基于三螺旋核酸的生物傳感器的研究進(jìn)展

田晶晶 羅云波 許文濤

（北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

近年來(lái)，DNA納米技術(shù)迅猛發(fā)展。核酸的堿基序列不僅能夠攜帶生物遺傳信息，而且能夠被編輯、設(shè)計(jì)成各種一維、二維、三維的功能核酸納米器件進(jìn)行開關(guān)調(diào)控［1］、邏輯門操作［2］、電路計(jì)算［3］與納米機(jī)器運(yùn)轉(zhuǎn)［4］，在生物成像、體內(nèi)調(diào)控、傳感與檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。1957年，科學(xué)家Felsenfeld和Davies等［5］發(fā)現(xiàn)了多聚嘌呤鏈通過(guò)胡思特鍵（Hoogsteen bond）嵌入到雙鏈脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid，DNA）的大溝中形成三螺旋核酸。近10年來(lái)，基于三螺旋核酸的生物傳感技術(shù)日新月異地進(jìn)步，作為DNA納米技術(shù)工具箱的重要組成部分，三螺旋核酸傳感平臺(tái)在分子成像［6］、配體的攜帶與釋放［7-9］、細(xì)胞內(nèi)表達(dá)調(diào)控［10］與分析化學(xué)［11-16］領(lǐng)域的應(yīng)用不斷突破，取得了令人矚目的研究進(jìn)展。

三螺旋核酸（Triplex nucleic acids，TNAs）是在經(jīng)典的沃森-克里克（Waston-Crick）氫鍵形成的雙鏈核酸基礎(chǔ)上，第三條寡核苷酸鏈以非經(jīng)典的胡斯特（Hoogsteen）氫鍵嵌入到雙鏈大溝中形成的超分子核酸組裝體。在眾多生物傳感方法中，基于TNAs的生物傳感平臺(tái)憑借其快速、靈敏、簡(jiǎn)單及可逆等特點(diǎn)而備受關(guān)注。本文首先綜述了三螺旋生物傳感器的核酸類別和性質(zhì)；然后歸納總結(jié)了常見的TNAs生物傳感器；論述了TNAs生物傳感器在分子成像、配體的攜帶與釋放、細(xì)胞內(nèi)表達(dá)調(diào)控與分析化學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用；最后，對(duì)TNAs生物傳感器未來(lái)的發(fā)展方向進(jìn)行了展望。

1 TNAs生物傳感器的分類、性質(zhì)與表征

三螺旋核酸是TNAs生物傳感器的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。按照堿基種類的差異，可將三螺旋核酸分為嘧啶-嘌呤*嘧啶型三螺旋和嘧啶-嘌呤*嘌呤型三螺旋；按照形成方式的不同，可將三螺旋核酸分為分子內(nèi)三螺旋與分子間三螺旋；按照核酸類型的差別，可將三螺旋核酸分為DNA三螺旋、RNA三螺旋、DNA/RNA三螺旋和PNA三螺旋；按照第三鏈與雙鏈形成三螺旋核酸的方向不同，可將三螺旋核酸分為平行結(jié)構(gòu)和反平行結(jié)構(gòu)兩種類別。

目前，三螺旋核酸的表征方法主要包括：紫外-及可見分光光度法［17］、熒光分析法［18］、原子力顯微鏡觀察法［6］、圓二色譜法［19］及電泳法［20］。鑒于合成生物學(xué)的發(fā)展，熒光基團(tuán)標(biāo)記的熒光探針具有易合成、高靈敏等優(yōu)勢(shì)，熒光分析法逐漸成為表征TNAs生物傳感器的主流方法。

TNAs的形成是制作TNAs生物傳感器的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。目前TNAs的穩(wěn)定形成受如下因素影響：（1）pH：酸性條件促進(jìn)胞嘧啶（cytosine，C）質(zhì)子化、促進(jìn)胞嘧啶-鳥嘌呤（guanine，G）*胞嘧啶-（C-G*C）堿基對(duì)的穩(wěn)定形成及促進(jìn)TNAs的穩(wěn)定形成；中性條件促進(jìn)胸腺嘧啶-腺嘌呤（Adenine，A）*胸腺嘧啶-（T-A*T）堿基對(duì)的穩(wěn)定形成、從而促進(jìn)TNAs的穩(wěn)定形成［18］；（2）Mg2+：雙鏈核酸是TNAs形成的必要條件，Mg2+通過(guò)穩(wěn)定雙鏈核酸的形成、促進(jìn)TNAs的形成［21］；（3）Ag+：Ag+通過(guò)與 C-G*C 堿基對(duì)絡(luò)合形成穩(wěn)定的C-G*C Ag+結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定三螺旋DNA的形成［22］；（4）化合物 ：氯化甲氧檗［13］與二醚二酞酰亞胺化合物［23］發(fā)揮類黏合劑樣作用，穩(wěn)定三螺旋DNA的形成；稠環(huán)芳烴的菲與芘，可以作為連接子，連接第三鏈與雙鏈，促進(jìn)單鏈分子內(nèi)三螺旋DNA與及異質(zhì)二聚體間三螺旋DNA的形成［19］。

2 三螺旋生物傳感器

2.1 三螺旋DNA生物傳感器

三螺旋DNA生物傳感器是以DNA鏈構(gòu)成的核酸三螺旋為結(jié)構(gòu)單元的生物傳感器，占目前已報(bào)道的TNAs生物傳感器的大多數(shù)，類型多樣且用途廣泛。根據(jù)DNA三螺旋的形態(tài)差異，將三螺旋DNA生物傳感器分為如下類型。

2.1.1 三鏈DNA三螺旋生物傳感器 三鏈DNA三螺旋生物傳感器是當(dāng)?shù)谌龡lDNA鏈以Hoogsteen鍵嵌入雙鏈DNA的大溝中形成三鏈DNA組裝體、實(shí)現(xiàn)信號(hào)輸出的生物傳感器（圖1-A）。2010年，意大利羅馬大學(xué)的Francesco Ricci教授團(tuán)隊(duì)利用這種傳感策略，將標(biāo)記有電化學(xué)信號(hào)分子（甲基藍(lán)）的第三鏈標(biāo)記在金電極上作為識(shí)別元件識(shí)別特異的雙鏈DNA靶標(biāo)，當(dāng)且僅當(dāng)雙鏈DNA靶標(biāo)存在時(shí)，靶標(biāo)DNA與固定化的第三鏈形成三螺旋結(jié)構(gòu)，阻礙甲基藍(lán)靠近金電極并轉(zhuǎn)移電子，實(shí)現(xiàn)電化學(xué)信號(hào)的輸出，實(shí)現(xiàn)了雙鏈DNA在復(fù)雜血清樣本中特異、靈敏（10nmol/L）的電化學(xué)檢測(cè)，構(gòu)建了一種無(wú)試劑化、可重復(fù)利用的三鏈DNA生物傳感器［24］。但由于利用C-G*C與T-A*T的序列特異性有效識(shí)別靶標(biāo)DNA，使目標(biāo)DNA的檢測(cè)缺乏廣譜性和通用性。

2.1.2 莖環(huán)型DNA三螺旋生物傳感器 莖環(huán)型DNA三螺旋生物傳感器是從莖環(huán)結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)獲得靈感，將莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)狀（Loop）區(qū)域改造成具有生物識(shí)別作用的單鏈核酸（適配體-aptamer，單鏈DNA等），將莖部（Stem）區(qū)域由雙鏈DNA改造成三鏈DNA的結(jié)構(gòu)元件（圖1-B），通過(guò)生物識(shí)別作用、改變?nèi)菪那o環(huán)結(jié)構(gòu)、實(shí)現(xiàn)信號(hào)表征的生物傳感器。2011年，湖南大學(xué)譚蔚泓教授［25］團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種基于三螺旋莖環(huán)結(jié)構(gòu)的生物傳感器，通過(guò)aptamer的特征識(shí)別機(jī)制使三螺旋分子開關(guān)發(fā)生結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換，使第三鏈兩端標(biāo)記的芘分子靠近、發(fā)射高強(qiáng)度熒光，實(shí)現(xiàn)了三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）、α-凝血酶（α-thrombin，Tmb）與L-精氨酰胺（LArgininamide，L-Arm）的通用型檢測(cè)。2014年，湖南大學(xué)王柯敏教授［26］團(tuán)隊(duì)將三螺旋莖環(huán)結(jié)構(gòu)搭載電化學(xué)傳感平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)了ATP（LOD=60 nmol/L）與Tmb（LOD=4.5 nmol/L）的通用型、超靈敏檢測(cè)。2015年，伊朗Khalil Abnous教授［27］團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種基于三螺旋莖環(huán)結(jié)構(gòu)的傳感平臺(tái)，結(jié)合金納米粒子的聚沉顯色，實(shí)現(xiàn)了四環(huán)素的可視化、超靈敏（檢測(cè)限，Limit of detection，LOD=266 pM）檢測(cè)。通過(guò)在莖環(huán)型DNA三螺旋生物傳感器的loop區(qū)域引入aptamer區(qū)域，不僅大大拓寬了三螺旋生物傳感器的檢測(cè)范圍，使目標(biāo)物不再局限于核酸類物質(zhì)，而且已經(jīng)發(fā)展成為了一種通用型檢測(cè)目標(biāo)物的傳感策略。

