汞離子傳感器檢測技術(shù)研究進展

馮瑜祥 李相陽 邵向麗 許文濤

（1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，北京 100083）

重金屬是一組天然的非生物降解元素，能在食物鏈的生物放大作用下富集［1］。重金屬在采礦業(yè)、發(fā)電業(yè)、冶煉業(yè)、電池制造業(yè)、染料紡織制造業(yè)、肥料及化肥的生產(chǎn)中都具有廣泛的應(yīng)用［2］。

汞又稱水銀，常溫常壓下是自然界中唯一的液態(tài)有色金屬。汞的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，外表呈現(xiàn)銀白色，其單質(zhì)或化合物形式均易于揮發(fā)并被生物體吸收。因汞能長距離轉(zhuǎn)移到極地、蓄積在生物體中并產(chǎn)生毒性危害，聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署（United nations environment programme，UNEP） 自 2001年起將其追加為持久性有害物質(zhì)（Persistent hazardous substances，PHS）［3］，我國也于 2011 年將汞列入《重金屬污染綜合防治規(guī)劃（2010-2015）》［4］。

汞的跨大陸運輸及隨大氣沉降的性質(zhì)使得汞污染成為一個全球性問題。已知存在于水環(huán)境中的有機汞包括甲基、乙基和苯基汞。在這些化合物中，甲基汞含量最高，毒性最強并且易隨食物鏈實現(xiàn)生物積累和放大。汞中毒引起的臨床表現(xiàn)與進入體內(nèi)汞的形態(tài)、進入途徑、接觸劑量、接觸時間及人體特征密切相關(guān)，表現(xiàn)為急性毒性、慢性毒性和蓄積性毒性，靶向器官為消化系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)。甲基汞還可以通過胎盤屏障，使新生兒發(fā)生先天性疾?。?］。為保障人類健康，美國環(huán)境保護協(xié)會（Environmental protection agency，EPA）規(guī)定的飲用水中的最大汞殘留量為 2.0 ppb［6］。

1 汞離子檢測技術(shù)概述

同其他金屬離子一樣，Hg2+的檢測方法也經(jīng)歷了由儀器分析到傳感器檢測的過程。儀器分析法包括原子吸收光譜法（Atomic absorption spectrometry，AAS）［7-8］， 原 子 發(fā) 射 光 譜 法（Atomic emission spectrometry，AES）［9］，原子熒光光譜法（Atomic fluorescence spectrometry，AFS）［10-11］和質(zhì)譜法（Mass spectrometry，MS）［12］等。儀器分析法在靈敏度和準(zhǔn)確性方面具有明顯的優(yōu)勢，但昂貴的設(shè)備和繁瑣的樣品處理過程使其難以廣泛應(yīng)用。作為儀器分析的補充，傳感器檢測法以其良好的兼容性發(fā)展起來。利用傳感器檢測的核心思路是構(gòu)建敏感元件和換能元件［13］。敏感元件是與目標(biāo)物質(zhì)特異性結(jié)合并識別的部分，換能元件是指將目標(biāo)物質(zhì)的含量等信息轉(zhuǎn)換成可識別的相關(guān)信號或方式。在搭建檢測汞的傳感器時，敏感元件通過與Hg2+的相互作用實現(xiàn)了Hg2+的特異性捕獲，這些敏感元件包括熒光基團、核酸、納米粒子、轉(zhuǎn)基因微生物、肽、蛋白質(zhì)及酶等。換能元件則將傳感器對汞的識別信息轉(zhuǎn)換成可檢測的信號，通過儀器采集，放大濾噪等處理，實現(xiàn)Hg2+的定量檢測。目前的綜述大多以換能元件為分類依據(jù)，將檢測Hg2+的傳感器分為光學(xué)傳感器、電化學(xué)傳感器等，忽視了Hg2+與敏感元件結(jié)合的原理。因此，本文將從Hg2+的性質(zhì)入手，對Hg2+與敏感元件的結(jié)合原理進行分類總結(jié)，闡述近年來Hg2+傳感器的發(fā)展，為實現(xiàn)Hg2+的快速檢測提供方法依據(jù)。

2 Hg2+與敏感元件間的相互作用

2.1 Hg2+與化學(xué)分子互作

2.1.1 Hg2+與熒光基團的互作 Hg2+與熒光基團互作為基礎(chǔ)的生物傳感器主要有“關(guān)”和“開”兩種類型。前者將Hg2+作為一種高效的熒光猝滅劑。通過猝滅納米粒子或熒光化學(xué)基團實現(xiàn)Hg2+的定量檢測；后者則利用Hg2+與特殊基團的相互作用實現(xiàn)熒光的恢復(fù)。利用熒光法檢測Hg2+時，若熒光基團具有良好的兩親質(zhì)，能很好地穿越細(xì)胞膜，則能通過生物成像檢測細(xì)胞內(nèi)的 Hg2+［14］。

