生物成像等。

功能核酸（Functional nucleic acids，F(xiàn)NA）分為天然和人工合成兩種，其中，天然FNA包括核酶、核糖開關(guān)等，人工合成FNA包括脫氧核酶、核酶、適配體及G-四鏈體等［9］。FNA除了具有催化功能外，也能夠與適配體進(jìn)行有效結(jié)合［10］，其中適配體可特異性的識(shí)別非靶核酸物質(zhì)［11］。

到目前為止，雖然已有將MOFs應(yīng)用于檢測(cè)領(lǐng)域的相關(guān)報(bào)道，但將MOFs與FNA相結(jié)合的檢測(cè)技術(shù)卻相對(duì)較少，且主要集中在熒光生物傳感器和電化學(xué)生物傳感器這兩大類，其他類型的生物傳感器包括比色生物傳感器，化學(xué)發(fā)光傳感器等鮮有報(bào)道。在熒光生物傳感器中，研究者主要應(yīng)用MOFs的熒光淬滅特性；而在電化學(xué)生物傳感器中，MOFs一般具有固定FNA和信號(hào)放大雙重功能?；贛OFs如此多優(yōu)異的特性和FNA靈活多樣的特點(diǎn)，MOFs介導(dǎo)的功能核酸檢測(cè)技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用潛能。

1 金屬-有機(jī)骨架的基本特性及特點(diǎn)

1.1 金屬-有機(jī)骨架的基本屬性

MOFs作為一種配位聚合物具有很多特點(diǎn)。其大小從幾十納米到幾十微米不等，結(jié)構(gòu)多樣，可以從1D、2D到3D，但大部分為2D和3D結(jié)構(gòu)，形狀也可為鏈狀、片狀、網(wǎng)絡(luò)狀、立方體、雙錐形等［7，12-14］。 許多 MOFs對(duì)染 料 標(biāo)記 的 單鏈 DNA（ssDNA）表現(xiàn)出明顯的熒光淬滅能力［2］。Wang等［15］在將染料標(biāo)記的DNA與MOFs進(jìn)行結(jié)合并對(duì)MOFs的熒光淬滅特性進(jìn)行研究時(shí)指出，在適配體傳感器中，納米 MOFs（Nanoscale MOFs，NMOFs）的表面性質(zhì)對(duì)帶電染料分子的熒光變化起著重要的作用。帶正電荷和負(fù)電荷的NMOFs對(duì)于帶負(fù)電荷的羧基熒光素（FAM）標(biāo)記的雙鏈DNA（dsDNA）表現(xiàn)出完全相反的熒光猝滅性質(zhì)；相反，它們對(duì)帶正電荷的四甲基若丹明標(biāo)記的dsDNA的影響可以忽略。MOFs的修飾能力較強(qiáng)，Lei等［6］指出，MOFs需要一些額外的功能才能實(shí)現(xiàn)特定的分子識(shí)別，并總結(jié)了3種不同的方法來更容易地修飾MOFs并賦予它們特定的功能：一是修改MOFs框架中的特定有機(jī)配體或摻雜金屬離子；二是后合成修飾，其中具有官能團(tuán)的有機(jī)配體可用于隨后的化學(xué)嫁接；三是將功能性分子和納米粒子包埋在框架內(nèi)，其復(fù)合物具有用于分子識(shí)別和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的多功能性。最近，Mejia-Ariza等［16］開發(fā)了利用共價(jià)或非共價(jià)相互作用對(duì)MOFs（MIL-88A）進(jìn)行表面官能化的通用方法。其中一種是通過使用3-疊氮基-7-羥基香豆素在炔基官能化的MIL-88A表面利用CuI催化的點(diǎn)擊反應(yīng)實(shí)現(xiàn)共價(jià)官能化得到了香豆素-MIL-88A。而另一種則是利用鏈霉親和素介導(dǎo)的非共價(jià)鏈霉親和素-生物素相互作用將生物素-肽核酸（Peptide nucleic acids，PNA）與生物素官能化的MIL-88A連接起來，這使得ssDNA可以與PNA形成雙鏈從而選擇性的結(jié)合到MOFs表面。