2.1.3 夾鉗型DNA三螺旋生物傳感器 夾鉗型DNA三螺旋生物傳感器是以一條具有對(duì)稱序列的單鏈DNA為探針，以另外一條DNA為靶標(biāo)，通過(guò)探針DNA鏈與靶標(biāo)DNA鏈先形成雙鏈、再通過(guò)Hoogsteen鍵形成DNA三螺旋的生物傳感器（圖1-C）。在形態(tài)方面，夾鉗型DNA三螺旋與莖環(huán)型DNA三螺旋相比，loop區(qū)域只起到連接作用和非生物識(shí)別作用，發(fā)揮識(shí)別功能的是探針DNA鏈一端的對(duì)稱序列。在識(shí)別特性方面，由于Waston-Crick鍵與Hoogsteen共同發(fā)揮夾鉗狀的特征識(shí)別作用，使夾鉗型DNA三螺旋傳感元件具有更強(qiáng)的靈敏度與更優(yōu)的特異性［11］。2014年，羅馬大學(xué)Francesco Ricci教授團(tuán)隊(duì)將夾鉗型DNA三螺旋傳感元件與電化學(xué)檢測(cè)平臺(tái)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了有效的DNA單堿基錯(cuò)配區(qū)分［28］。

2.1.4 單鏈DNA三螺旋生物傳感器 單鏈DNA三螺旋生物傳感器是由一條DNA鏈先形成Waston-Crick鍵、再形成Hoogsteen鍵的分子內(nèi)三螺旋DNA生物傳感器（圖1-D）。2014年，F(xiàn)rancesco Ricci教授團(tuán)隊(duì)利用雙熒光基團(tuán)標(biāo)記的分子內(nèi)三螺旋DNA，實(shí)現(xiàn)了跨5.5個(gè)pH單位（pH5.5-11.0）的傳感檢測(cè)［18］。目前的單鏈DNA三螺旋生物傳感器主要通過(guò)核酸三螺旋的特征序列進(jìn)行靶標(biāo)的特異性識(shí)別。與夾鉗狀DNA三螺旋生物傳感器相比，由單鏈DNA構(gòu)成的三螺旋生物傳感器提高了DNA超分子組裝體的結(jié)合效率、避免了分子間形成非三螺旋核酸的可能性，進(jìn)而提高了傳感器的檢測(cè)性能。

2.2 三螺旋RNA傳感器

三螺旋RNA生物傳感器是以RNA鏈構(gòu)成的核酸三螺旋為結(jié)構(gòu)單元的生物傳感器。2016年，哈佛-麻省理工健康科技聯(lián)合中心的Natalie Artzi教授 團(tuán) 隊(duì) 利 用 U-A*U、C-G*U、A-U*A、U-G*U和U-G*C等三螺旋堿基對(duì)，設(shè)計(jì)了一種基于三鏈RNA的雙色熒光三螺旋傳感器，該三螺旋RNA能夠識(shí)別癌細(xì)胞內(nèi)micro RNA（miRNA），發(fā)揮抑制癌細(xì)胞miRNA-221與替換癌細(xì)胞miRNA-205的雙重功能［10］，拓寬了三螺旋核酸的應(yīng)用領(lǐng)域，使研究者對(duì)三螺旋核酸的研究不再局限于DNA三螺旋。

圖1 三螺旋DNA生物傳感器的4種類型

2.3 三螺旋DNA/RNA生物傳感器

三螺旋DNA/RNA生物傳感器是以RNA鏈為第三鏈嵌入到雙鏈DNA大溝中、形成三螺旋結(jié)構(gòu)單元的生物傳感器。1996年，Ekambar Kandimalla教授和Agrawal教授［29］合作研究了DNA/RNA三螺旋結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)以T-A*U堿基對(duì)替代T-A*T堿基對(duì)形成的三螺旋結(jié)構(gòu)，在相同pH條件下，Tm值比對(duì)應(yīng)的T-A*T三螺旋結(jié)構(gòu)低10℃左右，表明DNA/RNA三螺旋結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。因此，基于DNA/RNA的三螺旋生物傳感器鮮有報(bào)道。

2.4 三螺旋PNA/DNA生物傳感器

肽核酸（Peptide nucleic acid，PNA）是一類以多肽骨架取代糖磷酸主鏈的DNA類似物。三螺旋PNA/DNA生物傳感器是以PNA與DNA雜交形成的核酸三螺旋為基本結(jié)構(gòu)單元的生物傳感器。由于PNA與DNA的結(jié)合具有更強(qiáng)的親和性，因此PNA/DNA三螺旋具有更高的特異性、靈敏度及穩(wěn)定性；其信號(hào)的特征識(shí)別機(jī)制主要包括三螺旋核酸的序列特異性識(shí)別、引入與目標(biāo)物特異性親和的loop區(qū)域兩種方式實(shí)現(xiàn)。目前根據(jù)雜交鏈的類型不同，三螺旋PNA/DNA生物傳感器可分為以下類型。

2.4.1 PNA-DNA-PNA三螺旋生物傳感器 PNADNA-PNA三螺旋生物傳感器是以一條多聚嘧啶PNA鏈與一條多聚嘌呤DNA鏈通過(guò)Waston-Crick氫鍵生成雙鏈；另一條多聚嘧啶PNA鏈通過(guò)Hoogsteen鍵嵌入雙鏈大溝、形成三螺旋結(jié)構(gòu)的生物傳感器，其特征是PNA鏈與DNA鏈按2∶1結(jié)合（圖2-A）［30］。2006年，加利福尼亞大學(xué)Michael Bowers教授［31］團(tuán)隊(duì)率先發(fā)現(xiàn)了經(jīng)過(guò)熒光基團(tuán)標(biāo)記的PNA與DNA序列特異性結(jié)合、形成的PNA-DNA-PNA三螺旋在加入特定的陽(yáng)離子共軛聚電解質(zhì)（Cationic conjugated polyelectrolyte，CCP）后，通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer，TRET） 可以增強(qiáng)PNA2/DNA三螺旋的熒光，建立了一種基于PNA/DNA三螺旋的光學(xué)傳感器。2009年，新加坡國(guó)立大學(xué)Liu教授［32］團(tuán)隊(duì)利用PNA/DNA/PNA三螺旋無(wú)法被S1核酸酶降解的特性，加入嵌入型的噻唑橙（Thiazole orange，TO）染料后顯微弱熒光，再加入特定的CCP后，通過(guò)TRET增強(qiáng)熒光發(fā)射；而相應(yīng)的含有單堿基錯(cuò)配的DNA/PNA三螺旋能夠被S1核酸酶降解、無(wú)法產(chǎn)生熒光。因此，所建立的基于PNA-DNA-PNA三螺旋的熒光傳感器可以實(shí)現(xiàn)無(wú)標(biāo)記、高選擇性的單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism）的檢測(cè)（LOD=5 μmol/L）。

2.4.2 DNA-PNA-DNA三螺旋生物傳感器 DNAPNA-DNA三螺旋生物傳感器是單鏈PNA通過(guò)Hoogsteen鍵嵌入到雙鏈DNA大溝中形成三螺旋結(jié)構(gòu)、輸出反應(yīng)信號(hào)的生物傳感器（圖2-B）。2006年，Michael Bowers教授團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)：經(jīng)過(guò)熒光基團(tuán)標(biāo)記的PNA與雙鏈DNA的序列特異性結(jié)合、形成的DNA-PNA-DNA三螺旋在加入特定CCP后，通過(guò)TRET可以增強(qiáng)DNA2/PNA三螺旋的熒光，建立了一種基于PNA/DNA三螺旋的光學(xué)傳感器［31］。2007年，德國(guó)Oliver Asitz教授團(tuán)隊(duì)將分子信標(biāo)進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，loop區(qū)域?yàn)榘袠?biāo)DNA鏈互補(bǔ)區(qū)域（實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)的特征識(shí)別），stem區(qū)域則利用富含A的PNA鏈與富含T的雙鏈DNA形成DNA2/PNA三螺旋。當(dāng)檢測(cè)體系中加入靶標(biāo)DNA鏈，三螺旋分子信標(biāo)發(fā)生結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換、莖環(huán)結(jié)構(gòu)被打開、開啟熒光信號(hào)、實(shí)現(xiàn)傳感。值得一提的是，該傳感器具有3個(gè)顯著特點(diǎn)：其一，識(shí)別靶標(biāo)DNA的靈敏度與特異性能夠被DNA2/PNA組成的三螺旋stem所調(diào)節(jié)；其二，PNA鏈標(biāo)記的熒光基團(tuán)在形成三螺旋結(jié)構(gòu)后，形成的超淬滅熒光發(fā)卡結(jié)構(gòu)能夠顯著降低熒光背景，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的高信噪比；其三，借助高特異性與高信噪比的特性，該DNA-PNA-DNA三螺旋熒光傳感器可以實(shí)現(xiàn)單堿基區(qū)分［33］。2013年，伊朗 Mohammad Saeid Hejazi教授團(tuán)隊(duì)將PNA鏈固定在金電極上，通過(guò)PNA鏈特異性捕獲特征雙鏈DNA形成三螺旋結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的電信號(hào)變化，實(shí)現(xiàn)了對(duì)靶標(biāo)DNA雙鏈的檢測(cè)［34］。