2.1.1.1 Hg2+猝滅 AuNCs的熒光 2009 年，Xie等［6］利用Hg2+與Au+的相互作用及Hg2+的熒光猝滅性質(zhì)，設(shè)計了一個簡單、無標(biāo)記的熒光傳感器。該傳感器包含了高熒光產(chǎn)率金納米團簇（AuNCs）。該“關(guān)”型傳感器的線性檢測范圍為1-2×10-8mol/L，檢測限為5×10-10mol/L（0.1 ppb），遠(yuǎn)低于美國環(huán)境保護署規(guī)定的飲用水中汞離子的（2 ppb）最高水平。這種檢測原理可以較容易的移植在試紙條系統(tǒng)中，從而實現(xiàn)Hg2+的快速、可視化檢測。2010年，Lin等［15］首次報道了AuNCs在檢測CH3Hg+中的應(yīng)用，并通過加入EDTA可以有效的區(qū)分Hg2+與CH3Hg+兩種靶物質(zhì)。同年，Hu等［16］基于Hg-S相互作用，建立了利用BSA包被的AuCNs（BSA-AuNCs）檢測Hg2+的傳感器。BSA-AuNCs與Hg2+通過Hg-S鍵形成復(fù)合物，BSA-AuNCs復(fù)合物首先被激發(fā)形成激發(fā)態(tài)，Hg2+直接攔截電子載體并被還原成Hg+，擾亂空穴與激發(fā)電子的輻射復(fù)合，從而猝滅BSA-AuNCs的光致發(fā)光作用。當(dāng)Hg2+濃度為 4×10-4mol/L-4.32×10-2mol/L之間時，熒光猝滅程度與Hg2+濃度之間存在良好的線性關(guān)系，其檢測限LOD可以達(dá)到8×10-8mol/L。

2.1.1.2 Hg2+與有機熒光分子的互作 有機熒光分子也是一類被廣泛的應(yīng)用于近紅外生物成像、生理分析檢測、疾病診斷等方面的功能性染料。有機近紅外染料通常具有高的摩爾消光系數(shù)與熒光量子產(chǎn)率，并且因其具有分子結(jié)構(gòu)易于合成修飾，光譜易于調(diào)節(jié)，生物相容性較好且代謝較快等優(yōu)點，一直受到大家的廣泛關(guān)注［17］。

（1）基于羅丹明的化學(xué)傳感器 羅丹明類染料在檢測重金屬離子及生物成像中有廣泛的應(yīng)用，最常利用的性質(zhì)是羅丹明螺環(huán)與開環(huán)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換［18］。具體來說，羅丹明類染料在螺環(huán)狀態(tài)下，由于分子內(nèi)的共軛結(jié)構(gòu)被打斷，表現(xiàn)為無特征吸收、無特征發(fā)射；而當(dāng)其處于開環(huán)狀態(tài)時，表現(xiàn)出特征吸收與熒光發(fā)射的現(xiàn)象。2007年，Wu等［19］以經(jīng)過修飾的Rho 6G為熒光染料，設(shè)計了特異性檢測Hg2+的“開”型傳感器，實現(xiàn)了Hg2+的熒光-比色雙重檢測。其原理如圖1所示。Hg2+與硫具有很強的親和性，并且可以促進脫硫反應(yīng)發(fā)生，打開作為信號分子的Rho 6G的螺環(huán)結(jié)構(gòu)并促發(fā)分子內(nèi)胍基化修飾，形成強烈的熒光。該傳感器具有良好的特異性，不受其他二價離子的干擾，并在pH 5-10的范圍內(nèi)都有較好的檢測效果。

同樣利用Hg2+的親硫性質(zhì)，Lin等［20］設(shè)計了1作為識別Hg2+的新型探針，并將該探針應(yīng)用于生物成像。1包含羅丹明衍生物，S原子和炔基3個部分。Hg2+、S原子、炔基結(jié)合會使羅丹明衍生物由無熒光的螺環(huán)狀態(tài)轉(zhuǎn)化為有熒光的開環(huán)狀態(tài)。熒光探針1的兩親性是實現(xiàn)Hg2+生物成像重要基礎(chǔ)。該探針的檢測限LOD為 3.9×10-8mol/L，熒光強度與Hg2+濃度在5×10-8mol/L-4×10-6mol/L之間存在良好的線性關(guān)系。