除了上述性質(zhì)外，部分MOFs還具有發(fā)光特性［17］和催化性［18］。2011 年，Ranocchiari等［18］對(duì) MOFs催化劑類型進(jìn)行了歸類：骨架上具有活性位點(diǎn)的催化劑、包封了活性物質(zhì)的催化劑以及通過后合成修飾連接了活性位點(diǎn)的催化劑。對(duì)于MOFs的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性，Colombo等［19］使用新的三角形三吡唑分子 1，3，5-三（1H-吡唑-4-基）苯（H3BTP）與過渡金屬醋酸鹽構(gòu)建了M3（BTP）2型（M=Co，Ni，Cu，Zn）微孔骨架，均表現(xiàn)出優(yōu)異的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性，尤其是Ni3（BTP）2。

1.2 金屬-有機(jī)骨架的制備方法

制備MOFs的方法有多種，目前最常用的制備方法是溶劑熱或水熱法。但大多數(shù)研究者在制備過程中一般都將二甲基甲酰胺（DMF）作為形成MOFs反應(yīng)的基質(zhì)，用對(duì)苯二甲酸或氨基對(duì)苯二甲酸與含有金屬離子的硝酸鹽或氯化鹽作為反應(yīng)底物來制備所需要的MOFs或氨基官能化MOFs。

Morris等［20］利用溶劑熱法合成了粒徑大小分別為540、19和 14 nm的3種 MOFs（UiO-66-N3），并通過在合成過程中改變乙酸的量來調(diào)整晶體的大小。Mondal等［21］利用鑭系金屬元素鏑通過水熱法構(gòu)建了一種 Dy-MOFs。2016 年，Giménez-Marquès等［22］綜述了對(duì)NMOFs的合成方法。他們指出在水/溶劑熱合成法中控制NMOFs尺寸大小的首要參數(shù)是溫度、反應(yīng)時(shí)間、pH和化學(xué)計(jì)量比。利用微波和超聲波輔助合成可以加快MOFs的結(jié)晶過程。而機(jī)械化學(xué)法是一種自上而下的方法，包括將大型的MOFs晶體合成后再機(jī)械研磨。在微乳液合成法中，反膠束技術(shù)使用了微乳液，使兩種不混溶的液體在乳化劑或表面活性劑的存在下成為熱力學(xué)穩(wěn)定的分散體；這些微乳液可被看作是納米結(jié)構(gòu)的化學(xué)反應(yīng)器，將MOFs的合成限制在納米尺度內(nèi)。

1.3 金屬-有機(jī)骨架的晶體結(jié)構(gòu)表征

研究者在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前，一般先對(duì)MOFs的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。MOFs的化學(xué)組成可通過X射線能量色散譜和X射線光電子能譜進(jìn)行測(cè)定［23］。通過單晶X射線衍射分析可以精確計(jì)算MOFs的晶格參數(shù)得到其晶體結(jié)構(gòu)，再輔助粉末X射線衍射、紫外-可見吸收光譜以及熒光光譜等進(jìn)一步確定其空間及化學(xué)結(jié)構(gòu)；紅外光譜（Infrared spectrum，IR）可用來分析MOFs中含有的官能團(tuán)，熱重分析則用于測(cè)定其穩(wěn)定性［24］。膠體穩(wěn)定性可以通過動(dòng)態(tài)光散射進(jìn)行測(cè)量［20］。BET表面積分析則可確定MOFs的表面面積和孔徑分布情況［25］。

1.4 金屬-有機(jī)骨架常見的應(yīng)用領(lǐng)域

MOFs目前的應(yīng)用較為廣泛：催化、氣體儲(chǔ)存與分離、作為藥物遞送載體及生物成像等。

1.4.1 金屬-有機(jī)骨架用于生物成像 現(xiàn)在，MOFs也逐漸被研究者用于生物成像以實(shí)現(xiàn)癌癥治療，但基本都采用納米級(jí)MOFs。Wang等［2］指出如果MOFs晶體的尺寸縮小到納米尺寸，形成的NMOFs可以用作體內(nèi)成像劑。而且，NMOFs本質(zhì)上是可生物降解的，使得在預(yù)定任務(wù)完成后可以快速降解和清除。Foucault-Collet等［26］構(gòu)建了一個(gè)獨(dú)特的近紅外光譜（Near-infrared spectroscopy，NIR）發(fā)射納米級(jí)MOFs（nano-Yb-PVDC-3），其中摻入了高密度的