圖2 三螺旋PNA/DNA生物傳感器的兩種類型

2.5 可視化TNAs生物傳感器

可視化TNAs生物傳感器是以TNAs作為生物識(shí)別元件對(duì)輸入信號(hào)進(jìn)行識(shí)別響應(yīng)，以光學(xué)響應(yīng)信號(hào)為基礎(chǔ)，通過(guò)裸眼比較反應(yīng)液中顏色的深淺的變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的肉眼識(shí)別檢測(cè)的傳感方法。當(dāng)金納米粒子（Gold nanoparticles，AuNPs）之間的距離改變時(shí)，其局域表面等離子共振吸收峰會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的變化，引起溶液顏色的改變［35］。2006年，韓國(guó)Insung S. Choi教授團(tuán)隊(duì)分別在AuNPs上共價(jià)偶聯(lián)兩條核酸鏈，通過(guò)調(diào)節(jié)溶液體系的pH值，使反應(yīng)體系在酸性條件（pH5.0）下形成C-G*C、T-A*T三螺旋結(jié)構(gòu)，從而拉近AuNPs之間的距離，使AuNPs粒子聚沉、發(fā)生從紅色到藍(lán)色的顏色變化［36］。2011年，中山大學(xué)凌連生教授團(tuán)隊(duì)利用Ag+可以在弱堿性（pH8.0）條件下穩(wěn)定C-G*C三螺旋結(jié)構(gòu)的性質(zhì)，使AuNPs粒子上的兩條鏈通過(guò)C-G*C Ag+三螺旋結(jié)構(gòu)，距離有效拉近，發(fā)生顏色變化，從而實(shí)現(xiàn)Ag+的傳感檢測(cè)［37］。2015年，伊朗Khalil Abnous教授團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種基于TNAs莖環(huán)結(jié)構(gòu)的可視化傳感器，通過(guò)靶物質(zhì)（四環(huán)素）與loop區(qū)域的親和結(jié)合、誘導(dǎo)TNAs莖環(huán)結(jié)構(gòu)解組裝、釋放第三鏈，在高鹽條件（50 mmol/L NaCl）下，釋放的第三鏈能夠維持AuNPs的穩(wěn)態(tài)，抵抗高鹽聚沉效應(yīng)，使溶液呈現(xiàn)明亮的紅色；而陰性對(duì)照組因TNAs莖環(huán)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定存在，AuNPs在高鹽環(huán)境中發(fā)生聚沉呈現(xiàn)藍(lán)色，從而實(shí)現(xiàn)了四環(huán)素的可視化、超靈敏（檢測(cè)限，Limit of detection，LOD=266 pmol/L） 檢 測(cè)［27］。 通 過(guò) 與AuNPs結(jié)合，使TNAs生物傳感器具有可視化、簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)，但由于AuNPs的聚沉容易受鹽離子濃度、金屬陽(yáng)離子濃度的干擾，因此基于AuNPs的可視化TNAs生物傳感器的穩(wěn)定性有待于進(jìn)一步研究。

2.6 熒光TNAs生物傳感器

熒光TNAs生物傳感器是以TNAs作為生物識(shí)別元件對(duì)輸入信號(hào)進(jìn)行識(shí)別響應(yīng)，以熒光響應(yīng)信號(hào)的強(qiáng)度變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的傳感響應(yīng)的方法。最常使用的研究策略是根據(jù)熒光供體基團(tuán)與熒光受體基團(tuán)的距離變化誘導(dǎo)FRET，發(fā)生正向的熒光增強(qiáng)或負(fù)向的熒光減弱，從而表征對(duì)目標(biāo)物的傳感響應(yīng)。2001年，新澤西Thomas Antony［20］團(tuán)隊(duì)建立了一種正向的熒光增強(qiáng)型的TNAs傳感方法：預(yù)先在分子信標(biāo)的5′末端與3′末端標(biāo)記熒光供體基團(tuán)（Fluorescein）與熒光受體基團(tuán)（DABCYL），在沒(méi)有待測(cè)雙鏈DNA出現(xiàn)時(shí)只有很低的背景信號(hào)；當(dāng)體系中存在待測(cè)的雙鏈DNA時(shí)，分子信標(biāo)解構(gòu)發(fā)生結(jié)構(gòu)變化、并與雙鏈DNA分子形成三螺旋DNA，使Fluorescein基團(tuán)與DABCYL基團(tuán)之間的距離增大、無(wú)法發(fā)生FRET而淬滅Fluorescein基團(tuán)的熒光，因此發(fā)射出較強(qiáng)的熒光，從而通過(guò)熒光強(qiáng)度變化表征待測(cè)雙鏈DNA的濃度。2014年，山東大學(xué)姜瑋教授團(tuán)隊(duì)利用熒光淬滅基團(tuán)（Black hole quencher-1，BHQ-1標(biāo)記的三核酸第三鏈與熒光基團(tuán)（6-carboxyfluorescein，6-FAM）標(biāo)記的雙鏈DNA，通過(guò)Ag+穩(wěn)定三螺旋DNA的形成，同時(shí)6-FAM與BHQ-1發(fā)生FRET導(dǎo)致熒光淬滅。當(dāng)存在轉(zhuǎn)錄因子（Transcription factors，TFs）時(shí)，目標(biāo)物TFs與雙鏈結(jié)合釋放BHQ-1標(biāo)記的第三鏈，使雙鏈DNA的6-FAM釋放熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)TFs的定量檢測(cè)［14］。

除此之外，利用芘分子在單體狀態(tài)與二聚體狀態(tài)的熒光發(fā)射波長(zhǎng)與熒光發(fā)射強(qiáng)度不同，也可對(duì)TNAs生物傳感信號(hào)進(jìn)行表征。2015年，湖南大學(xué)譚蔚泓教授團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種莖環(huán)狀的DNA三螺旋分子開關(guān)，只有當(dāng)目標(biāo)物Tmb、ATP、L-Arm存在時(shí)，目標(biāo)物與莖環(huán)結(jié)構(gòu)的loop區(qū)域親和結(jié)合、莖環(huán)狀三螺旋結(jié)構(gòu)解構(gòu)，第三鏈自發(fā)形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)、使標(biāo)記在5′端與3′端的芘分子在空間上聚集形成二聚體，在480 nm處的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，實(shí)現(xiàn)Tmb、ATP、L-Arm的通用型檢測(cè)［25］。利用標(biāo)記熒光基團(tuán)建立的TNAs生物傳感器通常能夠?qū)崿F(xiàn)目標(biāo)物的靈敏檢測(cè)，但由于標(biāo)記熒光基團(tuán)的高昂成本與技術(shù)制約，熒光TNAs生物傳感方法的建立往往需要耗費(fèi)更多的人力物力。

2.7 表面增強(qiáng)拉曼光譜（Surface enhanced Raman spectroscopy，SERS）-TNA生物傳感器

SERS-TNAs生物傳感器是以TNAs作為生物識(shí)別元件對(duì)輸入信號(hào)進(jìn)行識(shí)別響應(yīng)，以SERS響應(yīng)信號(hào)的強(qiáng)度變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的傳感響應(yīng)的方法。目前，常常把SERS信號(hào)分子修飾在DNA鏈或納米材料上構(gòu)建Raman增強(qiáng)基底，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)待測(cè)物的傳感響應(yīng)。2012年，譚蔚泓教授團(tuán)隊(duì)利用目標(biāo)物與loop區(qū)域的特異性親和、誘導(dǎo)的DNA三螺旋莖環(huán)的結(jié)構(gòu)變化，實(shí)現(xiàn)了SERS信號(hào)分子（羅丹明6G，rhodamine 6G，R6G）標(biāo)記的銀納米粒子（Silver nanoparticles，AgNPs）在金膜表面的距離發(fā)生改變，導(dǎo)致SERS信號(hào)的傳感響應(yīng)［38］。2012年，Duncan Graham教授團(tuán)隊(duì)將Raman信號(hào)分子羧基-X-羅丹明異硫氰酸鹽（Carboxy-X-rhodamine isothiocyanate，ROX-ITC）標(biāo)記在AgNPs上，利用三核酸DNA的序列特異性結(jié)合，通過(guò)改變待測(cè)雙鏈DNA的長(zhǎng)度，實(shí)現(xiàn)TNAs的長(zhǎng)度變化、進(jìn)而調(diào)節(jié)AgNPs粒子間的距離變化，通過(guò)AgNPs間的距離與SERS信號(hào)強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)，實(shí)現(xiàn)對(duì)不同長(zhǎng)度的雙鏈DNA的測(cè)定［39］。2014年，湖南大學(xué)楊榮華教授團(tuán)隊(duì)利用目標(biāo)物與loop區(qū)域的特異性親和、誘導(dǎo)的DNA三螺旋莖環(huán)的結(jié)構(gòu)變化、釋放第三鏈，第三鏈被鏈霉親和素包被的硅珠捕獲后、促發(fā)帶有活性巰基（-SH）末端修飾的鏈?zhǔn)诫s交反應(yīng)（Hybridization chain reaction，HCR），HCR自組裝體與Raman信號(hào)分子（4-氨基苯硫酚，4-aminobenzenethiol，4-ABT）修飾的AuNPs共價(jià)偶聯(lián)、實(shí)現(xiàn)SERS信號(hào)的傳感響應(yīng)［40］。