（2）基于方酸的化學(xué)傳感器 方酸（Squaraine，SQ）類染料是一類具有大平面π 共軛類熒光染料，其在近紅外區(qū)域有較強的吸收與發(fā)射［21］。方酸的剛性平面也使得其具有較好的光穩(wěn)定性。目前方酸類染料常常用于生化標(biāo)記分析、熒光檢測等領(lǐng)域［22］。2005年，Ros-Lis等［23］設(shè)計了比色-熒光傳感器，實現(xiàn)了Hg2+的定量檢測。Hg2+具有親巰基性，且能夠與APC衍生物發(fā)生反應(yīng)。APC衍生物，如圖2-A所示，含有兩個獨立的發(fā)色團，分別在265 nm和305 nm處有特征峰，其溶液呈藍(lán)色。在加入Hg2+后，如圖2-B，Hg2+爭奪APC衍生物中的巰基基團，APC衍生物被拆分，重新形成方酸染料，原有的特征峰消失，體系的顏色由藍(lán)色變?yōu)闊o色，并在642 nm處產(chǎn)生一個新的吸收帶，產(chǎn)生熒光信號。該方法實現(xiàn)了水溶液中2 ppb Hg2+的檢測。2011年，Chen等［24］利用方酸在不同的溶液體系中表現(xiàn)出的不同特性，實現(xiàn)了Hg2+的定量檢測。作者通過修飾生成SQ-1增強了方酸對Hg2+的特異性。實驗表明，SQ-1在548 nm處的吸收峰按比例降低，伴隨著636 nm處新的吸收峰的出現(xiàn)。該檢測方法具有良好的特異性，即使是對巰基敏感的Ag+或Pb2+，也不會對檢測結(jié)果產(chǎn)生干擾。

圖2 Hg2+與丙硫醇反應(yīng)誘導(dǎo)APC衍生物再生原理圖［23］

（3）基于萘酰亞胺熒光基團的化學(xué)傳感器 萘酰亞胺是一類優(yōu)秀的發(fā)色基團，目前作為信號基團大量應(yīng)用于熒光分子探針的設(shè)計。這類化合物具有較好的平面剛性和嵌入能力，已被廣泛應(yīng)用于嵌入劑、光敏損傷和抗腫瘤藥物等方面的研究［25］。Guo等［26］設(shè)計了一個水溶性化學(xué)傳感器1，實現(xiàn)了Hg2+的定量檢測。1是由兩個萘酰亞胺熒光物質(zhì)和受體 2，6-二（氨基甲基）吡啶組成，該物質(zhì)可與金屬離子選擇性結(jié)合，而2，6-二（氨基甲基）吡啶的氮原子既作為離子受體又發(fā)揮熒光猝滅劑的作用。1的熒光強度與Hg2+濃度在（0.1-1.0）×10-5mol/L的區(qū)間范圍內(nèi)線性相關(guān)，且具有良好的特異性。

利用萘酰亞胺類熒光基團還可以實現(xiàn)Hg2+的生物成像。Li等［27］通過共價連接萘酰亞胺吡啶和大共軛卟啉基團設(shè)計了可以定量檢測Hg2+的比率傳感器1，其結(jié)構(gòu)如圖3所示。該傳感器可以發(fā)生可逆的比率熒光反應(yīng)，對水溶液中Hg2+具有很高的靈敏度和選擇性。在激發(fā)波長415 nm，發(fā)射波長處于450-700 nm區(qū)間時，無Hg2+狀態(tài)下，1在525和650 nm處有兩個典型的熒光發(fā)射峰，這兩個熒光發(fā)射峰分別來自于萘酰亞胺和卟啉基團。Hg2+的加入會引起萘酰亞胺熒光基團的熒光信號顯著增加，而卟啉基團的熒光信號減少。二者的發(fā)射強度I525/ I650，隨著Hg2+濃度的增加而增加。其線性檢測區(qū)間為1.0×10-7mol/L-5.0×10-5mol/L，檢測限為2.0×10-8mol/L。生物成像實驗表明，該探針同樣可以實現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)Hg2+的檢測。

圖3 探針1與Hg2+結(jié)合機理示意圖［27］

2.2 Hg2+與抗體、蛋白質(zhì)及酶的互作

2.2.1 Hg2+與抗體的互作 經(jīng)典的抗原-抗體生物傳感器以抗體作為識別元件，利用了抗原-抗體的特異性結(jié)合性質(zhì)。受限于自身的粒徑，金屬離子往往作為半抗原，需要與配體螯合才能被抗體識別［28］。此外，由于抗體對環(huán)境要求苛刻，在實際樣品檢測中可能產(chǎn)生不可逆的變性，因此已逐漸被化學(xué)傳感器及其他生物傳感器所替代。

2.2.2 Hg2+與蛋白質(zhì)的互作 MerR是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，控制多種金屬離子的外排系統(tǒng)。MerR在溶液中以穩(wěn)定的二聚體形式存在，在無目標(biāo)金屬離子存在的情況下，MerR可以與相應(yīng)啟動子序列特異性識別結(jié)合。當(dāng)識別特定的目標(biāo)金屬離子（Hg2+）或有機分子時，與MerR蛋白結(jié)合的dsDNA的發(fā)生畸變，即該啟動子的回文序列中堿基對被破壞，dsDNA解鏈［29］。2006 年，Wegner等［30］設(shè)計了包含了 MerR蛋白的結(jié)合序列的dsDNA序列，并將兩個芘分子單體分別嵌入DNA的兩條鏈中，位于啟動子DNA序列中間被MerR蛋白識別的部位。在無Hg2+條件下，MerR蛋白與dsDNA結(jié)合，芘二聚體分子在480 nm處發(fā)射熒光。當(dāng)加入Hg2+后，MerR蛋白與Hg2+結(jié)合，引發(fā)DNA畸變，在380 nm處發(fā)射芘單體熒光。該傳感器的檢測限為1×10-8mol/L，且在其他金屬離子存在的條件下表現(xiàn)出有良好的選擇性。