鑭系陽離子Yb3+和衍生自亞苯基的敏化劑亞苯基亞乙烯基二羧酸酯（PVDC）。nano-Yb-PVDC-3可以進(jìn)入到活細(xì)胞中進(jìn)行NIR成像。Cai等［27］在NMOFs（MIL-100（Fe））表面結(jié)合透明質(zhì)酸（HA），孔中加載有機(jī)熒光燃料吲哚菁綠（ICG），構(gòu)建了一個(gè)多功能納米平臺(tái)MOF@HA@ICG NPs用于多模式成像引導(dǎo)的癌癥治療（圖1）。這種MOF@HA@ICG NPs顯示出低細(xì)胞毒性，高ICG負(fù)載能力和靶向MCF-7細(xì)胞/移植腫瘤的能力。使用MOF@HA@ICG NPs實(shí)現(xiàn)了熒光成像、光聲成像和T2加權(quán)核磁共振成像（Magnetic resonance imaging，MRI）共同引導(dǎo)的光熱療法，在體外能顯著誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞死亡并能有效地抑制體內(nèi)MCF-7腫瘤的生長(zhǎng)。Ryu等［28］則將試鹵靈和若丹明6G分別加載在NMOFs：MOF-801和UiO-67 的孔中用于FL83B（人類肝細(xì)胞）和HepG2（人類肝細(xì)胞癌）的熒光成像。Wang等［23］在NMOFs（UiO-66）存在下，通過多組分Passerini反應(yīng)將NIR染料藍(lán)色素（Cy），鄰硝基苯甲醛和1，6-二異氰酸酯聚合得到MOFs@聚合物復(fù)合材料UiO-66@CyP。這種方法將其他含有功能性羧基，醛和異氰基的治療劑或成像劑整合到MOFs上，使得UiO-66@CyP復(fù)合物具有強(qiáng)烈的NIR吸收，可用于體外和體內(nèi)的熒光成像引導(dǎo)的光熱癌治療。最近，Qin等［29］利用兩性羧酸鹽配體制備和結(jié)構(gòu)鑒定了兩種水穩(wěn)定性的MOFs，這兩種MOFs都表現(xiàn)出良好的r1弛豫率和T1加權(quán)成像，能夠?qū)崿F(xiàn)高分辨率MRI，且對(duì)人體的胚胎腎細(xì)胞系毒性非常低。

1.4.2 金屬-有機(jī)骨架用于催化、氣體吸附、藥物遞送等 Han等［7］選擇路易斯酸性的Ln3+和Zn2+離子作為連接體，4，4′-聯(lián)吡啶 -N，N′-二氧化物（dpdo）作為較長(zhǎng)的間隔配體構(gòu)建了MOFs，并選擇多元磷鎢酸作為客體，經(jīng)一步水熱法組裝了5種從1D到3D的穩(wěn)健的POM/MOFs材料用于催化DNA模型雙（對(duì)硝基苯基）磷酸（BNPP）中磷酸二酯鍵的水解，并且這5種聚合物都具有高的催化活性。Li等［30］采用“一鍋法”自組裝制備了兩種具有過氧化物酶催化活性的卟啉@MOFs型（CuTNPP@MOF，MnTNPP@MOF）催化劑，這種催化劑加強(qiáng)了單獨(dú)CuTNPP的催化性能，并使原本不具有催化性能的MnTNPP具有一定的催化能力。Zhang等［17］用一種新的配體1，4-二（1-甲基-5，6-二羧基苯并咪唑）苯（H4L）制備了兩種MOFs，這兩種MOFs均具有強(qiáng)烈的CO2吸附能力，可用于捕獲填埋氣中CO2分子。Ghorbani-Kalhor等［31］設(shè)計(jì)了一種磁性MOFs納米復(fù)合材料用于嬰幼兒食品中Cd2+、Zn2+和Pb2+的測(cè)定。He等［32］將順鉑前體藥物通過封裝加載到NMOFs（UiO）孔洞中，而沉默RNA（silencing RNA，siRNA）則通過與NMOFs表面上的金屬位點(diǎn)配位固定到MOFs上形成siRNA/UiO-Cis復(fù)合物實(shí)現(xiàn)藥物和基因的共遞送。