2.8 電化學(xué)TNAs生物傳感器

電化學(xué)TNAs生物傳感器是以TNAs作為生物識(shí)別元件對(duì)輸入信號(hào)進(jìn)行識(shí)別響應(yīng)，以電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)的強(qiáng)度變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的傳感響應(yīng)的方法。由于電化學(xué)傳感平臺(tái)具有制作成本低廉、操作簡(jiǎn)便、靶標(biāo)范圍廣泛等優(yōu)點(diǎn)，常常將標(biāo)記有電化學(xué)信號(hào)分子的核酸鏈固定在電極表面，依據(jù)有無(wú)待測(cè)物導(dǎo)致的固定化核酸鏈上信號(hào)分子傳遞電子的效率差別，實(shí)現(xiàn)電化學(xué)信號(hào)（電流、電阻抗和點(diǎn)位等）的表征。1997年，前捷克共和國(guó)Emil Palecek教授團(tuán)隊(duì)利用固定化的DNA單鏈利用三核酸DNA的序列特異性結(jié)合靶標(biāo)雙鏈DNA形成三螺旋DNA，TNAs結(jié)構(gòu)中G單元發(fā)生電化學(xué)氧化傳遞電子，實(shí)現(xiàn)了電化學(xué)DNA傳感［41］。但利用G氧化傳遞電子的缺陷是傳感體系容易受到外界環(huán)境干擾、不利于復(fù)雜樣品的檢測(cè)。2014年，羅馬大學(xué)Francesco Ricci教授團(tuán)隊(duì)利用標(biāo)記有氧化還原反應(yīng)基團(tuán)（甲基藍(lán)）的固定化單鏈DNA序列特異性探針捕獲目標(biāo)DNA單鏈、形成夾鉗狀三螺旋DNA、促使甲基藍(lán)與金電極的靠近、導(dǎo)致傳遞電子的效率增強(qiáng)。利用待測(cè)DNA單鏈的濃度與有效電子傳遞的正相關(guān)關(guān)系，實(shí)現(xiàn)了單鏈DNA在復(fù)雜血清樣本中的單堿基錯(cuò)配區(qū)分［28］。由于氧化還原基團(tuán)標(biāo)記的固定化探針會(huì)增加電化學(xué)傳感平臺(tái)的檢測(cè)成本，2015年，青島農(nóng)業(yè)大學(xué)李峰教授團(tuán)隊(duì)利用G-四鏈體（G-Quadruplex）功能核酸作為免標(biāo)記的電化學(xué)信號(hào)分子，使固定化的DNA探針與具有目標(biāo)DNA互補(bǔ)區(qū)域的分子信標(biāo)鏈形成莖環(huán)狀DNA三螺旋、封閉探針鏈G-四鏈體的類辣根過(guò)氧化物酶活性。當(dāng)體系中出現(xiàn)目標(biāo)DNA，目標(biāo)物與loop區(qū)域互補(bǔ)、誘導(dǎo)莖環(huán)狀DNA三螺旋發(fā)生結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換、暴露出固定化DNA探針鏈。在氯高鐵血紅素的誘導(dǎo)下，探針鏈形成有活性的G-四鏈體結(jié)構(gòu)，發(fā)揮類辣根過(guò)氧化物酶活性傳遞電子，實(shí)現(xiàn)電化學(xué)信號(hào)的輸出與目標(biāo)DNA鏈的檢測(cè)［42］。

2.9 pH響應(yīng)的TNAs生物傳感器

由于酸性條件促進(jìn)C質(zhì)子化、促進(jìn)平行式C-G*C三螺旋堿基對(duì)的穩(wěn)定形成、從而促進(jìn)TNAs的穩(wěn)定形成；而中性條件促進(jìn)平行式T-A*T三螺旋堿基對(duì)的穩(wěn)定形成、從而促進(jìn)TNAs的穩(wěn)定形成［18］，因此由C-G*C、T-A*T組裝的三螺旋DNA結(jié)構(gòu)具有pH效應(yīng)。研究者們開發(fā)出了多種具有pH響應(yīng)效應(yīng)的TNAs生物傳感器。pH響應(yīng)的TNAs生物傳感器的顯著特點(diǎn)是通過(guò)改變?nèi)芤旱膒H，可視實(shí)現(xiàn)傳感器可逆化的周期性響應(yīng)。但由于反應(yīng)體系的復(fù)雜性，其周期性響應(yīng)的循環(huán)次數(shù)通常不夠理想，需要進(jìn)一步加強(qiáng)研究。

2.9.1 pH響應(yīng)的TNAs等溫?cái)U(kuò)增傳感器 pH響應(yīng)的TNAs等溫?cái)U(kuò)增傳感器是以TNAs為pH響應(yīng)元件、介導(dǎo)的恒溫?cái)U(kuò)增傳感器。2014年，中國(guó)科學(xué)院樊春海教授與羅馬大學(xué)Francesco Ricci教授合作研究了兩種pH響應(yīng)模式的DNA鏈置換擴(kuò)增（Strand displacement amplification，SDA）傳感器。一種是OH-激活的SDA：在OH-誘導(dǎo)下，以C-G*C為主要序列組成的三螺旋結(jié)構(gòu)中的Hoogsteen鍵斷裂形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，加入侵入鏈（Invading strand，IS）發(fā)生SDA、產(chǎn)生游離的三螺旋第三鏈、發(fā)生后續(xù)的SDA。另一種是H+激活的SDA：帶有兩側(cè)黏性末端的雙鏈S首先與IS雜交結(jié)合，在H+誘導(dǎo)下，IS與abc鏈形成三螺旋DNA、釋放b*c*d*鏈、發(fā)生后續(xù)的SDA。利用標(biāo)記在DNA鏈上的熒光供體基團(tuán)與熒光受體基團(tuán)表征pH響應(yīng)的SDA傳感器的搭建［43］。2015年，蒙特利爾大學(xué)Alexis Vallee-Belisle教授與羅馬大學(xué)Francesco Ricci教授合作研究了兩種pH響應(yīng)模式的雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Hybridization chain reaction，HCR）傳感器。在OH-誘導(dǎo)下，儲(chǔ)存有HCR自組裝能量的發(fā)卡tH1的 5′末端的Hoogsteen鍵斷裂，暴露出黏性末端，發(fā)生后續(xù)的HCR；在H+誘導(dǎo)下，HCR激發(fā)子鏈與含有HCR自組裝能量的發(fā)卡tH1能夠形成I·tH1三螺旋結(jié)構(gòu)、鏈剝離釋放cb*黏性末端、發(fā)生后續(xù)的HCR。利用標(biāo)記在DNA鏈上的熒光供體基團(tuán)與熒光受體基團(tuán)表征pH響應(yīng)的HCR傳感器的搭建［44］。

