恒溫技術(shù)介導(dǎo)的功能核酸生物傳感器研究進(jìn)展

張園 肖冰 田晶晶 許文濤

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

“民以食為天，食以安為先”。食品安全是社會(huì)廣泛關(guān)注的話題，也是關(guān)乎國(guó)計(jì)民生的大事。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)水平的提升，食品的流通量加大、加工方式更加多樣，這對(duì)食品安全檢測(cè)技術(shù)提出了更高的要求，如靈敏度更高、特異性更好、檢測(cè)時(shí)間更短、成本更低和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等。

食品安全風(fēng)險(xiǎn)因子檢測(cè)方法中，高效液相色譜法、氣相色譜法等大型儀器檢測(cè)方法靈敏度好、操作簡(jiǎn)單，同時(shí)也存在檢測(cè)成本高、無(wú)法實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)等缺陷；免疫檢測(cè)法特異性好、檢測(cè)原理相對(duì)簡(jiǎn)單，但抗體的成本較高，并且性質(zhì)不夠穩(wěn)定；功能核酸生物傳感器種類多樣，無(wú)需大型儀器設(shè)備，通過(guò)信號(hào)擴(kuò)增技術(shù)可以提高檢測(cè)靈敏度，檢測(cè)成本相對(duì)較低。功能核酸能夠通過(guò)特定核酸結(jié)構(gòu)發(fā)揮相應(yīng)功能，功能核酸生物傳感器應(yīng)用功能核酸實(shí)現(xiàn)信號(hào)識(shí)別、信號(hào)放大或信號(hào)輸出。

恒溫技術(shù)是無(wú)需變換溫度即可進(jìn)行相關(guān)反應(yīng)，達(dá)到目的效果的技術(shù)，因此無(wú)需變溫設(shè)備，能夠在一定程度上節(jié)省檢測(cè)時(shí)間、降低檢測(cè)成本。恒溫技術(shù)僅需恒溫儀器，部分恒溫技術(shù)甚至無(wú)需溫度控制相關(guān)儀器，在室溫下即可進(jìn)行。為了降低對(duì)儀器設(shè)備的依賴度，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，恒溫技術(shù)在功能核酸生物傳感器中得到發(fā)展和應(yīng)用。通常，生物傳感器由3部分組成：信號(hào)識(shí)別元件、信號(hào)放大元件和信號(hào)輸出元件。根據(jù)恒溫技術(shù)在傳感器中的不同作用，可將恒溫技術(shù)劃分為恒溫介導(dǎo)的信號(hào)識(shí)別技術(shù)、恒溫介導(dǎo)的信號(hào)放大技術(shù)、恒溫介導(dǎo)的信號(hào)輸出技術(shù)3大類（圖1）。

圖 功能核酸生物傳感器中的恒溫技術(shù)分類圖

1 恒溫技術(shù)介導(dǎo)的信號(hào)識(shí)別技術(shù)

1.1 核酸靶物質(zhì)識(shí)別技術(shù)

使用功能核酸生物傳感器進(jìn)行核酸靶物質(zhì)檢測(cè)時(shí)，最常用的就是引物和探針。引物和探針都是基于堿基互補(bǔ)配對(duì)原則來(lái)識(shí)別特定核酸序列的。不同之處在于，引物與核酸結(jié)合后要進(jìn)行延伸，所以引物的3′端必須有羥基，為引物延伸做準(zhǔn)備。探針通過(guò)多年的發(fā)展和改進(jìn)，已經(jīng)與多種技術(shù)進(jìn)行結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)信號(hào)識(shí)別和信號(hào)輸出雙重功能。最常用的是熒光探針，在核酸兩端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，通過(guò)改變標(biāo)記的基團(tuán)之間的距離產(chǎn)生熒光信號(hào)的變化。例如，taqman探針、小溝結(jié)合（Minor groove binder，MGB）探針和分子信標(biāo)等。引物和探針在進(jìn)行核酸識(shí)別中最為經(jīng)典，但是其特異性有待提升，未來(lái)可以與新興納米材料進(jìn)行結(jié)合，在生物傳感器中實(shí)現(xiàn)更多功能。

1.2 非核酸靶物質(zhì)識(shí)別技術(shù)

1.2.1 適配體 適配體是一類能夠特異性結(jié)合靶物質(zhì)的脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid，DNA）或者核糖核酸（Ribonucleic acid，RNA）片段。適配體的特異性主要由核酸序列決定。相比于抗體，適配體具有穩(wěn)定性高、成本低、不存在批次差異和便于保存等特點(diǎn)。此外，適配體在實(shí)際檢測(cè)應(yīng)用中便于被修飾和固定，并且適配體信號(hào)識(shí)別模式容易與核酸擴(kuò)增相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，提高檢測(cè)靈敏度。

適配體通常是由體外篩選得到的，其中指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）篩選方法應(yīng)用最為廣泛。SELEX方法是Ellington和Szostak等［1］于1990年發(fā)明的。在此基礎(chǔ)上，發(fā)展多種SELEX的改進(jìn)方法，如轉(zhuǎn)換 SELEX［2］、毛細(xì)管電泳SELEX［3］和微流控 SELEX［4］。

目前適配體在多個(gè)檢測(cè)方法中有廣泛應(yīng)用，如光學(xué)、電化學(xué)和質(zhì)量測(cè)定。此外，其可以作為治療劑［5］、抗感染藥［6］和藥物遞送分子［7］，并且可以用于癌癥檢測(cè)［8］。適配體的性能優(yōu)越，更多物質(zhì)的適配體將會(huì)出現(xiàn)，篩選特異性高、親和力強(qiáng)的適配體的相關(guān)研究將會(huì)增加。