2.2.3 Hg2+與酶的互作 2007年，F(xiàn)rasco等［31］研究了無機汞抑制膽堿酯酶的機制。實驗表明，不同的生物體中的乙酰膽堿酯酶與Hg2+作用會產(chǎn)生不同的作用效果。利用動力學(xué)，X射線晶體學(xué)和動態(tài)光散射等方法，證明當(dāng)酶中存在對Hg2+敏感的游離的巰基時，微摩爾范圍的Hg2+對膽堿酯酶會產(chǎn)生不可逆的抑制作用。Torpedo californica乙酰膽堿酯酶將有潛力作為檢測Hg2+污染的標(biāo)記物或的生物傳感器組分。

2.3 Hg2+與核酸的互作

與蛋白質(zhì)相比，核酸DNA易于進行化學(xué)合成且具有較低的合成成本并且高度穩(wěn)定、高度可編輯。利用核酸對Hg2+檢測的方法主要可以分為利用富含T堿基的DNA探針、利用DNAzyme及利用Hg2+的適配體序列3種類型。

2.3.1 Hg2+與胸腺嘧啶的互作 早在1952年，Katz［32］就發(fā)現(xiàn) 10-3mol/L HgCl2可以引起 DNA 溶液黏度顯著降低，并于1963年提出Hg2+與胸腺嘧啶以 T-Hg2+-T 的方式結(jié)合［33］。其后，核磁共振［34-35］、紫外可見光譜［34］及X射線晶體學(xué)［36］等技術(shù)被廣泛應(yīng)用于胸腺嘧啶與Hg2+結(jié)合的性質(zhì)的探究。圓二色譜和DNA溶解曲線證明T-Hg2+-T之間的穩(wěn)定性強于A-T配對［37］。21世紀(jì)以來，研究人員利用T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)，建立了大量檢測Hg2+的核酸傳感器，或?qū)⒃摻Y(jié)構(gòu)用于Hg2+誘捕，單核苷酸多態(tài)性（Singlenucleotide polymorphism，SNP）檢測等［38］。隨著對核酸與Hg2+互作性質(zhì)的深入探究發(fā)現(xiàn)，除胸腺嘧啶外，其他堿基也可以與Hg2+結(jié)合形成特定的結(jié)構(gòu)。Ono等［39］發(fā)現(xiàn)具有T-C錯配的雙鏈在加入Hg2+后，一定程度上也能形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。

2.3.1.1 基于T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)的光學(xué)傳感器 2004年，Ono等［39］設(shè)計了最早的基于T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)的寡脫氧核苷酸（ODN）的傳感系統(tǒng)。如圖4所示，核酸序列D-ODN-F的3′端和5′端上分別標(biāo)記了熒光基團（Fluorescein，F(xiàn)）和猝滅基團（Dabcyl，D）。寡核苷酸序列由富含胸腺嘧啶的Hg2+結(jié)合序列和連接序列兩部分組成。在Hg2+存在下，胸腺嘧啶殘基與Hg2+結(jié)合，連接ODN的結(jié)合序列，形成末端標(biāo)記相互靠近的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。這個過程中，F(xiàn)和D間發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET），相對于無Hg2+狀態(tài)下的線性結(jié)構(gòu)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的熒光被顯著猝滅，形成“關(guān)”型核酸傳感器。該傳感器的檢測限（LOD）為 4×10-8mol/L，并在（4.0-10.0）×10-9mol/L范圍內(nèi)，熒光強度與Hg2+的濃度存在良好的線性關(guān)系。由于T和Hg2+之間的作用具有特異性，該傳感器不易受到其他重金屬離子的干擾，但該方法的靈敏度較差，檢測限遠(yuǎn)高于美國環(huán)境環(huán)保署對飲用水中Hg2+濃度的限制，且若體系中存在其他類型的猝滅劑，該傳感器可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

圖4 T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)促發(fā)發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成示意圖［39］

為了解決這些問題，此后利用T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)搭建的核酸傳感器通過循環(huán)放大或改變信號輸出方式等增強傳感器的靈敏度。2017年，Lee等［40］通過指數(shù)鏈替代方式實現(xiàn)Hg2+的靈敏檢測。如圖5所示，該核酸傳感器依賴于Hg2+觸發(fā)的eSDA，通過Hg2+的循環(huán)使用和SDA I、SDAⅡ兩個循環(huán)，使Hg2+的檢測限降低至2.95×10-12mol/L，并成功實現(xiàn)了自來水中Hg2+的檢測。