2.9.2 pH響應(yīng)的TNAs納米開關(guān) pH響應(yīng)的TNAs納米開關(guān)是指以TNAs為pH響應(yīng)元件、調(diào)控所構(gòu)建的DNA納米組裝體發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，發(fā)揮開關(guān)（onff）型作用、能夠開啟或關(guān)閉表征信號(hào)的兩態(tài)傳感器。2004年，普渡大學(xué)Chengde Mao教授利用標(biāo)記有羅丹明綠與BHQ-1的熒光探針F、長(zhǎng)鏈DNA（L）與斷鏈DNA（S）進(jìn)行雙鏈自組裝體與三鏈-鑷子狀自組裝體的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換，通過(guò)改變?nèi)芤旱膒H（5.0-8.0）、可逆性地改變?nèi)菪鼶NA的形成與解構(gòu)，通過(guò)FRET與聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）表征了所設(shè)計(jì)的納米開關(guān)的鑷子樣非三螺旋-on態(tài)與鑷子樣三螺旋-off態(tài)［45］。2015年，北京理工大學(xué)張小玲教授，廈門大學(xué)康懷志教授與湖南大學(xué)譚蔚泓教授合作研究了一種基于C-G*C堿基對(duì)的鑷子狀TNAs納米開關(guān)。該納米開關(guān)由三條鏈構(gòu)成，在中性條件下，三條鏈雜交成長(zhǎng)直雙鏈結(jié)構(gòu)，因無(wú)法實(shí)現(xiàn)FRET，使納米開關(guān)呈現(xiàn)強(qiáng)熒光信號(hào)的on態(tài)；酸性條件誘導(dǎo)C質(zhì)子化形成C-G*C堿基對(duì)，形成的TNAs不僅使納米開關(guān)的結(jié)構(gòu)變成類鑷子樣形態(tài)，而且發(fā)生FRET使納米開關(guān)呈現(xiàn)發(fā)出微弱熒光信號(hào)的off態(tài)，實(shí)現(xiàn)了在pH 4.6-7.8范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞內(nèi)pH梯度的檢測(cè)［46］。

2014年，羅馬大學(xué)Francesco Ricci教授團(tuán)隊(duì)通過(guò)改變構(gòu)成三螺旋結(jié)構(gòu)的單鏈DNA的序列構(gòu)成，且在單鏈DNA兩側(cè)分別標(biāo)記熒光供體基團(tuán)（Alexa Fluor 680和AF680）與熒光淬滅基團(tuán)（BHQ-1），通過(guò)調(diào)節(jié)溶液pH，使單分子三螺旋納米開關(guān)在低pH條件下形成鏈內(nèi)三螺旋結(jié)構(gòu)、淬滅熒光，納米開關(guān)處于off態(tài)；高pH條件下Hoogsteen鍵斷裂形成雙螺旋解構(gòu)、AF680恢復(fù)熒光發(fā)射，納米開關(guān)處于on態(tài)。因此，所構(gòu)建的單鏈DNA三螺旋納米開關(guān)實(shí)現(xiàn)了跨5.5個(gè)pH單位（pH5.5-11.0）的傳感檢測(cè)［18］。

2.9.3 酶促反應(yīng)介導(dǎo)TNAs的pH傳感響應(yīng) 酶促反應(yīng)介導(dǎo)TNAs的pH傳感響應(yīng)是指以通過(guò)酶促反應(yīng)生成質(zhì)子或消耗質(zhì)子，調(diào)控TNAs結(jié)構(gòu)的生成或結(jié)構(gòu)、實(shí)現(xiàn)信號(hào)傳感響應(yīng)的過(guò)程。2015年，羅馬大學(xué)Francesco Ricci教授團(tuán)隊(duì)首先研究了酶促反應(yīng)調(diào)控的單鏈DNA三螺旋納米開關(guān)的on-off狀態(tài)轉(zhuǎn)換。以谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶催化谷胱甘肽產(chǎn)生質(zhì)子、調(diào)控on型TNAs納米開關(guān)轉(zhuǎn)換為三螺旋結(jié)構(gòu)的off型；以脲酶催化尿素消耗質(zhì)子、調(diào)控off型的具有三螺旋結(jié)構(gòu)的TNAs納米開關(guān)轉(zhuǎn)換為雙螺旋結(jié)構(gòu)的on型。然后，研究者建立了酶促反應(yīng)介導(dǎo)的鏈替代傳感模型：利用脲酶催化尿素消耗質(zhì)子，調(diào)控TNAs的Hoogsteen鍵斷裂、生成雙螺旋，再使用侵入鏈進(jìn)行鏈替代反應(yīng)、輸出熒光信號(hào)。最后，研究者建立了酶促反應(yīng)介導(dǎo)的配體釋放/攜帶傳感模型：利用乙酰膽堿酯酶催化乙酰膽堿釋放質(zhì)子，使與配體鏈雜交形成雙螺旋DNA的單鏈DNA形成分子內(nèi)三螺旋組裝體、釋放配體鏈；利用脲酶催化尿素消耗質(zhì)子，破壞單鏈DNA形成的分子內(nèi)三螺旋組裝體，與配體鏈雜交生成雙螺旋、攜帶配體鏈［47］。將酶促反應(yīng)與TNAs的pH效應(yīng)組合傳感，為拓展TNAs生物傳感器在體內(nèi)的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

2.9.4 pH響應(yīng)的納米粒子的聚集/分散 pH響應(yīng)的納米粒子的聚集/分散是指通過(guò)pH變化調(diào)控TNAs的形成與解構(gòu)、調(diào)控納米粒子間的距離、使納米粒子發(fā)生聚集或分散的傳感現(xiàn)象。2006年，成均館大學(xué)Yang-Gyun Kim教授與Insung S. Choi教授合作，預(yù)先分別在兩種AuNPs表面標(biāo)記兩種不同的核酸鏈，形成偶聯(lián)有分子內(nèi)雙鏈DNA的AuNPs-A與偶聯(lián)單鏈DNA的AuNPs-B。在酸性條件（pH5.0）下，C質(zhì)子化形成C-G*C堿基對(duì)、促使兩條DNA鏈形成分子間三螺旋結(jié)構(gòu)、拉近AuNPs-A與AuNPs-B之間的距離，使AuNPs聚沉呈現(xiàn)藍(lán)色。在中性條件（pH6.5）下，C-G*C堿基對(duì)中的Hoogsteen鍵斷裂、三螺旋結(jié)構(gòu)解體，AuNPs-A與AuNPs-B之間的距離增大、使AuNPs分散呈現(xiàn)紅色，實(shí)現(xiàn)了pH調(diào)控的AuNPs間可逆的聚沉與分散，通過(guò)顏色變化表征AuNPs之間的聚集與分散［36］。2008年，普渡大學(xué)Chengde Mao教授預(yù)先在一種AuNPs表面標(biāo)記具有鏡像序列的Oligo A鏈形成A型AuNPs，在另一種AuNPs表面標(biāo)記與Oligo A鏈互補(bǔ)的Oligo B鏈形成B型AuNPs。在中性條件（pH8.0）下，A型AuNPs與B型AuNPs上標(biāo)記的DNA鏈雜交使AuNPs之間具有一定的距離；在酸性條件（pH5.0）下，C質(zhì)子化形成C-G*C堿基對(duì)穩(wěn)定TNAs的結(jié)構(gòu)，拉近A型AuNPs與B型AuNPs之間的距離，產(chǎn)生更強(qiáng)的電子耦合，通過(guò)AuNPs的最大吸收峰紅移表征AuNPs之間的聚集與分散［48］。

2.9.5 pH響應(yīng)的DNA折紙單元的低聚/分散 DNA折紙（Origami）單元作為一種新型的DNA納米自組裝結(jié)構(gòu)單元，可以使用TNAs發(fā)揮橋連作用，實(shí)現(xiàn)pH響應(yīng)的低聚與分散。2015年，以色列希伯來(lái)大學(xué)Itamar Willner教授團(tuán)隊(duì)以TNAs作為DNA折紙單元的橋梁，構(gòu)建了DNA Origami的二聚體［49］。首先，研究者在DNA Origami單元T3與T4上分別標(biāo)記（1）鏈與（2）鏈，通過(guò)（1）鏈與（2）鏈的鏈雜交、使T3與T4形成二聚體；當(dāng)體系pH調(diào)至4.5，C質(zhì)子化形成C-G*C堿基對(duì)、使（1）鏈形成分子內(nèi)三螺旋結(jié)構(gòu)，同時(shí)發(fā)揮橋連作用的分子間雙鏈雜交解構(gòu)、使二聚體T3/T4分散；當(dāng)體系pH再次調(diào)至7.0，C去質(zhì)子化導(dǎo)致Hoogsteen鍵斷裂、三螺旋解構(gòu)，T3與T4重新形成二聚體，實(shí)現(xiàn)DNA Origami單元的可逆化的低聚與分散。然后，研究者在DNA Origami單元T5與T6上分別標(biāo)記（3）鏈與（4）鏈，通過(guò)（3）鏈與（4）鏈的鏈雜交、形成三螺旋發(fā)揮橋連作用、使T3與T4形成二聚體；當(dāng)體系pH調(diào)至9.5，T去質(zhì)子化導(dǎo)致T-A*T堿基對(duì)的Hoogsteen鍵斷裂、三螺旋解構(gòu)，使二聚體T5/T6分散；當(dāng)體系pH再次調(diào)至7.0，促進(jìn)T-A*T堿基對(duì)與三螺旋結(jié)構(gòu)的形成，T5與T6重新形成二聚體，實(shí)現(xiàn)DNA Origami單元的可逆化的低聚與分散。