1.2.2 脫氧核酶 第一個(gè)脫氧核酶是于1994年用Pb2+篩選的RNA切割核酶［9］。切割核酶由酶鏈和底物鏈兩部分組成。當(dāng)特定的物質(zhì)存在時(shí)，與酶鏈相互作用，其切割特性被激活，底物鏈在特定位點(diǎn)被切割。RNA切割核酶的底物鏈中插入了核糖核苷酸，并在核糖核苷酸處被切割。切割核酶識(shí)別靶物質(zhì)的特異性主要是由酶鏈的序列決定的。RNA切割核酶相比于DNA切割核酶切割效率更高，所以應(yīng)用更加廣泛。

根據(jù)激活切割活性物質(zhì)的不同，切割核酶可以分為金屬核酶和非金屬核酶。以金屬離子作為切割活性激活物質(zhì)的RNA切割核酶被廣泛應(yīng)用于功能核酸生物傳感器中。多種金屬離子的切割核酶被篩選，如 Mg2+［10］、Zn2+［11］等。另外，微生物分泌物［12］、組氨酸［13］等也可以激活核酶的切割活性。部分RNA切割核酶能夠被不同物質(zhì)激活切割活性，今后對(duì)RNA切割核酶特異性的研究需進(jìn)一步加強(qiáng)。

1.2.3 點(diǎn)擊反應(yīng) 點(diǎn)擊化學(xué)，又譯為“鏈接化學(xué)”、“動(dòng)態(tài)組合化學(xué)”、“速配接合組合式化學(xué)”，是在2001年引入的一個(gè)合成概念，主旨是通過(guò)小單元的拼接來(lái)快速可靠地完成形形色色分子的化學(xué)合成［14］。點(diǎn)擊化學(xué)的代表反應(yīng)為銅催化的疊氮-炔基環(huán)加成反應(yīng)，此原理廣泛應(yīng)用于銅離子的檢測(cè)。

Ge等［15］開(kāi)發(fā)了一種基于點(diǎn)擊反應(yīng)的銅離子檢測(cè)方法。作者將G-四聯(lián)體序列進(jìn)行劈裂，將兩段G-四聯(lián)體序列的3′端和5′端分別修飾疊氮基和炔基。當(dāng)沒(méi)有銅離子時(shí)，不能發(fā)生點(diǎn)擊反應(yīng)，G-四聯(lián)體無(wú)法發(fā)揮過(guò)氧化物酶催化活性。當(dāng)銅離子存在時(shí)，在銅離子的催化作用下，發(fā)生點(diǎn)擊反應(yīng)，形成完整的G-四聯(lián)體序列，在氯化血紅素和過(guò)氧化氫存在時(shí)，催化TMB產(chǎn)生有色物質(zhì)。借助酶標(biāo)儀，最低檢測(cè)限可達(dá)5.9 nmol/L。此外，還可以通過(guò)金納米顆粒的顏色特性，利用銅離子催化點(diǎn)擊反應(yīng)的性質(zhì)檢測(cè)銅離子［16］。點(diǎn)擊反應(yīng)原理簡(jiǎn)單，容易實(shí)現(xiàn)，今后的研究中可以將其與更多功能核酸結(jié)合應(yīng)用于傳感器檢測(cè)中。

1.2.4 錯(cuò)配 通常，單鏈DNA可以基于堿基互補(bǔ)配對(duì)原則通過(guò)形成氫鍵產(chǎn)生穩(wěn)定的DNA雙鏈結(jié)構(gòu)。但是，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，若兩條鏈都為胸腺嘧啶（Thymine，T），在汞離子（Hg2+）存在時(shí)，可以形成T-Hg2+-T錯(cuò)配結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定DNA雙鏈結(jié)構(gòu)。能夠形成相似結(jié)構(gòu)的還有胞嘧啶（Cytosine，C）和銀離子（Ag+），形成C-Ag+-C結(jié)構(gòu)?；谏鲜鲈?，多種銀離子和汞離子的檢測(cè)方法被開(kāi)發(fā)。

錯(cuò)配結(jié)構(gòu)可以與不同的核酸結(jié)構(gòu)結(jié)合，如發(fā)卡和G-四聯(lián)體。Stobiecka等［17］利用T-Hg2+-T錯(cuò)配開(kāi)發(fā)了一種由汞離子和半胱氨酸作為開(kāi)關(guān)的檢測(cè)方法。作者將發(fā)卡頸部的序列插入一個(gè)T-T錯(cuò)配，發(fā)卡序列兩端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)。起始為發(fā)卡打開(kāi)的狀態(tài)，有熒光信號(hào)，當(dāng)汞離子存在時(shí)，發(fā)卡結(jié)構(gòu)形成，熒光淬滅。當(dāng)再加入半胱氨酸時(shí)，半胱氨酸能夠與汞離子結(jié)合，導(dǎo)致發(fā)卡結(jié)構(gòu)被破壞，熒光信號(hào)再次產(chǎn)生。Li等［18］將C-C錯(cuò)配設(shè)計(jì)在G-四聯(lián)體序列中，銀離子的存在與否會(huì)影響G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)的形成。當(dāng)環(huán)境中存在游離的銀離子，G-四聯(lián)體可以在氯化血紅素存在時(shí)催化ABTS反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè)。

2 恒溫技術(shù)介導(dǎo)的信號(hào)放大技術(shù)

2.1 非酶依賴的信號(hào)放大技術(shù)