圖1 MOF@HA@ICG NPs的合成并用于多模式成像引導(dǎo)的PTT示意圖［27］

2 金屬-有機(jī)骨架結(jié)合功能核酸的方法及其介導(dǎo)的生物傳感器

將FNA固定在MOFs上的方式有共價(jià)相互作用和非共價(jià)相互作用。Guo等［8］將MOFs（MIL-101）用于DNA高靈敏檢測(cè)時(shí)使MIL-101通過π-π堆積和靜電相互作用與探針DNA相結(jié)合。在MOFs結(jié)構(gòu)中，有機(jī)配體通常都含有共軛π-電子系統(tǒng)，可以利用π-π相互作用與ssDNA進(jìn)行結(jié)合，這種結(jié)合機(jī)制類似于GO和生物分子之間的相互作用。Zhu等［33］則將熒光探針DNA通過核酸堿基與MOFs（Cu（H2dtoa））之間的疏水相互作用以及π-π堆積相互作用固定在MOFs上。Zhang等［34］利用氨基官能化的MOFs作為DNA檢測(cè)的熒光傳感平臺(tái)時(shí)，ssDNA除了通過π-π堆積與MOFs進(jìn)行連接外，ssDNA中的芳香族核苷酸堿基還能夠與NH2之間形成氫鍵，此氫鍵的形成加強(qiáng)了該傳感平臺(tái)對(duì)堿基錯(cuò)配的DNA序列的識(shí)別能力，提高了檢測(cè)靈敏度。Mondal等［21］在對(duì)MOFs與小牛胸腺DNA（CT-DNA）之間的相互作用進(jìn)行探究時(shí)指出，該MOFs配體結(jié)構(gòu)中的芳香環(huán)與CT-DNA溝的螺旋圈匹配緊密，并且在Tris-HCl緩沖液中，配體的芳香環(huán)通過在DNA溝槽中與DNA形成范德瓦爾斯接觸或氫鍵而發(fā)生相互作用。Song等［35］基于MOFs（MnDMS）納米片結(jié)合雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Hybridization chain reaction，HCR）進(jìn)行細(xì)胞間DNA和microRNA（miRNA）傳感時(shí)指出，核酸堿基與MnDMS表面之間的范德華力將發(fā)卡探針DNA固定在納米片上。此外，還可以通過點(diǎn)擊化學(xué)的方法將ssDNA固定在MOFs表面［12］。2014年，Morris等［20］在用寡核苷酸對(duì)MOFs的表面進(jìn)行共價(jià)官能化時(shí)，利用點(diǎn)擊反應(yīng)將二芐基環(huán)辛炔官能化的DNA固定在修飾有疊氮化物的MOFs表面形成第一個(gè)MOF納米顆粒-核酸綴合物。