2.9.6 pH響應(yīng)的單鏈閉環(huán)DNA的低聚/分離 單鏈閉環(huán)DNA作為一種人工DNA納米結(jié)構(gòu)單元，可以在TNAs的橋連作用下，實(shí)現(xiàn)pH響應(yīng)的低聚與分散。2016年，希伯來(lái)大學(xué)Itamar Willner教授團(tuán)隊(duì)以TNAs作為單鏈閉環(huán)DNA納米結(jié)構(gòu)單元的橋梁，構(gòu)建了單鏈閉環(huán)DNA的二聚體［50］。首先，分別合成單鏈DNA閉環(huán)R1與R2，使C1、F1與R1鏈雜交、穩(wěn)定R1的環(huán)狀形態(tài)，同時(shí)使C2、F2與R2鏈雜交，穩(wěn)定R2的環(huán)狀形態(tài)；當(dāng)體系pH調(diào)至7.0，C去質(zhì)子化無(wú)法形成三螺旋結(jié)構(gòu)，橋連鏈L1與R1鏈間雜交形成雙螺旋、使R1與R2形成二聚體；當(dāng)體系pH調(diào)至4.5，C質(zhì)子化形成C-G*C堿基對(duì)、使橋連鏈L1與R2形成分子間三螺旋結(jié)構(gòu)，發(fā)揮去橋連作用、使二聚體R1/R2分離；當(dāng)體系pH再次調(diào)至7.0，C去質(zhì)子化導(dǎo)致Hoogsteen鍵斷裂、三螺旋解構(gòu)，橋連鏈L1重新與R1鏈間雜交形成雙螺旋、使R1與R2重新形成二聚體，實(shí)現(xiàn)單鏈閉環(huán)DNA單元的可逆化的低聚與分離。然后，改變策略、使用橋連鏈L2與L3連接R1與R2：當(dāng)體系pH調(diào)至7.0，促進(jìn)T-A*T堿基對(duì)的形成，L2、R1與L3形成三螺旋結(jié)構(gòu)，使R1與R2形成二聚體；當(dāng)體系pH調(diào)至10.0，T去質(zhì)子化導(dǎo)致形成T-A*T堿基對(duì)中的Hoogsteen鍵斷裂、三螺旋解構(gòu)、使使二聚體R1/R2分離；當(dāng)體系pH再次調(diào)至7.0，再次形成T-A*T堿基對(duì)、L2、R1與L3形成三螺旋結(jié)構(gòu)、使R1與R2形成二聚體，實(shí)現(xiàn)單鏈閉環(huán)DNA單元的可逆化的低聚與分離。

2.9.7 pH響應(yīng)的微膠囊 近年來(lái)，微膠囊作為一種有效的藥物載體，受到廣泛關(guān)注。2016年，希伯來(lái)大學(xué)Itamar Willner教授團(tuán)隊(duì)利用碳酸鈣（CaCO3）微粒攜帶冷光量子點(diǎn)硒化鎘/硫化鋅（CdSe/ZnS），外部包被多聚烯丙胺鹽酸鹽（Poly- allylamine hydrochloride，PAH）后，五條DNA鏈自組裝、沉積在帶正電的PAH外層形成微膠囊；并利用pH響應(yīng)的TNAs調(diào)控了兩種微膠囊的解組裝［8］。在酸性條件（pH5.0）條件下，富含CG核酸自組裝體的微膠囊核酸外層中的C質(zhì)子化形成C-G*C堿基對(duì)、形成分子內(nèi)三螺旋結(jié)構(gòu)，使微膠囊外部的DNA自組裝體解組裝，導(dǎo)致微膠囊解組裝釋放CdSe/ZnS量子點(diǎn)，在620 nm處發(fā)射熒光。在堿性條件（pH9.0）下，富含AT核酸自組裝體的微膠囊核酸外層中的T去質(zhì)子化導(dǎo)致T-A*T堿基對(duì)中的Hoogsteen鍵斷裂、分子間三螺旋解構(gòu)，使微膠囊外部的DNA自組裝體解組裝，導(dǎo)致微膠囊解組裝釋放CdSe/ZnS量子點(diǎn)，在560 nm處發(fā)射熒光。

2.9.8 pH響應(yīng)的DNA瓦片的自組裝/解組裝 DNA瓦片（DNA tile）作為一種典型的DNA自組裝體，常常被視作通過(guò)黏性末端雜交互補(bǔ)、形成DNA晶格與DNA管狀結(jié)構(gòu)的基本元素［51-52］，在DNA納米技術(shù)中舉足輕重。2016年，羅馬大學(xué)Francesco Ricci將pH響應(yīng)的TNAs-SDA回路模塊化，與DNA tile的自組裝反應(yīng)模塊串聯(lián)，實(shí)現(xiàn)了DNA tiles的自組裝［53］：在堿性條件下，C去質(zhì)子化導(dǎo)致C-G*C堿基對(duì)中的Hoogsteen鍵斷裂、分子間三螺旋解構(gòu)激活SDA回路、生成去保護(hù)鏈（Deprotector）；D激活鈍化的DNA瓦片單元（Protected tile，PT）自組裝形成超分子DNA管狀結(jié)構(gòu)，釋放熒光信號(hào)。2017年，加利福尼亞大學(xué)Elisa Franco教授與羅馬大學(xué)Francesco Ricci教授合作，通過(guò)pH變化調(diào)控單鏈DNA三螺旋傳感器與調(diào)控子（Regulator）的雜交、調(diào)控DNA Tiles的自組裝與解組裝［54］：堿性條件下，C去質(zhì)子化導(dǎo)致C-G*C堿基對(duì)中的Hoogsteen鍵斷裂、單鏈DNA三螺旋傳感器結(jié)構(gòu)，生成的單鏈與regulator雜交生成雙螺旋DNA，鈍化regulator、使regulator無(wú)法與活性DNA tile的黏性末端雜交，活性DNA tile單元通過(guò)黏性末端雜交互補(bǔ)，自組裝成為DNA超分子管狀結(jié)構(gòu)。酸性條件下，C質(zhì)子化形成C-G*C堿基對(duì)、形成單鏈DNA三螺旋傳感器、使regulator從regulator-構(gòu)成DNA三螺旋傳感器的富CG的鏈形成的雜交雙鏈中脫落；被剝離后的regulator與活性DNA tile的黏性末端雜交、鈍化DNA tile活性單元，使DNA超分子管狀結(jié)構(gòu)解組裝成單個(gè)DNA tiles單元。

2.10 TNAs介導(dǎo)的擴(kuò)增傳感器

由于擴(kuò)增反應(yīng)體系加入，使TNAs生物傳感器往往具有較好的靈敏度；但由于反應(yīng)體系的復(fù)雜性，增加了傳感方法建立的難度。2014年，青島科技大學(xué)唐波教授設(shè)計(jì)了一種以磁納米粒子-莖環(huán)狀三螺旋DNA為生物識(shí)別元件、利用指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)（Exponential amplification reaction，EXPAR）放大識(shí)別信號(hào)的多循環(huán)SERS傳感器，實(shí)現(xiàn)了溶菌酶的高靈敏、通用型、快速檢測(cè)［55］。首先，目標(biāo)物溶菌酶通過(guò)與磁納米粒子-莖環(huán)狀三螺旋DNA的Loop區(qū)域親和、改變?nèi)菪Y(jié)構(gòu)，暴露出的3′端單鏈區(qū)域與標(biāo)記有SERS生物條形碼的Capture DNA雜交，在聚合酶與切刻內(nèi)切酶的共同作用下、發(fā)生EXPAR反應(yīng)剝離Trigger DNA鏈，釋放的Trigger DNA再次形成磁納米粒子-莖環(huán)狀三螺旋結(jié)構(gòu)進(jìn)入cycle 1；然后，在cycle 2中，cycle 1的EXPAR過(guò)程中由切刻內(nèi)切酶切割、聚合酶剝離的DNA 1能夠不斷打開磁納米粒子-莖環(huán)狀三螺旋結(jié)構(gòu)，與標(biāo)記有SERS生物條形碼的Capture DNA，不斷促進(jìn)cycle 1中的EXPAR擴(kuò)增效率；在cycle 3中，cycle 1與cycle 2反應(yīng)過(guò)程釋放的trigger 1能夠不斷打開磁納米離子-莖環(huán)結(jié)構(gòu)，暴露的3′端單鏈區(qū)域與標(biāo)記有SERS生物條形碼的Capture DNA雜交，發(fā)生EXPAR反應(yīng)，不斷生成的Trigger DNA進(jìn)入cycle 1促進(jìn)cycle 1中的EXPAR擴(kuò)增效率。