圖5 基于eSDA循環(huán)的Hg2+檢測示意圖［40］

在基于T- Hg2+-T結(jié)構(gòu)設(shè)計的檢測Hg2+的光學(xué)傳感器中，還有一大類用到了核酸修飾的金納米顆粒。AuNPs在核酸生物傳感器中的作用常常是作為一個平臺嫁接DNA的自組裝層和參與信號轉(zhuǎn)化［41］?；趩捂淒NA（ssDNA）與AuNPs表面的靜電吸引作用，卷曲的ssDNA可以在高離子強度的溶液中穩(wěn)定AuNPs膠體，使溶液保持紅色。利用Hg2+對核酸鏈中T堿基對的親和性，通過形成穩(wěn)定的T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)ssDNA向雙鏈DNA（dsDNA）的轉(zhuǎn)化。近年來，檢測Hg2+的核酸傳感器在此基礎(chǔ)上又有新的發(fā)展。AuNPs常與電化學(xué)或熒光法結(jié)合在一起以提高反應(yīng)的靈敏度。

Yu等［42］建立了基于雜交鏈反應(yīng)（HCR）和AuNPs檢測Hg2+的高靈敏熒光比色/雙模傳感器（圖6）。該傳感器中，AuNPs不但可以作為光學(xué)信號的輸出元件，還具猝滅熒光信號的作用?；贖CR放大效應(yīng)，該核酸傳感器的檢測限達(dá)到1×10-9mol/L。此外，比色法與熒光法相結(jié)合還可增加傳感器的使用范圍。其他基于金的納米材料，如AuNRs和AuNSs等也用于Hg2+的檢測。Wang等［43］在富含胸腺嘧啶DNA存在的條件下實現(xiàn)了GNRs端到端的組裝。該方法的線性區(qū)間為1-15×10-6mol/L。

圖6 基于AuNPs和HCR的Hg2+熒光傳感器示意圖［42］

金納米星（AuNSs）與表面增強拉曼光譜（SERS）結(jié)合也可以實現(xiàn)Hg2+的檢測［44］。在Hg2+存在的條件下，Hg2+與ssDNA 中的T-T堿基對自組裝形成AuNS二聚體結(jié)構(gòu)。表面增強拉曼光譜的信號取決于AuNS二聚體自組裝的程度。該方法在Hg2+濃度為0.002-1 ng/mL的范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，其檢測限為0.8 pg/mL（圖 7）。

圖7 基于金納米星二聚體的Hg2+檢測示意圖［44］

2.3.1.2 基于T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)的電化學(xué)傳感器 與其他方法相比，電化學(xué)法具有選擇性較好，分析速度快，簡便廉價，易于實現(xiàn)自動化等特點。檢測Hg2+的電化學(xué)傳感器往往利用T- Hg2+-T結(jié)構(gòu)引起DNA結(jié)構(gòu)變化而導(dǎo)致的電信號變化來實現(xiàn)Hg2+的定量檢測。Qiu等［45］將AuDENs與電化學(xué)結(jié)合，通過血糖儀的信號輸出，建立了turn-on的Hg2+核酸傳感器，實現(xiàn)了Hg2+的靈敏檢測。該方法的檢測限為4.2×10-12mol/L，并在 1.0×10-11mol/L-1×10-7mol/L nmol 之間存在良好的線性關(guān)系。Xiong等［46］利用富T的發(fā)夾DNA探針建立了雙信號的電化學(xué)比率傳感器（圖8）。該檢測方法得到Hg2+濃度線性范圍為5×10-10mol/L-5.000×10-6mol/L，檢出限為 8×10-11mol/L，遠(yuǎn)低于美國環(huán)境環(huán)保署對飲用水中Hg2+濃度的限制。更重要的是，在體系中加入半胱氨酸和Mg2+可以使該電化學(xué)生物傳感器實現(xiàn)循環(huán)利用。

Xie等［47］在電化學(xué)中引入末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（Terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT） 和Nt. BbvCI剪切酶實現(xiàn)了信號的循環(huán)放大，進一步降低了Hg2+的檢出限。如圖9所示。在Hg2+的存在下，富胸腺嘧啶的DNA（HP1）可以部分折疊成雙鏈結(jié)構(gòu)通過并暴露出其黏性末端。該黏性末端與3′-PO4修飾且固定在電極表面HP2形成雙鏈。Nt. BbvCI識別雙鏈中的切割位點，將雜交復(fù)合體中的HP1從電極中釋放出來。伴隨著酶的切割過程，HP2的3′-OH被暴露，借助TdT酶和dATP延伸形成帶負(fù)電荷的DNA單鏈。在靜電作用下，ssDNA與帶正電的Ag+結(jié)合，在加入硼氫化鈉還原劑后，金屬銀可原位沉積在電極表面并輸出電化學(xué)信號。在最佳條件下，該核酸傳感器的檢測限達(dá)到3×10-12mol/L，在實際中也有很好的應(yīng)用前景。