2.1.1 雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Hybridization chain reaction，HCR）是一個(gè)無(wú)酶參與的擴(kuò)增過(guò)程，于2004年被Dirks和Pierce［19］報(bào)道。首先，需要設(shè)計(jì)合理的發(fā)卡引物（H1和H2）和核酸促發(fā)因子。發(fā)卡通常由三部分構(gòu)成：頸、環(huán)及toehold序列。toehold序列的長(zhǎng)度是HCR的決定性因素，如果太短，則不足以啟動(dòng)HCR反應(yīng)。研究表明，當(dāng)toehold序列為6-10個(gè)堿基對(duì)時(shí)，HCR反應(yīng)的速率比較穩(wěn)定［20］?；趖oehold原理，觸發(fā)子可以破壞發(fā)卡1結(jié)構(gòu)，將發(fā)卡1 部分單鏈暴露出來(lái)，繼而打開(kāi)發(fā)卡2，實(shí)現(xiàn)相互雜交，得到長(zhǎng)雙鏈DNA產(chǎn)物。通過(guò)與熒光染料、G-四聯(lián)體、納米顆粒、電化學(xué)信號(hào)物質(zhì)等結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)HCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)輸出、電化學(xué)信號(hào)輸出、化學(xué)發(fā)光信號(hào)輸出、可視化信號(hào)輸出等。目前HCR已經(jīng)應(yīng)用于多種靶物質(zhì)的檢測(cè)，如核酸（DNA或RNA）、小分子、金屬離子甚至癌細(xì)胞。

2.1.2 三明治結(jié)構(gòu) 三明治結(jié)構(gòu)（Sandwich）在生物檢測(cè)、臨床分析、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。相比于普通的識(shí)別模式，sandwich需要分析物質(zhì)與兩個(gè)識(shí)別物結(jié)合，這大大提高了其特異性。在核酸檢測(cè)中，普通sandwich只有一個(gè)信號(hào)分子，為了實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大的目的，核酸檢測(cè)中可以在sandwich的基礎(chǔ)上增加了多重信號(hào)探針，這種技術(shù)即為supersandwich。Xia等［21］率先開(kāi)展了相關(guān)研究工作。他們采用了標(biāo)記亞甲基藍(lán)的探針，當(dāng)靶物質(zhì)存在時(shí)，可與信號(hào)探針雜交形成黏性末端，暴露出的單鏈可繼續(xù)結(jié)合靶物質(zhì)，進(jìn)而結(jié)合信號(hào)探針，如此循環(huán)形成supersandwich結(jié)構(gòu)。這種方法的檢測(cè)限（100 fmol/L）明顯低于普通sandwich的檢測(cè)限（100pmol/L）。在此基礎(chǔ)上，Chen等［22］引入輔助探針，與信號(hào)探針的兩個(gè)部分互補(bǔ)配對(duì)，當(dāng)靶物質(zhì)存在時(shí)，結(jié)合信號(hào)探針形成粘性末端，結(jié)合輔助探針，進(jìn)而再次結(jié)合信號(hào)探針，如此循環(huán)，實(shí)現(xiàn)僅一個(gè)靶物質(zhì)分子就可以生成帶有多個(gè)信號(hào)探針的DNA長(zhǎng)雙鏈。此方法檢測(cè)限低至100 amol/L。

2.2 酶依賴的信號(hào)擴(kuò)增技術(shù)

2.2.1 環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) 環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）最早由Notomi等［23］在2000年提出，是一種簡(jiǎn)單（一步式）、快速、高靈敏（6 拷貝數(shù)）的核酸擴(kuò)增技術(shù)。LAMP擴(kuò)增的實(shí)現(xiàn)依賴于其特殊的引物（每次擴(kuò)增需4-6個(gè)引物）和有鏈置換作用的Bst DNA聚合酶。在擴(kuò)增過(guò)程中，引物識(shí)別模板鏈特定的DNA片段。擴(kuò)增初期，4條引物被使用，分別為上下游內(nèi)外引物，在Bst DNA聚合酶的作用下延伸，形成啞鈴形的DNA結(jié)構(gòu)，然后進(jìn)行延伸和鏈替代，得到雙鏈DNA產(chǎn)物［24］。整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程在60-65℃環(huán)境下，45-60 min內(nèi)即可完成。

LAMP擴(kuò)增靈敏度高，可以擴(kuò)增6拷貝數(shù)的DNA片段，但是也容易被污染，產(chǎn)生假陽(yáng)性。擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過(guò)濁度檢測(cè)、電泳檢測(cè)、熒光檢測(cè)（熒光染料）等多種方式表征。隨著LAMP技術(shù)的發(fā)展，多重LAMP擴(kuò)增方法目前已與多種技術(shù)結(jié)合，應(yīng)用于檢測(cè)領(lǐng)域，如多重微流控LAMP［25］、實(shí)時(shí)多重LAMP［26］。Chen 等［27］將多重 LAMP 與核酸側(cè)流層析傳感器進(jìn)行結(jié)合。LAMP擴(kuò)增過(guò)程中采用2條內(nèi)引物做半抗原標(biāo)記，靶標(biāo)物質(zhì)的兩端通過(guò)“半抗原標(biāo)記-抗體”識(shí)別體系進(jìn)行檢測(cè)，最后通過(guò)金納米粒子進(jìn)行信號(hào)輸出。使用該方法，可在50 min內(nèi)完成銅綠假單胞菌和其毒素基因的檢測(cè)，最低檢測(cè)限可達(dá)20 CFU/mL。