2015年，中山大學(xué)凌連生教授團(tuán)隊(duì)借助TNAs與HCR搭載了一種增強(qiáng)型的電化學(xué)雙鏈DNA檢測(cè)平臺(tái)［12］。研究者首先在金電極表面共價(jià)偶聯(lián)捕獲探針（Capture probe），當(dāng)存在目標(biāo)物雙鏈DNA（dsDNA target）時(shí)，加入檢測(cè)探針（Detection probe），則capture probe/ dsDNA target/detection probe形成帶有單鏈黏性末端的三螺旋DNA結(jié)構(gòu)；然后，單鏈黏性末端促發(fā)HCR，加入AuNPs表征電化學(xué)信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)dsDNA target的檢測(cè)。

同年，凌連生教授團(tuán)隊(duì)建立了一種基于TNAs的PCR擴(kuò)增傳感器［56］。利用Tmb的劈裂適配體探針probe A與probe B結(jié)合目標(biāo)物Tmb、形成帶有單鏈區(qū)域的雙鏈DNA，在DNA 聚合酶的延伸作用下生成完整雙鏈；該雙鏈DNA作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）的模板，在上下游引物P1與P2與輔助下生成大量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；加入分子信標(biāo)（Molecular beacon，MB），分子信標(biāo)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)被PCR的雙鏈擴(kuò)增產(chǎn)物打開、形成DNA三螺旋結(jié)構(gòu)，因熒光供體基團(tuán)與熒光淬滅基團(tuán)無(wú)法發(fā)生FRET、熒光信號(hào)顯著增加，進(jìn)行對(duì)PCR擴(kuò)增的表征，實(shí)現(xiàn)了對(duì)Tmb的靈敏檢測(cè)。

2.11 納米材料-TNAs生物傳感器

近年來(lái)，具有納米尺度的新型納米材料與功能核酸結(jié)合，因具有諸多優(yōu)良性質(zhì)，如顏色變化、配體攜帶/釋放與相態(tài)轉(zhuǎn)變，而受到廣泛關(guān)注。TNAs作為功能核酸的重要組成成分，與AuNPs粒子共價(jià)偶聯(lián)后、通過(guò)pH調(diào)節(jié)，可以構(gòu)建基于TNAs與AuNPs的可視化傳感器；與DNA origami納米單元或DNA單鏈閉環(huán)納米單元共價(jià)偶聯(lián)、通過(guò)pH調(diào)節(jié)，可以實(shí)現(xiàn)基于TNAs的DNA納米單元的低聚與分散。

核酸水凝膠是利用核酸序列的可編輯性、核酸行為的可預(yù)知性、功能核酸的功能可控性，通過(guò)核酸自組裝形成的親水性三維核酸網(wǎng)狀聚合物?；赥NAs的水凝膠主要指通過(guò)TNAs對(duì)不同外界環(huán)境因素的響應(yīng)（主要指pH變化），完成水凝膠的膠態(tài)-液態(tài)相態(tài)轉(zhuǎn)化、使包裹在水凝膠中的信號(hào)分子在液態(tài)時(shí)被釋放、在膠態(tài)時(shí)被封閉的“智能水凝膠”。2015年，以色列希伯來(lái)大學(xué)Itamar Willner教授團(tuán)隊(duì)將構(gòu)成TNAs的兩條鏈分別共價(jià)偶聯(lián)在丙烯酰胺單體上，構(gòu)建了兩種模式的水凝膠膠-液態(tài)相態(tài)傳感轉(zhuǎn)換［57］。在酸性（pH5.0）-中性（pH7.4）不同的pH條件下，中性pH使兩條DNA鏈雙鏈雜交、丙烯酰胺單體鏈相互交聯(lián)、形成聚丙烯酰胺凝膠態(tài)；酸性pH使其中一條DNA鏈形成分子內(nèi)TNAs，聚丙烯酰胺解體生成丙烯酰胺單體，由膠態(tài)相變?yōu)橐簯B(tài)。在中性（pH7.0）-堿性（pH10.0）不同的pH條件下，中性pH使兩條DNA鏈雜交生成TNAs、丙烯酰胺單體鏈相互交聯(lián)、形成聚丙烯酰胺凝膠態(tài)；堿性pH使分子間TNAs解構(gòu)、聚丙烯酰胺解體生成丙烯酰胺單體，由膠態(tài)相變?yōu)橐簯B(tài)。如果水凝膠的初次形成在有固定形狀的模具中完成，借助丙烯酰胺單體上雙螺旋殘基的相互作用，可以為水凝膠從液態(tài)恢復(fù)至固態(tài)提供短暫記憶，制作成具有的形狀記憶的“智能水凝膠”［58-59］。

除去丙烯酰胺可以作為TNAs水凝膠的單體，TNAs與多聚酰胺（Polyamidoamine，PAMAM G5）、右旋糖酐結(jié)合，也可以制作TNAs水凝膠。2016年，哈佛-麻省理工健康科技聯(lián)合中心的Natalie Artzi教授團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種基于三鏈RNA的雙色熒光TNAs單元，該TNAs結(jié)構(gòu)能夠與多聚酰胺結(jié)合、形成穩(wěn)定的三螺旋納米顆粒；該三螺旋納米顆粒與右旋糖酐結(jié)合形成TNAs水凝膠，在體內(nèi)調(diào)控癌細(xì)胞內(nèi)源miRNA的表達(dá)，從而發(fā)揮抗癌作用［10］。目前，基于三螺旋核酸的水凝膠研究仍處于初級(jí)的理論探索階段，其在傳感、細(xì)胞成像、藥物遞送等領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。

3 三螺旋生物傳感器的應(yīng)用

3.1 TNAs傳感器用于單分子成像

近些年，研究者將TNAs傳感器用于成像領(lǐng)域，并做出了初步探索。2015年，京都大學(xué)Masayuki Endo教授與Hiroshi Sugiyama教授合作，將TNAs納米傳感元件應(yīng)用于單分子成像［60］。研究使用C-G*C與T-A*T兩種堿基對(duì)構(gòu)建TNAs納米結(jié)構(gòu)，將靶標(biāo)DNA鏈（1st-strand）與第三條DNA鏈（3rd-strand）分別標(biāo)記在DNA origami單元上，當(dāng)體系中存在第二條DNA鏈（2nd-strand），通過(guò)Waston-Crick氫鍵與Hoogsteen鍵的共同作用形成TNAs結(jié)構(gòu)，使用快速原子力顯微鏡（Atomic force microscope，AFM）成像技術(shù)，可以觀察到DNA origami單元的中心形成了X形的交叉節(jié)點(diǎn)，即TNAs結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)了將TNAs應(yīng)用于單分子成像。

3.2 TNAs傳感器用于配體的攜帶和釋放

近些年，研究者將TNAs傳感器用于配體的攜帶與釋放，并做出了初步探索。2016年，羅馬大學(xué)Francesco Ricci教授團(tuán)隊(duì)將TNAs結(jié)構(gòu)與劈裂適配體結(jié)合，設(shè)計(jì)了一種通用型、模塊化的TNAs傳感方法，利用TNAs結(jié)構(gòu)的形成調(diào)控目標(biāo)小分子的攜帶與釋放［61］。首先，研究者通過(guò)TNAs的形成拉近了劈裂ATP適配體的空間距離，在加入目標(biāo)物ATP之后可以有效形成目標(biāo)物/適配體的超分子聚合物，起到攜帶小分子目標(biāo)物的作用；在加入TNAs結(jié)構(gòu)中第三鏈的互補(bǔ)鏈competitor之后，competitor與TNAs的第三鏈結(jié)合形成更穩(wěn)定的雙鏈DNA，破壞TNAs結(jié)構(gòu)，使目標(biāo)物/適配體的超分子聚合物結(jié)合能力下降，從而釋放ATP，起到釋放小分子目標(biāo)物的作用。同時(shí)，由通用型、模塊化的TNAs傳感模塊也可以用于調(diào)控單鏈DNA的攜帶與釋放。

2017年，希伯來(lái)大學(xué)Itamar Willner團(tuán)隊(duì)將TNAs與金屬-有機(jī)骨架（Metal-Organic Frame works，MOFs）結(jié)合，設(shè)計(jì)了一種pH響應(yīng)性的用于配體釋放的門控模型［9］。研究者首先將氨基修飾的單鏈DNA（2）共價(jià)修飾到有羧基修飾的MOFs表面；然后將R6G作為模式配體目標(biāo)物裝載到MOFs內(nèi)部，利用偶聯(lián)在MOFs表面的單鏈DNA（2）與單鏈DNA（3）形成的雜交雙鏈發(fā)揮鎖式功能、將R6G封鎖在MOFs內(nèi)部（pH 7.4）；當(dāng)體系pH調(diào)至5.5時(shí)，C質(zhì)子化形成的C-G*C堿基對(duì)促使單鏈DNA（3）形成TNAs結(jié)構(gòu)、打開雜交雙鏈，使裝載到MOFs內(nèi)部的R6G分子釋放。綜上所述，TNAs生物傳感器具備攜帶與釋放配體的潛力，但目前的研究?jī)H僅停留在模式分子的研究層面。