圖8 比率電化學(xué)傳感器檢測Hg2+示意圖［46］

圖9 基于原位沉淀AgNPs與聚合酶介導(dǎo)的循環(huán)放大反應(yīng)檢測Hg2+示意圖［47］

2017年，Amiri等［48］利用電化學(xué)的方法，建立了高選擇性的非標(biāo)記適配體傳感器，進一步提高了電化學(xué)傳感器的靈敏度，實現(xiàn)了zmol 級別的Hg2+檢測，并宣稱向?qū)崿F(xiàn)單原子檢測的夢想更近了一步。如圖10，巰基標(biāo)記的ssDNA通過Au-S相互作用自組裝在金電極的表面。ssDNA與其互補的cDNA序列的結(jié)合，或加入Hg2+后雙鏈的解構(gòu)，這兩種信號均通過［Fe（CN）6］3-/4-氧化還原探針利用微分脈沖伏安法（DPV）檢測出來。在這個傳感器中，Hg2+與T堿基形成T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)是實現(xiàn)特異性檢測的關(guān)鍵。該傳感器的檢測范圍是5×10-15mol/L-5.5×10-11mol/L，檢測限為6×10-16mol/L。

2.3.2 Hg2+與脫氧核酶的互作 1981 年，Cech 等［49］發(fā)現(xiàn)了RNA的催化活性，并將其命名為核酶（Catalytic RNA，RNAzyme，ribozyme）。核酶催化細(xì)胞內(nèi)的多種反應(yīng)，如對靶標(biāo)RNA進行切割，從而控制基因的表達(dá)［50］。自然狀態(tài)下，受限于剛性雙鏈結(jié)構(gòu)，DNA并沒有表現(xiàn)出類似的催化活性［51］。1994年，合成第一個具有活性的脫氧核酶（Catalytic DNA，DNAzyme，deoxyribozyme）［52］。脫氧核酶能催化許多反應(yīng)，包括催化RNA和DNA的切割和連接［52-54］，化學(xué)修飾［55］等。我們將常見的DNAzyme按功能分為類過氧化物DNAzyme和依賴金屬離子的DNAzymes。

圖10 利用適配體檢測Hg2+的電化學(xué)傳感器示意圖［48］

利用DNAzyme實現(xiàn)Hg2+的檢測主要有3種基本思路。第1種利用G-四鏈體結(jié)構(gòu)，即富含鳥嘌呤的DNA序列結(jié)合hemin（氯高鐵血紅素）形成具有過氧化物酶的活性DNAzyme，在 H2O2存在的條件下，將ABTS2-氧化產(chǎn)生可溶的綠色產(chǎn)物ABTS-從而實現(xiàn)可視化檢測；第2種利用通過SELEX篩選技術(shù)得到的以Hg2+作為輔因子的DNAzyme對含有RNA的底物鏈進行切割，通過對切割產(chǎn)物的檢測實現(xiàn)對Hg2+的檢測；第3種即利用對其它金屬離子具有特異性的DNAzyme，通過增加T-T錯配或修飾堿基，或通過對底物鏈的改性，實現(xiàn)對Hg2+的識別。

作為一種非常規(guī)的DNA立體結(jié)構(gòu)，由富G序列構(gòu)成的G四鏈體具有特殊的物理化學(xué)性質(zhì)。在核酸傳感器中，G四鏈體往往被用作免標(biāo)記的信號輸出單元。G-四結(jié)構(gòu)用于檢測包括金屬離子在內(nèi)的小分子技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟和完善［56］。多數(shù)利用G-四鏈體核酶檢測Hg2+的方法仍用到了T-Hg2+-T這一結(jié)構(gòu)。其基本原理在富G序列中引入T-T錯配位點，由Hg2+指導(dǎo)G-四鏈體空間結(jié)構(gòu)的形成。由于G-四鏈體催化顯色反應(yīng)的能力與其空間結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，從而實現(xiàn)Hg2+的檢測。例如，Li等［57］設(shè)計了含有T堿基的寡核苷酸AGRO100作為識別Hg2+和催化顯色反應(yīng)的核酶。在無配位陽離子時，AGRO100呈現(xiàn)柔軟的單鏈結(jié)構(gòu)。在加入K+后，該核酸序列結(jié)合氯高鐵血紅素形成具有過氧化物酶活性的Hemin-G-quadruplex。若調(diào)整金屬離子的加樣順序，即在K+之前先加入Hg2+，由Hg2+介導(dǎo)形成的T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)將抑制AGRO100折疊形成G-四鏈體，此時Hemin-G-quadruplex不能形成，不能催化H2O2-ABTS反應(yīng)。這個過程通過紫外-可見吸收光譜法進行表征。該方法的檢測限為5.0×10-8mol/L，并具有良好的特異性。

多數(shù)天然核酶在堿性金屬離子或過渡金屬粒子存在的情況下具有活性。金屬離子在核酶中的作用主要有兩個，一是幫助DNA或RNA形成功能化的結(jié)構(gòu)；二是直接參與化學(xué)反應(yīng)。2007年，Vannela等［58］通過體外篩選得到了具有RNA切割活性、以Hg2+為輔因子的DNAzymes。篩選得到的核酸分子在序列上展現(xiàn)出驚人的相似性。27條獨立的序列按照序列的相似性被分為3類。其中，16條被劃分在Family-Im中，共同含有AATTCCGTAGGTCCAGTG保守序列。Family - IIm和IIIm中分別包含7和4條序列。當(dāng)汞濃度為500 μmol/L時，DNAzyme的切割效率最大。