2.1 金屬-有機(jī)骨架功能核酸熒光生物傳感器

由于大多數(shù)的MOFs具有內(nèi)在熒光淬滅能力，能將DNA探針上標(biāo)記的熒光基團(tuán)淬滅［13］。因此，許多研究者將MOFs與功能核酸結(jié)合運(yùn)用到熒光生物傳感器中對(duì)DNA、RNA以及其他生物分子或金屬離子等進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè)。2013年，Zhu等［33］首次提出將MOFs作為傳感平臺(tái)用于生物分子的檢測(cè)，其檢測(cè)原理如圖2所示。研究者以Cu2+為配位中心，以二硫代草酰胺為橋連配體合成了一種2D結(jié)構(gòu)的MOFs（N，N’-雙（2-羥乙基）二硫代草酰胺銅（II）［Cu（H2dtoa）］），并將連接有FAM的熒光探針DNA通過核酸堿基與Cu（H2dtoa）之間的疏水相互作用和π-堆積相互作用固定在MOFs上，由于Cu（H2dtoa）的光致電子轉(zhuǎn)移（Photoelectron transfer，PET）熒光淬滅機(jī)制使FAM的熒光淬滅；當(dāng)靶物質(zhì)出現(xiàn)時(shí)與MOFs上的探針DNA結(jié)合，使得連接有FAM的探針DNA從MOFs上脫離到溶液中，F(xiàn)AM恢復(fù)熒光，通過測(cè)定溶液的熒光強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)對(duì)HIV DNA和凝血酶（TB）高靈敏和高選擇性的定量測(cè)定。同年，其團(tuán)隊(duì)Wei等［5］同樣將連接有H5N1抗原的熒光探針DNA（FAM-DNA）與MOFs（H2dtoaCu）非共價(jià)結(jié)合構(gòu)建了熒光生物傳感器用于人類血清中H5N1抗體的檢測(cè)，此種方法避免了熒光恢復(fù)過程中ssDNA的雜交步驟，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)過程，檢測(cè)限為1.6×10-9mol/L。隨后，其團(tuán)隊(duì)Chen等［1］又將基于MOFs（H2dtoaCu）的熒光生物傳感器用于dsDNA特異性序列的識(shí)別。Ye等［13］也基于該熒光傳感原理首次將MOFs用于多重DNA檢測(cè)。Tian等［36］基于Fe-MOFs納米棒（MIL-88B）構(gòu)建傳感平臺(tái)用于DNA檢測(cè)時(shí)，首次證明了金屬中心和有機(jī)連接體的協(xié)同作用可以大大提高整體熒光傳感特性。且在實(shí)驗(yàn)過程中，整個(gè)“混合和檢測(cè)”過程只需要4 min，檢測(cè)限是10 pmol/L，幾乎是同類傳感器中最低的。

在 2014年，Guo等［8］將MOFs（MIL-101）作為熒光各向異性（Fluorescence anisotropy，F(xiàn)A）擴(kuò)增平臺(tái)，根據(jù)熒光基團(tuán)的各向異性與其旋轉(zhuǎn)弛豫時(shí)間成正比，而旋轉(zhuǎn)弛豫時(shí)間又取決于其分子體積；較小的分子旋轉(zhuǎn)得更快，F(xiàn)A值較小，而較大的分子由于它們限制旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)而具有較大的FA值的原理，通過FA值的變化來對(duì)HIV-1 DNA進(jìn)行檢測(cè)。其中，MIL-101與含有FAM的探針DNA結(jié)合，F(xiàn)AM的FA值較大；當(dāng)靶標(biāo)DNA出現(xiàn)時(shí)，與探針DNA雜交從MIL-101上脫離，F(xiàn)AM的FA值變小。Fang等［37］同樣將MIL-101作為低背景信號(hào)和FA放大平臺(tái)，設(shè)計(jì)了雙模式DNA“INHIBIT”邏輯門，用于Hg2+和I-檢測(cè)，檢測(cè)限分別為10.5、8.66 nmol/L和13、17.4 nmol/L，相對(duì)較低。

圖2 Cu（H2dtoa）結(jié)構(gòu)和傳感平臺(tái)檢測(cè)原理［33］

最 近，Weng等［38］使 用 Eu3+@Bio-MOF-1和FAM標(biāo)記的ssDNA（FAM-ssDNA）構(gòu)建了一種新的熒光傳感器用于檢測(cè)Cu2+和S2-。通過調(diào)節(jié)Eu3+@Bio-MOF-1和FAM-ssDNA的比例，獲得了一種FAM和Eu3+能同時(shí)發(fā)光的雜化材料。當(dāng)Cu2+存在時(shí)可以使FAM發(fā)光淬滅，而Eu3+的發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)，隨后加入S2-，隨著S2-濃度的升高，Eu3+的發(fā)光強(qiáng)度又逐漸降低。Chen等［12］構(gòu)建了兩種刺激響應(yīng)性核酸功能化NMOFs作為抗癌藥物或熒光探針的載體。其中，第二種是金屬離子（Mg2+或Pb2+）響應(yīng)的NMOFs系統(tǒng)，該系統(tǒng)原理如圖3所示。金屬離子依賴性脫氧核酶作用的DNA序列作為鎖定單元，在各自的金屬離子存在的情況下，核酸鎖定單元被解離，導(dǎo)致加載的貨物分子釋放。當(dāng)NMOFs孔內(nèi)加載的是熒光染料時(shí)，可通過溶液的熒光強(qiáng)度來判斷金屬離子的含量，這為金屬離子的檢測(cè)提供了一種通用方法。此外，可在NMOFs系統(tǒng)中通過同時(shí)加載不同的熒光染料和分別使用不同金屬離子解鎖的核酸作為鎖定單元，從而實(shí)現(xiàn)金屬離子的多重分析。He等［39］則基于MOFs（MIL-101）平臺(tái)，將定向酶促水解增進(jìn)的熒光擴(kuò)增策略用于TB和氧四環(huán)素的定量測(cè)定。不久前，Xie等［40］基于兩性羧酸鹽配體設(shè)計(jì)了一種3D水溶性Cu-MOFs作為傳感平臺(tái)，并分別采用FAM和5（6）-羧基羅丹明，三乙基銨鹽兩種熒光基團(tuán)標(biāo)記的ssDNA作為探針，實(shí)現(xiàn)了對(duì)登革熱和塞卡病毒RNA序列的同步熒光檢測(cè)，檢測(cè)限分別為184和121 pmol/L。