2.2.2 依賴解旋酶擴(kuò)增技術(shù)（Helicase-dependent amplification，HDA） 該技術(shù)在2004年被首次報(bào)道，是一種類似于體內(nèi)DNA復(fù)制的擴(kuò)增方式［28］。HDA利用解旋酶在三磷酸腺苷存在情況下的解旋活性，將DNA雙鏈打開(kāi)，無(wú)需熱熔解步驟。為了防止DNA鏈再次結(jié)合，加入單鏈結(jié)合蛋白與解旋的DNA單鏈結(jié)合。上游引物和下游引物與DNA單鏈結(jié)合，在DNA聚合酶的作用下延伸形成新鏈，新鏈又會(huì)被解旋酶打開(kāi)并被單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合，從而進(jìn)入新一輪的解旋擴(kuò)增循環(huán)，如此反復(fù)循環(huán)。在60-65℃的單一溫度下，60-120 min內(nèi)即可達(dá)到指數(shù)擴(kuò)增。HDA系統(tǒng)中使用的熱穩(wěn)定UvrD解旋酶極大地提高了該方法在更高溫度（60-65℃）下的特異性和靈敏度。但是解旋酶UvrD的解旋速度（20 bp/s）和持續(xù)性（每個(gè)結(jié)合解旋少于100 bp）導(dǎo)致HDA不適用于長(zhǎng)鏈擴(kuò)增［28］。

HDA已經(jīng)被應(yīng)用于多種靶物質(zhì)的檢測(cè)，如致病菌、埃博拉病毒RNA及單堿基突變等。在與功能核酸側(cè)流層析傳感器聯(lián)用時(shí)，通常將HDA反應(yīng)體系中的上、下游引物分別做半抗原標(biāo)記，通過(guò)HDA擴(kuò)增獲得兩端有不同半抗原標(biāo)記的雙鏈DNA產(chǎn)物［29］。Tong等［30］結(jié)合限制性切克內(nèi)切酶來(lái)提高檢測(cè)過(guò)程中的特異性、減少擴(kuò)增反應(yīng)所需的時(shí)間。

2.2.3 重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（Recombinase polymerase amplification，RPA） 2006 年 Piepenburg 等［31］首次報(bào)道該技術(shù)。在核酸擴(kuò)增技術(shù)中，重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)引起格外的注意RPA。RPA沒(méi)有初始DNA雙鏈熔解步驟，在37-42℃之間，20 min內(nèi)即可完成擴(kuò)增。重組酶聚合酶技術(shù)包括3種核心成分：結(jié)合單鏈核酸的重組酶、單鏈結(jié)合蛋白及具有鏈置換活性DNA聚合酶。在擴(kuò)增過(guò)程中，重組酶與引物結(jié)合形成復(fù)合物定向?qū)ふ彝葱蛄小．?dāng)找到靶序列時(shí)，在重組酶的作用下雙鏈DNA被打開(kāi)，引物插入。為了防止雙鏈重新結(jié)合，單鏈結(jié)合蛋白與被打開(kāi)的單鏈DNA結(jié)合。在DNA聚合酶的作用下，引物延伸得到新鏈，完成DNA模板鏈的指數(shù)型擴(kuò)增。

RPA可以有效擴(kuò)增DNA和RNA模板，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種目標(biāo)的檢測(cè)，包括細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)、癌細(xì)胞、病毒和轉(zhuǎn)基因。檢測(cè)和擴(kuò)增時(shí)間的限制不同，可能與靶物質(zhì)序列、樣品種類、引物和擴(kuò)增子長(zhǎng)度等有關(guān)系。RPA在終點(diǎn)檢測(cè)和實(shí)時(shí)檢測(cè)中都有應(yīng)用，其中具有代表性的是試紙條檢測(cè)［32］和實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)［33］。試紙條提供了一種低成本、可視的定性/半定量檢測(cè)方法。相反，實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)能夠?qū)崿F(xiàn)擴(kuò)增過(guò)程的實(shí)時(shí)檢測(cè)，但需要特定的信號(hào)讀取設(shè)備。

2.2.4 交叉引物擴(kuò)增技術(shù) 交叉引物擴(kuò)增技術(shù)（Cross-priming amplification，CPA）是由杭州優(yōu)思達(dá)公司獨(dú)立研發(fā)成功的一種新的核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，也是中國(guó)首個(gè)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的核酸擴(kuò)增技術(shù)。CPA擴(kuò)增體系中除包含具有鏈置換功能的Bst DNA聚合酶大片段外，還包括多條擴(kuò)增引物，在Bst DNA聚合酶在作用下，不同位置的引物發(fā)生連續(xù)的循環(huán)擴(kuò)增［34］。該反應(yīng)通常在65℃恒溫下進(jìn)行，得到雙鏈DNA產(chǎn)物。反應(yīng)時(shí)間約1 h。

CPA擴(kuò)增成本低，操作簡(jiǎn)單，在致病菌檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因檢測(cè)、病毒檢測(cè)等都有應(yīng)用。CPA擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過(guò)濁度、擴(kuò)增子電泳、雙鏈DNA特異性熒光染料或環(huán)磷酸熒光試劑等進(jìn)行檢測(cè)。另外，也可以與試紙條檢測(cè)傳感器聯(lián)合使用。Wang等［35］報(bào)道的多重CPA結(jié)合多重核酸側(cè)流層析傳感器，通過(guò)引物設(shè)計(jì)和側(cè)流層析傳感器檢測(cè)線數(shù)量調(diào)整實(shí)現(xiàn)了多重檢測(cè)。