2008年，Hollenstein等［59］篩選出經(jīng)修飾的DNAzyme 10-13實現(xiàn)了Hg2+的檢測。其結(jié)構(gòu)如圖11所示。利用咪唑基與Hg2+互作的性質(zhì)確保Hg2+的螯合和催化反應(yīng)的發(fā)生。經(jīng)修飾的DNAzyme 10-13的速率常數(shù)Kobs為（0.037±0.002）min-1（Hg2+的濃度為5 mmol/L）。在沒有任何二價金屬離子或僅有氯化鎂時，DNAzyme 10-13在42 h內(nèi)沒有表現(xiàn)出明顯的（＜10%）切割，具有良好的選擇性。

圖11 特異性識別Hg2+的DNAzyme 10-13序列及結(jié)構(gòu)示意圖［59］

雖然以Hg2+作為輔因子切割RNA的DNAzyme已有報道，但由于該種類型的核酶易受到其他金屬離子，尤其是Cu2+和Zn2+的干擾，為了提高檢測的特異性，基于經(jīng)過修飾或改性的其他金屬離子DNAzyme生物傳感器應(yīng)運而生。這些DNAzyme包括39E，Ce13d、GR5及17E等。

2007年，Liu等［3］將金屬離子與DNAzyme的結(jié)合位點與熒光信號分開標(biāo)記，以39E DNAzyme（特異性識別UO22+）為前體，利用T-T錯配識別Hg2+，設(shè)計并優(yōu)化了EHg5T DNAzymes，實現(xiàn)了Hg2+的定量檢測（圖12）。由于39E只有在UO22+存在時才有活性，而UO2

2+與其他常見的金屬離子不同，在自然環(huán)境中，其離子強度很低，因此該核酶受到的干擾很小。EHg5T DNAzymes中包含了5個T-T錯配，相比較沒有加入Hg2+的陰性對照組，陽性組在加入Hg2+后，酶活性明顯的增強，其速率常數(shù)為 0.61 min-1。

圖12 T-Hg2+-T介導(dǎo)的特異性DNAzyme結(jié)構(gòu)示意圖［3］

提高DNA與Hg2+親和性的方法從上述傳感器中可見一斑：一是在核酸序列中引入多個T堿基，通過T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)捕獲Hg2+；二是在DNA序列中引入特殊的修飾堿基。這兩種方法都存在一定的缺陷：T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)的形成易受環(huán)境中的離子成分（尤其是Cl-）的干擾；而特殊的修飾堿基往往難以商業(yè)合成或價格昂貴［60］。基于此，Huang和Liu等［61］設(shè)計了同時檢測多種金屬離子的DNAzyme傳感器。為增加核酸與Hg2+的親和性，他們在DNA中引入硫元素，即采用硫代磷酸酯（PS）修飾DNA底物鏈，將磷酸二酯鍵（PO）中的非橋接氧原子替換為S原子，從而增加DNAzyme對巰基金屬如Hg2+，Cd2+，Pb2+的親和力。對于PS底物鏈，Ce13d、GR5、17E及39E DNAzyme均表現(xiàn)出與PO底物鏈不同的性質(zhì)，其特異性識別的金屬離子如表1所示。

表1 GR5、17E以及39E DNAzyme對PO、PS底物鏈切割性質(zhì)差異

通過Ce13d和GR5對PS和PO底物鏈切割活性不同設(shè)計如圖13的金屬離子篩選陣列，最終將金屬離子分為3類：不能使Ce13d發(fā)揮活性的Mg2+、Mn2+及Fe2+等過渡金屬；在Ce13d作用下，對PO底物鏈切割效率更高的鑭系和Y3+金屬離子和對PS底物鏈切割效率更高的Cd2+，Hg2+，Pb2+親硫金屬。對Cd2+、Hg2+和Pb2+的一步篩選則由GR5 DNAzyme完成。該陣列可實現(xiàn)對多種金屬離子的篩選和對Cd2+、Hg2+和Pb2+的定量檢測，具有良好的靈敏度和特異性。

圖13 利用Ce13d、GR5 DNAzymes檢測Hg2+，Pb2+，Cd2+流程示意圖［61］

3 其他檢測Hg2+的方法

3.1 Hg2+介導(dǎo)的脫硒、水解反應(yīng)

之前介紹的許多生物傳感器利用了Hg2+與S原子或N原子的共價或非共價親和性。然而，S和N原子經(jīng)常被用作選擇性識別的反應(yīng)位點，很多金屬離子如Cu2+、Zn2+、Ni2+及Pb2+等可能會對上述傳感器產(chǎn)生干擾。為了提高傳感器的特異性，Hg-Se相互作用也被用于搭載Hg2+的監(jiān)測傳感器。2009年，Tang等［62］設(shè)計了有機硒熒光探針（FSe-1），該熒光探針可與Hg2+發(fā)生不可逆的脫硒反應(yīng)，并對Hg2+表現(xiàn)出高的靈敏度和選擇性。FSe-1的合成及其與Hg2+發(fā)生脫硒反應(yīng)的原理如圖14所示。脫硫反應(yīng)的最終結(jié)果是產(chǎn)生熒光素Hg-Se。該反應(yīng)的最低檢出限為1.0×10-9mol/L，并實現(xiàn)了RAW 264.7 細(xì)胞中（小鼠巨噬細(xì)胞株）Hg2+的檢測。