圖3 金屬離子刺激響應(yīng)性核酸功能化NMOFs系統(tǒng)［12］

2.2 金屬-有機(jī)骨架功能核酸電化學(xué)生物傳感器

研究者在將MOFs與功能核酸結(jié)合運(yùn)用到電化學(xué)生物傳感器中來檢測(cè)各種物質(zhì)時(shí)，為了提高靈敏度，往往會(huì)采用一些信號(hào)放大策略來增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)，例如：級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)、切口酶輔助信號(hào)擴(kuò)增、循環(huán)鏈置換DNA聚合（Circular strand-replacement DNA polymerization，CSRP）等。

2015年，Ling等［41］采用一鍋封裝法將鐵-卟啉封裝在MOFs中形成FeTCPP@MOF使MOFs具有催化性，在H2O2存在下可催化鄰苯二胺（O-PD）轉(zhuǎn)化為2，2′-二氨基偶氮苯（O-PDox）；并利用發(fā)卡DNA的變構(gòu)設(shè)計(jì)了一種電化學(xué)傳感器用于DNA的檢測(cè)，檢測(cè)范圍跨越了6個(gè)數(shù)量級(jí)，檢測(cè)限為0.48 fmol/L。在同年，Ling和其團(tuán)隊(duì)［42］又利用鏈酶親和素功能化的鋯-卟啉MOFs（PCN-222@SA）和三螺旋分子開關(guān)的電催化作用用于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研發(fā)了一種電化學(xué)DNA傳感器。如圖4，該傳感器中加入了核酸外切酶Ⅲ用于DNA循環(huán)擴(kuò)增，檢測(cè)范圍又增大了一個(gè)數(shù)量級(jí)，檢測(cè)限降低到0.29 fmol/L。