2.2.5 等溫鏈置換聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（Isothermal stranddisplacement polym-erase reaction，ISDPR） ISDPR基于一條發(fā)夾模板、一條線性引物和具有鏈置換活性的DNA聚合酶，發(fā)夾與單鏈靶標(biāo)DNA雜交后被打開(kāi)暴露出單鏈模板，線性引物進(jìn)一步與模板DNA雜交并在DNA聚合酶延伸后替代靶標(biāo)DNA，得到雙鏈DNA產(chǎn)物，而被替代的靶標(biāo)DNA可以繼續(xù)打開(kāi)新的發(fā)夾模板實(shí)現(xiàn)循環(huán)擴(kuò)增，從而達(dá)到大量擴(kuò)增的目的，該反應(yīng)通常在42℃恒溫下進(jìn)行。

此恒溫?cái)U(kuò)增方式設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，操作方便。He等［36］將ISDPR反應(yīng)與試紙條聯(lián)合使用，實(shí)現(xiàn)核酸的可視化檢測(cè)。作者將發(fā)卡和引物分別標(biāo)記生物素和地高辛，所以擴(kuò)增產(chǎn)物的兩端分別被標(biāo)記了生物素和地高辛。在試紙條檢測(cè)線標(biāo)記生物素抗體，擴(kuò)增產(chǎn)物可以被固定在試紙條上，然后標(biāo)記地高辛抗體的金納米顆粒與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合，實(shí)現(xiàn)顏色信號(hào)的輸出。

2.2.6 切克內(nèi)切酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Nicking endonuclease mediated isothermal amplification，NEMA）NEMA是利用切克內(nèi)切酶和Bst DNA聚合酶實(shí)現(xiàn)的擴(kuò)增反應(yīng)。切克內(nèi)切酶能夠識(shí)別DNA雙鏈特定的序列，并在特定位置切割其中的一條DNA鏈。DNA鏈?zhǔn)紫缺黄胀ㄒ锖蛶в星懈钗稽c(diǎn)的引物擴(kuò)增，得到帶有切割位點(diǎn)的DNA雙鏈產(chǎn)物。雙鏈DNA的其中一條鏈被切克內(nèi)切酶切割，在其他引物的作用下延伸，發(fā)生鏈替代擴(kuò)增反應(yīng)。NEMA的擴(kuò)增產(chǎn)物為DNA單鏈。

通常切克內(nèi)切酶的最適孵育溫度為55-65℃。另外，NEMA可以擴(kuò)增400-500 bp的DNA序列，可以滿足日常分子診斷需求。有報(bào)道NEMA可以用于定量檢測(cè)。例如，Xu等［37］開(kāi)發(fā)出NEMA-SMB擴(kuò)增方式，將NEMA與分子信標(biāo)進(jìn)行結(jié)合，分子信標(biāo)使擴(kuò)增過(guò)程以熒光信號(hào)的方式被表征出來(lái)，實(shí)現(xiàn)高特異性和高靈敏度的定量檢測(cè)。雖然NEMA用于全基因組擴(kuò)增時(shí)反應(yīng)體系不夠穩(wěn)定，但是仍可作為鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)的一個(gè)替代選擇。

2.2.7 核酸序列依賴擴(kuò)增技術(shù)（Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA） NASBA 于 1991年被首次報(bào)道［38］，NASBA技術(shù)通過(guò)AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、T7RNA聚合酶、RNase H三種酶和一對(duì)引物（下游引物5′端帶有T7RNA聚合酶啟動(dòng)子序列）得到RNA單鏈產(chǎn)物。NASBA被設(shè)計(jì)用于RNA擴(kuò)增，但是某些情況下也可用于DNA擴(kuò)增。NASBA反應(yīng)溫度通常為4℃，反應(yīng)前需要雙鏈高溫分離步驟，若為DNA雙鏈，則需95℃處理，若為RNA，則需65℃處理。反應(yīng)時(shí)間從1.5-3 h不等。NASBA技術(shù)能直接使用RNA單鏈做模板，有效降低核酸污染。

多重 NASBA在1999年被首次報(bào)道，研究人員在一個(gè)NASBA反應(yīng)中使用生物素和ECL標(biāo)記定量檢測(cè)兩個(gè)mRNAs［39］。另外，通過(guò)使用不同的熒光素基團(tuán)標(biāo)記的分子信標(biāo)，可以實(shí)現(xiàn)多重實(shí)時(shí)NASBA［40］，可以使用特定的激發(fā)光和發(fā)射光濾光片同時(shí)測(cè)量不同的熒光團(tuán)。

2.2.8 滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（Rolling cycling amplification，RCA） RCA通過(guò)使用環(huán)狀DNA模板和高度持續(xù)的DNA或RNA聚合酶實(shí)現(xiàn)短核酸靶標(biāo)的擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物為含有與環(huán)狀模板互補(bǔ)的串聯(lián)序列的長(zhǎng)單鏈核酸。當(dāng)短核酸鏈與環(huán)狀DNA模板結(jié)合時(shí)，在聚合酶的作用下開(kāi)始延伸，并替代已合成的鏈，形成長(zhǎng)單鏈產(chǎn)物，長(zhǎng)度可達(dá)105堿基。用于擴(kuò)增RNA靶標(biāo)時(shí)，通常使用T7 RNA聚合酶；用于DNA靶標(biāo)時(shí)，通常使用噬菌體Φ29酶、Bst和Vent exo-DNA聚合酶。RCA擴(kuò)增通常在30-65℃下進(jìn)行，在30-90 min內(nèi)即可完成擴(kuò)增［41］，并且在10拷貝數(shù)DNA存在時(shí)即可啟動(dòng)反應(yīng)。為了提高RCA反應(yīng)的擴(kuò)增效率，超支化RCA和網(wǎng)狀RCA已經(jīng)被開(kāi)發(fā)［42］。