3.3 TNAs傳感器用于細(xì)胞調(diào)控

2016年，哈佛-麻省理工健康科技聯(lián)合中心的Natalie Artzi教授團(tuán)隊(duì)研究了一種基于RNA序列的TNAs水凝膠傳感器［10］。該TNAs水凝膠傳感器利用特異的RNA序列識(shí)別癌細(xì)胞內(nèi)micro RNA（miRNA），發(fā)揮抑制癌細(xì)胞miRNA-221與替換癌細(xì)胞miRNA-205的雙重功能，在體內(nèi)調(diào)控癌細(xì)胞內(nèi)源miRNA的表達(dá)，發(fā)揮了抗癌作用。

3.4 TNAs傳感器用于檢測(cè)

近年來(lái)，TNAs傳感器廣泛應(yīng)用于各類目標(biāo)物的檢測(cè)，大大推動(dòng)了快速檢測(cè)領(lǐng)域的技術(shù)革新。基于核酸鏈的互補(bǔ)、三螺旋核酸的特異性結(jié)合與aptamer與目標(biāo)物的特異親和，目前TNAs傳感器用于檢測(cè)的目標(biāo)物類別主要包括：核酸類目標(biāo)物、細(xì)胞類目標(biāo)物、蛋白類目標(biāo)物、金屬離子類目標(biāo)、微生物類目標(biāo)物和抗生素類目標(biāo)物［27］等。

3.4.1 檢測(cè)核酸類目標(biāo)物 將TNAs傳感器應(yīng)用于核酸類目標(biāo)物的檢測(cè)，使用最為廣泛。2013年，羅馬大學(xué)Francesco Ricci教授團(tuán)隊(duì)建立了夾鉗狀TNAs熒光傳感器，基于Waston-Crick氫鍵與Hoogsteen鍵形成的TNAs結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)了單鏈DNA的高靈敏度、高特異性檢測(cè)，能夠區(qū)分單堿基錯(cuò)配［11］。2013年，福州大學(xué)林振宇教授團(tuán)隊(duì)建立了基于TNAs的電化學(xué)傳感器，利用標(biāo)記有二茂鐵的固定化核酸探針捕獲雙鏈DNA形成TNAs結(jié)構(gòu)、導(dǎo)致的電化學(xué)信號(hào)變化，定量檢測(cè)雙鏈DNA［62］。2017年，湖南大學(xué)楊榮華教授與張小華教授團(tuán)隊(duì)建立了莖環(huán)狀TNAs電化學(xué)傳感器，基于固定在金電極上的DNA探針與標(biāo)記有二茂鐵的DNA探針形成的TNAs結(jié)構(gòu)，在加入單鏈DNA待測(cè)物后的TNAs結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變、導(dǎo)致的電信號(hào)變化，實(shí)現(xiàn)了對(duì)單鏈DNA待測(cè)物的檢測(cè)［63］。2017年，湖南大學(xué)鄭晶教授與楊榮華教授團(tuán)隊(duì)合作，將帶有熒光基團(tuán)（Cy5，ROX）標(biāo)記的莖環(huán)狀TNAs傳感元件偶聯(lián)在AuNPs上，由于FRET作用AuNPs淬滅了熒光基團(tuán)的熒光；借助胞吞作用將AuNPs/TNAs超分子復(fù)合物攝入細(xì)胞后，通過(guò)信使RNA（Messenger RNA，mRNA）破壞TNAs結(jié)構(gòu)、釋放熒光標(biāo)記的DNA探針、定量輸出熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)mRNA的定量［64］。

3.4.2 檢測(cè)細(xì)胞類目標(biāo)物 TNAs傳感器可以用于細(xì)胞類目標(biāo)物的檢測(cè)。2014年，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)張教授團(tuán)隊(duì)將TNAs傳感器應(yīng)用于癌細(xì)胞的檢測(cè)［13］。首先，研究者將適配體（Aptamer）鏈標(biāo)記在Fe3O4/Au復(fù)合納米顆粒表面，在cDNA鏈與Aptamer鏈互補(bǔ)之后，借助氯化甲氧糵因的穩(wěn)定作用、使cDNA與雙鏈質(zhì)粒形成穩(wěn)定的TNAs結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入細(xì)胞后，TNAs結(jié)構(gòu)如蛋白合成系統(tǒng)、高表達(dá)綠色熒光蛋白，實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的檢測(cè)。

3.4.3 檢測(cè)蛋白類目標(biāo)物 TNAs傳感器可以用于蛋白類目標(biāo)物的檢測(cè)。2016年，GuangfengWang教授團(tuán)隊(duì)在姜瑋教授利用TNAs傳感器檢測(cè)TF的基礎(chǔ)上［14］，利用電化學(xué)平臺(tái)的固定化DNA探針捕獲被TF置換下來(lái)的單鏈核酸，進(jìn)而促發(fā)HCR反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了以TF為代表物的蛋白質(zhì)類的檢測(cè)［65］。

3.4.4 檢測(cè)金屬離子類目標(biāo)物 TNAs傳感器可以用于金屬離子類目標(biāo)物的檢測(cè)。2007年，伊利諾伊大學(xué)Yi Lu教授團(tuán)隊(duì)使用含有TNAs結(jié)構(gòu)銅離子依賴型脫氧核酶（DNAzyme）熒光傳感器，實(shí)現(xiàn)了銅離子的特異性靈敏檢測(cè)［66］。2016年，濟(jì)南大學(xué)魏琴教授利用T-Hg2+-T形成的分子內(nèi)雜交雙鏈?zhǔn)骨o環(huán)狀TNAs結(jié)構(gòu)解構(gòu)、釋放出的固定化單鏈探針利用AuNPs輔助、輸出電化學(xué)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)Hg2+的檢測(cè)［67］。

3.4.5 檢測(cè)微生物類目標(biāo)物 TNAs傳感器可以用于微生物類目標(biāo)物的檢測(cè)。2017年，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)羅云波教授團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一種基于莖環(huán)狀TNAs的可視化傳感器［16］。研究者利用大腸桿菌內(nèi)毒素（脂多糖）與莖環(huán)狀TNAs傳感元件的Aptamer loop區(qū)域結(jié)合，破壞TNAs結(jié)構(gòu)、釋放的單鏈DNA探針被固定化的捕獲DNA探針抓獲、促發(fā)HCR反應(yīng)，利用生物素-親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶顯色系統(tǒng)可視化輸出檢測(cè)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌的可視化檢測(cè)。

4 總結(jié)與展望

對(duì)TNAs生物傳感器的研究仍處于初級(jí)探索階段。在理論層面，首先，通用型TNAs傳感元件的應(yīng)用受制于目標(biāo)物-aptamer與TNAs形成的熱動(dòng)力學(xué)平衡，仍需要借助物理化學(xué)、數(shù)學(xué)建模等交叉學(xué)科進(jìn)一步完善通用型TNAs的理論模型、實(shí)現(xiàn)通用型分析傳感；其次，可逆型TNAs納米開關(guān)的再生效率通常在數(shù)次可逆反應(yīng)后明顯降低，如何提高其再生效率及其使用次數(shù)仍是亟待解決的問(wèn)題；最后，目前應(yīng)用的TNAs傳感器的三螺旋序列組成主要局限在T-A*T與C-G*C兩種堿基對(duì)，探索其他三螺旋堿基對(duì)的理論性質(zhì)、突破TNAs設(shè)計(jì)的序列枷鎖，對(duì)TNAs生物傳感器的推廣應(yīng)用十分必要。在應(yīng)用層面，目前的TNAs生物傳感器主要應(yīng)用于快速分析檢測(cè)領(lǐng)域，處于檢測(cè)方法的搭建階段，且有些檢測(cè)分析方法流程復(fù)雜、不易重復(fù)再現(xiàn)，距離快速、靈敏、特異的檢測(cè)目標(biāo)仍有較大差距。因此，簡(jiǎn)化TNAs傳感器檢測(cè)方法的設(shè)計(jì)、增加其檢測(cè)穩(wěn)定性仍然任重道遠(yuǎn)；TNAs生物傳感器雖然具備攜帶與釋放配體、細(xì)胞內(nèi)成像的潛力，但其研究?jī)H僅停留在模式目標(biāo)物的研究層面，距離藥物遞送、生物成像的應(yīng)用目標(biāo)仍有較大差距；TNAs傳感器在胞內(nèi)調(diào)控等應(yīng)用仍處在模型研究階段，仍要需要繼續(xù)探索。對(duì)于學(xué)科發(fā)展而言，DNA納米科技的發(fā)展離不開材料學(xué)的支撐，目前AuNPs與水凝膠技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)大大豐富了TNAs生物傳感器的搭建，未來(lái)新型材料的發(fā)展勢(shì)必會(huì)帶動(dòng)納米級(jí)TNAs生物傳感器的革新與進(jìn)步。相信隨著科技的進(jìn)步，TNAs的生物傳感器在未來(lái)一定會(huì)有更為廣闊的應(yīng)用前景。