圖4 基于PCN-222@SA復(fù)合物構(gòu)建電化學(xué)傳感器用于DNA 的檢測(cè)［42］

2017年，Zhou等［43］基于葡萄糖氧化酶（GOx）驅(qū)動(dòng)的級(jí)聯(lián)催化放大，用Pt納米粒子（PtNPs）、CEA適配體（Apt2）、氯高鐵血紅素和GOx功能化的 Cu-MOFs（Pt@CuMOFs-hGq-GOx），提出了一種靈敏度高的蛋白質(zhì)（癌胚抗原，CEA作為測(cè)試模型）電化學(xué)阻抗傳感器。在實(shí)驗(yàn)中加載到Pt@CuMOFs上的Apt2與氯高鐵血紅素結(jié)合形成具有類過氧化物酶活性的氯高鐵血紅素@G-四鏈體（hGq）。通過靶標(biāo)CEA和CEA適配體（Apt1（固定在電極上）和Apt2）的三明治式反應(yīng)，將獲得的Pt@CuMOFs-hGq-GOx作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)探針（STPs）捕獲到修飾電極界面。當(dāng)引入3，3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）和葡萄糖時(shí)，GOx引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，催化葡萄糖氧化，原位生成H2O2；同時(shí)，Pt@CuMOFs和hGq作為協(xié)同過氧化物催化劑，伴隨著DAB的顯著氧化過程和非導(dǎo)電不溶性沉淀物（IPs）的形成，促進(jìn)了生成的H2O2的分解。因此，所得到的傳感界面中的電子轉(zhuǎn)移被有效阻止，并且電化學(xué)阻抗信號(hào)（EIS）被有效放大。通過EIS來定量測(cè)定CEA的含量。Yang等［44］利用一個(gè)改進(jìn)的靶標(biāo)觸發(fā)的切口酶信號(hào)放大策略作為信號(hào)增強(qiáng)劑并結(jié)合PtPd納米粒子修飾的電活性鈷金屬有機(jī)骨架（Co-MOFs/PtPdNPs）作為氧化還原介體獲得了一個(gè)靈敏的電化學(xué)TB生物傳感器，線性范圍是1 pmol/L-30 nmol/L，檢測(cè)限為0.32 pmol/L。Xu等［45］將富含G（鳥嘌呤核糖核苷酸）的鉛離子特異性適配體作為Pb2+識(shí)別探針，用AgPt納米顆粒裝飾的MOFs（MIL-101（Fe））作為電化學(xué)探針和信號(hào)增強(qiáng)劑構(gòu)建了無酶、無標(biāo)記的電化學(xué)傳感器來檢測(cè)Pb2+含量。在此之前，其團(tuán)隊(duì)Shen等［46-47］也分別基于Cu-MOFs和Ce-MOFs構(gòu)建了兩種電化學(xué)傳感器來檢測(cè)脂多糖的含量，檢測(cè)限分別為0.33和3.3 fg/mL。

Chen等［48］首次把攜帶不同金屬離子（Pb2+和Cd2+）的納米規(guī)模的MOFs作為電化學(xué)信標(biāo)用于卡那霉素和氯霉素這兩種抗生素的同時(shí)檢測(cè)，檢測(cè)限分別為0.16 pmol/L和0.19 pmol/L，比酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（Enzyme linked immune sorbent assay，ELISA）低了3-4個(gè)數(shù)量級(jí)?？梢酝ㄟ^改變系統(tǒng)中的適配體，將該檢測(cè)方法擴(kuò)展到同時(shí)檢測(cè)食品安全中的其他小型有機(jī)污染物。隨后，Chen及其團(tuán)隊(duì)［49］又基于NMOFs并結(jié)合了CSRP靶標(biāo)觸發(fā)的放大策略同時(shí)檢測(cè)氯霉素和氧四環(huán)素。

最近，Zhang等［50］將金納米粒子@Fe-MIL-88NH2（AuNPs@Fe-MOFs）作為平臺(tái)，鉑納米顆粒負(fù)載的二氧化鈰（CeO2）官能化的羧基富勒烯（c-C60）（c-C60/CeO2/PtNPs）用于信號(hào)擴(kuò)增設(shè)計(jì)了一種電化學(xué)傳感器實(shí)現(xiàn)了人類血清中CYP2C19*2等位基因的精確定量測(cè)定。Wang等［51］通過鏈置換反應(yīng)和MOFs構(gòu)建了一種超靈敏電化學(xué)紙基生物傳感器測(cè)miRNA含量，該紙基傳感器的構(gòu)建和檢測(cè)原理如圖5。他們則在Cu-MOFs的表面修飾了一層AuNPs，然后又固定了DNA鏈（S1）形成S1-AuNPs@Cu-MOFs復(fù)合物。其中AuNPs@Cu-MOFs不僅用作固定S1的納米載體，還用作信號(hào)報(bào)告的電活性材料，而且還作為催化劑用于氧化葡萄糖，實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大。該方法的檢測(cè)限是0.35 fmol/L，具有較高的靈敏度。