1998年首次將RCA應(yīng)用于生物檢測(cè)［43］。目前被應(yīng)用于DNA或者RNA的單堿基突變檢測(cè)、miRNA、蛋白質(zhì)、三磷酸腺苷等的檢測(cè)。人們嘗試將大多數(shù)檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于檢測(cè)RCA擴(kuò)增產(chǎn)物，如伏安法、熒光法、表面增強(qiáng)拉曼光譜、比色法和化學(xué)發(fā)光法。

2.2.9 等溫指數(shù)擴(kuò)增技術(shù)（Exponential amplification reaction，EXPAR） EXPAR首次于2003年被報(bào)道，此擴(kuò)增方式能夠?qū)崿F(xiàn)高靈敏度檢測(cè)，其擴(kuò)增的特異性取決于引物延伸和替代［44］。等溫指數(shù)擴(kuò)增技術(shù)以單鏈靶標(biāo)為引物，通過(guò)基于切克內(nèi)切酶和Bst DNA聚合酶實(shí)現(xiàn)的鏈置換反應(yīng)。根據(jù)靶標(biāo)自主設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)的單鏈模板，引物經(jīng)過(guò)DNA聚合酶延伸后與模板形成完整的切克內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，單鏈切割后發(fā)生鏈置換反應(yīng)。該反應(yīng)通常在65℃恒溫下進(jìn)行。

Wang等［45］運(yùn)用EXPAR進(jìn)行mRNA擴(kuò)增時(shí)，將第一輪EXPAR產(chǎn)物設(shè)計(jì)為新的EXPAR的引物，實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步的擴(kuò)增。但是EXPAR不能用于長(zhǎng)核酸鏈的擴(kuò)增，這限制了其應(yīng)用。

2.2.10 鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)（Strand displacement amplification，SDA） SDA最早是Walker等［46］于 1992年報(bào)道。SDA擴(kuò)增需要熱前處理解開(kāi)雙鏈DNA。SDA擴(kuò)增需要HincII限制性切割酶和具有鏈置換作用的聚合酶。SDA擴(kuò)增過(guò)程中所需引物5′端含有HincII限制酶識(shí)別的特定序列。因?yàn)楹铣芍惺褂脦€基修飾的脫氧腺苷三磷酸（Deoxyadenosine triphosphate，dATP）代替dATP，所以新合成的DNA鏈具有硫代磷酸酯修飾，不能被HincⅡ切割。原有引物在切割位點(diǎn)處被切割，在聚合酶作用下延伸3′末端并取代下游DNA鏈，以此達(dá)到擴(kuò)展目的。反應(yīng)溫度通常為30-55℃。

SDA被應(yīng)用于檢測(cè)多種靶物質(zhì)。SDA可以與熒光基團(tuán)結(jié)合用于致病菌的檢測(cè)，如結(jié)核分枝桿菌，擴(kuò)增過(guò)程中，熒光標(biāo)記探針與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合，使熒光強(qiáng)度隨擴(kuò)增的進(jìn)行增加。另外，通過(guò)與適配體結(jié)合，也被應(yīng)用于可卡因的檢測(cè)［47］?；赟DA擴(kuò)增原理，利用SYBR Green I表征擴(kuò)增產(chǎn)物，同樣可以實(shí)現(xiàn)miRNA的檢測(cè)。

2.2.11 循環(huán)探針技術(shù)（Cyclic probe technology，CPT） CPT與上述信號(hào)放大方式不同，CPT不擴(kuò)增靶序列，而是通過(guò)探針和酶的作用原理實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大［48］。循環(huán)探針為25-30 bp的單鏈多核苷酸，包括3部分：3′端DNA、中間4-6堿基的RNA和5′端DNA。循環(huán)探針可以與靶物質(zhì)雜交形成雙鏈。RNase H酶僅能探針-靶物質(zhì)雜合物的切割磷酸-核糖核苷酸化學(xué)鍵，所以探針被切割為兩段序列，靶物質(zhì)可以重新和未切割探針結(jié)合，循環(huán)后獲得大量切割后的探針片段DNA。此方法僅能應(yīng)用于DNA靶物質(zhì)。CPT反應(yīng)溫度為55-65℃。CPT產(chǎn)物可以通過(guò)多種方式檢測(cè)，最常見(jiàn)的是通過(guò)使用放射性同位素標(biāo)記探針的聚丙烯酰胺凝膠電泳，抗體介導(dǎo)的比色酶測(cè)定和試紙條也可以實(shí)現(xiàn)CPT產(chǎn)物檢測(cè)。CPT可以在某些條件下顯示線性響應(yīng)，便于定量。

2.2.12 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（Terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT） TdT是一種催化脫氧核苷酸結(jié)合到DNA或RNA分子的3′羥基端的無(wú)需模板的DNA聚合酶，最早于1958年在牛胸腺中發(fā)現(xiàn)［49］。TdT可以催化dNTP或標(biāo)記了小分子的dNTP，如Cy3-dNTP，biotin-dNTP，聚合于RNA或單雙鏈DNA的3′-OH末端的反應(yīng)，該反應(yīng)不需要特定模板，但引物必須是至少有3個(gè)以上堿基的寡核苷酸。TdT酶通常在37℃下使用。

當(dāng)被用于檢測(cè)中信號(hào)放大時(shí)，TdT酶通常與dGTPs相結(jié)合，增加G-四聯(lián)體的含量。Liu等［50］通過(guò)TdT酶聚合制備富含G的隨機(jī)DNA序列，并證明了這種隨機(jī)富含G的DNA能夠形成G-四聯(lián)體。他們研發(fā)了兩種檢操作單且無(wú)標(biāo)記的檢測(cè)TdT酶活性的策略，包括基于脫氧核糖核酸酶的比色測(cè)定法和實(shí)時(shí)熒光測(cè)定法。該實(shí)驗(yàn)的實(shí)時(shí)檢測(cè)方法為臨床診斷中關(guān)鍵酶的生化分析提供了一種可行的方法，且操作相對(duì)于傳統(tǒng)方法更加簡(jiǎn)便。