同年，Santra等［63］利用Hg2+促進熒光素衍生芳基乙烯基醚水解的性質(zhì)，建立了一種對甲基汞和無機汞離子特別敏感的熒光探針，解決了多數(shù)傳感器不能檢測甲基汞，或?qū)谆`敏度較低的問題。其中，探針1的設(shè)計是基于汞離子促進的乙烯基醚1的水解反應(yīng)，其反應(yīng)路徑為乙烯基醚1羥汞化生成相應(yīng)的半縮醛中間體，后者分裂形成乙醇2和乙醛3。Hg2+促進乙烯基醚的水解反應(yīng)在甲基汞（CH3HgX）存在時也能發(fā)生。乙烯基醚1的熒光信號非常弱，而乙醇2可以產(chǎn)生強烈的熒光信號。該反應(yīng)可以實現(xiàn)水溶液中甲基汞和無機汞離子的檢測。

圖14 FSe-1與Hg2+發(fā)生脫硒反應(yīng)示意圖［62］

3.2 利用轉(zhuǎn)基因微生物檢測Hg2+

微生物傳感器的設(shè)計原理是將受嚴(yán)格調(diào)控的啟動子連接到一個敏感的報告基因上。在環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的該類型的啟動子多來源于生活在重金屬以及有機化合物污染條件下的細(xì)菌中。能夠在受污染的環(huán)境中生存的細(xì)菌，其基因常會編碼的抗性系統(tǒng)，且抗性系統(tǒng)的基因受到嚴(yán)格的調(diào)控。Virta等［64］利用于轉(zhuǎn)基因微生物設(shè)計了檢測Hg2+的生物傳感器。在該傳感器中，轉(zhuǎn)座子Tn21的mer啟動子控制螢火蟲熒光素酶基因，螢火蟲熒光素酶基因作為報告基因，大腸桿菌MC1061作為宿主。實驗結(jié)果表明，在1×10-19mol/L-1×10-12mol/L的區(qū)間內(nèi)，所產(chǎn)生的熒光信號強度與Hg2+的濃度有關(guān)。該方法的最低檢出濃度為1×10-16mol/L，且即使在其他離子超Hg2+百萬倍的濃度條件下，對Hg2+的測量結(jié)果不會造成干擾，具有極強的特異性。

4 結(jié)語

Hg2+可隨大氣、海洋環(huán)流發(fā)生全球性遷移，并通過化學(xué)轉(zhuǎn)化或生物轉(zhuǎn)化形成強蓄積性和高危害的甲基汞，對動物、植物和人類健康產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。因此，如何實現(xiàn)Hg2+的快速、靈敏檢測，是科研工作者廣泛關(guān)注的話題。Hg2+的檢測方法經(jīng)歷了由儀器分析到傳感器檢測的發(fā)展。常用于搭載Hg2+傳感器的元件包括熒光基團、核酸、納米粒子、轉(zhuǎn)基因微生物、肽、蛋白質(zhì)、酶等。

Hg2+的熒光傳感器分為 “關(guān)”和“開”兩種類型。利用Hg2+的熒光猝滅性質(zhì)或利用Hg2+與特殊基團互作產(chǎn)生熒光，實現(xiàn)了Hg2+的定量檢測。常用的熒光物質(zhì)包括金屬納米粒子和化學(xué)基團兩種。蛋白質(zhì)、DNA常用于搭建檢測Hg2+的生物傳感器。蛋白質(zhì)既包括抗體、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，還包括酶。Hg2+與核酸互作的最常見形式是形成T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)，此外，DNA可作為脫氧核酶催化DNA、RNA等物質(zhì)的切割，實現(xiàn)Hg2+定量檢測。Hg2+還可以介導(dǎo)水解、脫硒等反應(yīng)，或作為不利的環(huán)境因素誘導(dǎo)微生物激活抗性基因，實現(xiàn)Hg2+的檢測。

目前，生物傳感器越來越多的取代化學(xué)傳感器或儀器分析法被應(yīng)用到汞離子檢測中，極大地縮短了汞離子的檢測時長。但常見的生物傳感器檢測限較高，容易受到其他金屬離子的干擾，且重復(fù)性較差。因此，只有少數(shù)生物傳感器用于實際樣品的檢測。未來可將多種類型的特異性化學(xué)基團修飾在生物傳感器中，從而提高生物傳感器的靈敏度和特異性。