2.3 金屬-有機(jī)骨架功能核酸其他類型生物傳感器

目前，大部分研究者都將金屬-有機(jī)骨架與功能核酸應(yīng)用到熒光和電化學(xué)生物傳感器中，而在其他類型生物傳感器中的應(yīng)用相對(duì)較少。2015年，Liu等［52］將AuNPs通過靜電自組裝固定在MOFs（Fe-MIL-88）表面形成Au@Fe-MIL-88復(fù)合物開發(fā)出一種無標(biāo)記的比色法來檢測(cè)DNA。AuNPs的加入加強(qiáng)了單獨(dú)Fe-MIL-88的過氧化物酶催化活性。其檢測(cè)原理是探針DNA通過π-堆疊相互作用覆蓋在Au@Fe-MIL-88表面，降低Au@Fe-MIL-88的催化活性，當(dāng)靶標(biāo)ssDNA出現(xiàn)時(shí)與探針DNA雜交使探針DNA從Au@Fe-MIL-88表面脫離，從而使Au@Fe-MIL-88催化活性恢復(fù)，在H2O2存在的情況下可以催化無色的 3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）氧化形成藍(lán)色的氧化TMB（oxTMB），通過測(cè)定溶液在650 nm處的吸光度來定量測(cè)定靶標(biāo)ssDNA，檢測(cè)限為11.4 nmol/L。最近，Xiong等［53］提出了一種超靈敏的“off-on”電化學(xué)發(fā)光（Electrochemiluminescence，ECL）生物傳感器（圖6）。該傳感器通過使用自增強(qiáng)釕聚乙烯亞胺（Ru-PEI）復(fù)合物摻雜的沸石咪唑酯骨架-8（Ru-PEI @ ZIF-8）作為有效ECL指示劑并借助酶輔助的DNA循環(huán)擴(kuò)增策略來測(cè)定端粒酶活性，并可用于抗癌藥物的篩選。

圖5 用于測(cè)miRNA的電化學(xué)紙基生物傳感器構(gòu)建示意圖

3 展望

目前研究者將MOFs與FNA相結(jié)合應(yīng)用到檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域主要集中在熒光生物傳感器和電化學(xué)生物傳感器這兩大類，對(duì)其他類型生物傳感器的研究相對(duì)較少，這可成為未來研究的一個(gè)方向。另外，基于MOFs-FNA熒光生物傳感器的檢測(cè)原理比較單一，基本都利用MOFs的熒光淬滅特性實(shí)現(xiàn)對(duì)靶物質(zhì)的定量檢測(cè)，未來的研究可以拓寬MOFs-FNA熒光生物傳感器的廣度。

MOFs作為一種無機(jī)-有機(jī)復(fù)合材料，科學(xué)家若想將其應(yīng)用于生物體內(nèi)，需要對(duì)MOFs在體內(nèi)的毒性進(jìn)行充分的研究。2013年，Baati等［54］首次報(bào)道了對(duì)具有不同結(jié)構(gòu)、組成和疏水性的三種高劑量的多孔Fe（III）NMOFs在體內(nèi)的急性毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表示所有研究參數(shù)（血清學(xué)、酶學(xué)和組織學(xué)等）都與低急性毒性效應(yīng)一致，且表明NMOFs可被肝臟和脾臟迅速隔離，然后進(jìn)一步生物降解為NMOFs的組成成分Fe和羧酸配體，最后在尿或糞便中無需代謝直接排除。隨后，Tamames等［55］指出，MOFs在體內(nèi)的生物分布和清除取決于其性質(zhì)。因此，他們使用J774和HeLa這兩種細(xì)胞系研究了一系列基準(zhǔn)MOFs納米顆粒的細(xì)胞毒性，發(fā)現(xiàn)這些NMOFs均表現(xiàn)出低細(xì)胞毒性，與其它商業(yè)化的納米顆粒系統(tǒng)相當(dāng)，其中鐵羧酸鹽類NMOFs相較于鋅咪唑類毒性更低，對(duì)J774細(xì)胞的毒性值要高于HeLa細(xì)胞。雖然根據(jù)這些研究成果不能說明MOFs的毒性低，其在體內(nèi)的毒性還需進(jìn)一步探究，但部分NMOFs已被研究者確定為低毒；并且NMOFs已被研究者應(yīng)用于生物成像領(lǐng)域。因此，可以借鑒MOFs-FNA生物傳感器的檢測(cè)原理，將具備生物成像功能的NMOFs與FNA進(jìn)行有效結(jié)合，并應(yīng)用于生物體內(nèi)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。

圖6 ECL生物傳感器檢測(cè)端粒酶活性原理圖［53］

此外，MOFs生產(chǎn)效率高，省時(shí)省力，可大批量生產(chǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中具有突出優(yōu)勢(shì)［56］。MOFs介導(dǎo)的功能核酸檢測(cè)技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景。