3 恒溫技術(shù)介導(dǎo)的信號(hào)輸出技術(shù)

3.1 恒溫技術(shù)介導(dǎo)的熒光信號(hào)輸出技術(shù)

熒光信號(hào)是比較靈敏的信號(hào)輸出方式，在功能核酸生物傳感器中應(yīng)用廣泛。熒光產(chǎn)生機(jī)理有所不同，最為經(jīng)典的是熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理。熒光共振能量轉(zhuǎn)移是指一個(gè)體系含有能量供體與能量受體兩個(gè)熒光團(tuán)，在供體被激發(fā)光所激發(fā)后可以向受體發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，進(jìn)而受體被激發(fā)，發(fā)出熒光，該種能量的屬性是非輻射的［51］。

根據(jù)其與核酸的作用方式不同，熒光信號(hào)分子可以大致分為標(biāo)記型和免標(biāo)記型。標(biāo)記型是指將熒光信號(hào)分子通過(guò)共價(jià)鍵的方式，標(biāo)記在核酸鏈上，通過(guò)核酸結(jié)構(gòu)或位置的改變，對(duì)熒光信號(hào)產(chǎn)生影響?？梢詷?biāo)記在核酸鏈上的熒光基團(tuán)有羅丹明類、熒光素類及多環(huán)芳烴類等。非標(biāo)記型中最具有代表性的是核酸染料，如單鏈核酸結(jié)合染料SYBR Gold、SYBR Green Ⅱ等，雙鏈核酸結(jié)合染料SYBR Green I、TOTO-3等。納米材料在熒光信號(hào)輸出方面也有不同形式的應(yīng)用，如金屬納米簇、量子點(diǎn)等。

3.2 恒溫技術(shù)介導(dǎo)的可視化信號(hào)輸出技術(shù)

可視化檢測(cè)主要是通過(guò)顏色的變化來(lái)實(shí)現(xiàn)的，無(wú)需借助任何儀器設(shè)備就可以獲得檢測(cè)結(jié)果。也可以借助酶標(biāo)儀等儀器，進(jìn)行更加準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析和定量檢測(cè)。顏色信號(hào)一方面可以通過(guò)納米材料在溶液中的狀態(tài)產(chǎn)生變化；另一方面可以通過(guò)催化底物產(chǎn)生有色物質(zhì)發(fā)生變化。

通過(guò)在溶液中的狀態(tài)來(lái)產(chǎn)生顏色變化最具有代表性的是金納米顆粒。金納米顆粒有靈敏度高、顏色變化明顯、便于修飾核酸鏈等優(yōu)勢(shì)。DNA單鏈可以穩(wěn)定金納米顆粒的分散狀態(tài)，呈現(xiàn)紅色。而DNA雙鏈可以促進(jìn)金納米顆粒聚集呈現(xiàn)藍(lán)色。除此之外，還可以通過(guò)金硫鍵將核酸鏈修飾到金納米顆粒的表面，通過(guò)核酸鏈的堿基互補(bǔ)，促進(jìn)金納米顆粒形成聚集狀態(tài)。

目前發(fā)現(xiàn)G-四聯(lián)體和氯化血紅素復(fù)合物及很多納米材料有催化活性，通過(guò)催化底物產(chǎn)生有色物質(zhì)也可以實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè)。Wu等［52］利用此原理進(jìn)行L-半胱氨酸的檢測(cè)。首先使用富胞嘧啶序列的DNA制備了DNA-Ag/Pt納米簇，尺寸小、比表面積大的納米結(jié)構(gòu)能有更多的活性位點(diǎn)，更強(qiáng)的催化活性。當(dāng)加入L-半胱氨酸后，可以促進(jìn)納米簇聚集，催化活性降低，催化TMB產(chǎn)生的有色物質(zhì)變少，實(shí)現(xiàn)L-半胱氨酸的檢測(cè)，檢測(cè)限為2.0 nmol/L。

3.3 恒溫技術(shù)介導(dǎo)的電信號(hào)輸出技術(shù)

電化學(xué)生物傳感器具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、便于攜帶等優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)電化學(xué)信號(hào)產(chǎn)生的機(jī)理不同，可以大致分為兩大類：一是通過(guò)改變電極表面的電荷分布產(chǎn)生電信號(hào)；二是通過(guò)催化氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生電信號(hào)。通常，第一種機(jī)理所使用的電信號(hào)物質(zhì)通過(guò)直接標(biāo)記在核酸末端、與單雙鏈核酸結(jié)合、嵌入到具有特殊構(gòu)象的核酸中、游離于溶液中檢測(cè)等方式表征電化學(xué)信號(hào)的產(chǎn)生，包括亞甲基藍(lán)、六氨合釕、二茂鐵和鐵氰化鉀等。第二種則通過(guò)與底物相互作用，促進(jìn)氧化還原反應(yīng)和電子轉(zhuǎn)移產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)，常用的有G-四聯(lián)體、金屬有機(jī)框架等。

3.4 拉曼光譜信號(hào)輸出技術(shù)

1928年，Raman等［53］發(fā)現(xiàn)了拉曼散射現(xiàn)象。拉曼光譜屬于分子振動(dòng)光譜，可以反映分子的特征結(jié)構(gòu)。但是拉曼散射效應(yīng)是個(gè)非常弱的過(guò)程，目前應(yīng)用比較多的是表面增強(qiáng)拉曼光譜，用通常的拉曼光譜法測(cè)定吸附在膠質(zhì)金屬顆粒如銀、金或銅表面的樣品，或吸附在這些金屬片的粗糙表面上的樣品，其拉曼光譜的強(qiáng)度可提高103-106倍。關(guān)于增強(qiáng)機(jī)理的本質(zhì)，學(xué)術(shù)界目前仍未達(dá)成共識(shí)，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為SERS增強(qiáng)主要由物理增強(qiáng)和化學(xué)增強(qiáng)兩個(gè)方面構(gòu)成，并認(rèn)為前者占主導(dǎo)地位，而后者在增強(qiáng)效應(yīng)中只貢獻(xiàn)1-2個(gè)數(shù)量級(jí)。

Qian等［54］利用玻璃基質(zhì)標(biāo)記肽核酸發(fā)卡，當(dāng)靶物質(zhì)存在時(shí)，發(fā)卡結(jié)構(gòu)被打開(kāi)，并且復(fù)合物帶有負(fù)電荷，可以與銀納米粒子靜電吸附，增強(qiáng)拉曼光譜信號(hào)。檢測(cè)限可以達(dá)到34 pmol/L。

3.5 表面等離子共振信號(hào)輸出技術(shù)

表面等離子共振（Surface plasmon resonance，SPR）現(xiàn)象在傳感器中作為信號(hào)輸出方式被應(yīng)用。光在棱鏡與金屬膜表面上發(fā)生全反射現(xiàn)象時(shí)，會(huì)形成消逝波進(jìn)入到光疏介質(zhì)中，而在介質(zhì)（假設(shè)為金屬介質(zhì)）中又存在一定的等離子波，當(dāng)兩波相遇時(shí)可能會(huì)發(fā)生共振。當(dāng)消逝波與表面等離子波發(fā)生共振時(shí)，檢測(cè)到的反射光強(qiáng)會(huì)大幅度地減弱。當(dāng)反射光完全消失時(shí)入射角就是SPR角。SPR角隨金屬表面折射率變化而變化，而折射率的變化又與金屬表面結(jié)合的分子質(zhì)量成正比。因此可以通過(guò)對(duì)生物反應(yīng)過(guò)程中SPR角的動(dòng)態(tài)變化獲取生物分子之間相互作用的特異信號(hào)。Wang等［55］通過(guò)基于表面等離子體共振原理利用金納米粒子作為信號(hào)放大策略檢測(cè)microRNA。首先，他們將DNA探針標(biāo)記在金芯片上，當(dāng)靶物質(zhì)存在時(shí)可以引發(fā)sandwich結(jié)構(gòu)的形成，與標(biāo)記核酸鏈的金納米顆粒雜交。標(biāo)記金納米顆粒的核酸鏈可以在此基礎(chǔ)上不斷結(jié)合，實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大的效果，此方法檢測(cè)限達(dá)到45 pmol/L。傳感器檢測(cè)性能。恒溫介導(dǎo)的功能核酸生物傳感器具有巨大的發(fā)展?jié)摿?，需要更深入的研究?/p>

一方面，恒溫技術(shù)介導(dǎo)的功能核酸生物傳感器需要強(qiáng)有力的理論支持。相關(guān)恒溫技術(shù)需要得到更加深入的理論研究，以便為后續(xù)的優(yōu)化和應(yīng)用提供基礎(chǔ)。另一方面，恒溫技術(shù)介導(dǎo)的功能核酸生物傳感器需要進(jìn)一步與實(shí)際應(yīng)用相結(jié)合，并且從實(shí)際應(yīng)用的角度出發(fā)，進(jìn)行相關(guān)性能的優(yōu)化。

最后，交叉學(xué)科是一個(gè)重要的發(fā)展趨勢(shì)。通過(guò)將生物學(xué)、納米材料學(xué)、化學(xué)等學(xué)科綜合應(yīng)用，可以開(kāi)發(fā)性能更加優(yōu)越的檢測(cè)技術(shù)。如應(yīng)用納米材料具有尺寸效應(yīng)、磁性、酶催化活性等特點(diǎn)，將其與功能核酸相結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)信號(hào)擴(kuò)增或信號(hào)輸出的目的。通過(guò)將其他學(xué)科的技術(shù)與恒溫技術(shù)介導(dǎo)的功能核酸生物傳感器結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)更高靈敏度和更高特異性的檢測(cè)。

4 總結(jié)與展望

恒溫技術(shù)介導(dǎo)的功能核酸生物傳感器發(fā)展迅速，在信號(hào)識(shí)別、信號(hào)放大和信號(hào)輸出方面都展現(xiàn)了巨大的優(yōu)勢(shì)。在信號(hào)識(shí)別方面，恒溫技術(shù)介導(dǎo)的功能核酸生物傳感器通過(guò)適配體、RNA切割核酶、點(diǎn)擊反應(yīng)等方式實(shí)現(xiàn)靶物質(zhì)的高特異性識(shí)別；在信號(hào)擴(kuò)增方面，恒溫技術(shù)發(fā)揮了無(wú)需變溫設(shè)備的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)兼具擴(kuò)增時(shí)間短、擴(kuò)增產(chǎn)物多樣等特點(diǎn)，無(wú)酶擴(kuò)增方式不僅降低了檢測(cè)成本，同時(shí)也避免了酶活抑制劑對(duì)擴(kuò)增效果的影響；在信號(hào)輸出方面，熒光信號(hào)、可視化信號(hào)、電化學(xué)信號(hào)等靈敏度較高，可以提高