功能核酸納米機(jī)器生物傳感器的研究進(jìn)展

張倩 田晶晶，2 羅云波，2 許文濤，2

（1. 北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2. 農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物食用安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京），中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100083）

生物納米機(jī)器是天然或人為設(shè)計(jì)的組件，它們受環(huán)境變化所產(chǎn)生的物理或化學(xué)刺激而使結(jié)構(gòu)或構(gòu)象發(fā)生變化。生物納米機(jī)器可以用作傳感器、馬達(dá)或用于體外基因表達(dá)的邏輯分析［1-2］。最初的生物納米機(jī)器是天然的內(nèi)源蛋白質(zhì)，如驅(qū)動(dòng)蛋白、動(dòng)力蛋白、肌球蛋白、旋轉(zhuǎn)分子馬達(dá)、DNA解旋酶及RNA聚合酶等［3-5］，它們通過構(gòu)象的變化將三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）水解產(chǎn)生的化學(xué)能轉(zhuǎn)化成機(jī)械能，從而實(shí)現(xiàn)各種功能。受蛋白質(zhì)馬達(dá)的啟發(fā)，利用沃森-克里克氫鍵的特異性和可預(yù)測(cè)性，構(gòu)建了核酸納米機(jī)器。核酸分子除了能夠攜帶遺傳信息以外，單鏈DNA能夠自我折疊成復(fù)雜的三級(jí)結(jié)構(gòu)，成為具有特異性識(shí)別能力以及催化活性的功能核酸。功能核酸的特性由其堿基序列中的編碼信息決定，這些堿基可依照沃森-克里克堿基互補(bǔ)配對(duì)原則形成不同的結(jié)構(gòu)，如雙鏈體、超分子交叉磚、G-四鏈體、C-四鏈體（i-motifs）、堿基-金屬-離子復(fù)合物等（圖1）［3］。功能核酸納米機(jī)器是天然或人工設(shè)計(jì)的通過核酸堿基序列特異性相互作用而自組裝形成的核酸組件。關(guān)于功能核酸納米機(jī)器的研究越來(lái)越多（圖2），功能核酸納米機(jī)器的運(yùn)轉(zhuǎn)可通過兩種方式使其結(jié)構(gòu)或構(gòu)象發(fā)生轉(zhuǎn)化而被激活，一種方式是功能核酸與特定信號(hào)分子相互作用使其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化；另一種方式是在外界環(huán)境的刺激下（如改變pH、加入離子、用不同的光照射等）使功能核酸構(gòu)象發(fā)生變化。目前，功能核酸納米機(jī)器的表征方法主要有：熒光光譜分析法、凝膠電泳法、透射電子顯微鏡觀察法、掃描電鏡觀察法、原子力顯微鏡觀察法、動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)及圓二色譜法。

圖1 核酸不同的結(jié)構(gòu)示意圖

圖2 功能核酸納米機(jī)器發(fā)展歷程圖

本文總結(jié)了經(jīng)典的功能核酸納米機(jī)器，如G-四鏈體功能核酸介導(dǎo)的、適配子功能核酸介導(dǎo)的、脫氧核酶介導(dǎo)的、霍利迪結(jié)功能核酸介導(dǎo)的、基于非金屬、金屬材料的、鏈置換的、點(diǎn)擊反應(yīng)的、三螺旋核酸的、pH響應(yīng)的、光誘導(dǎo)的功能核酸納米機(jī)器。繼而介紹了功能核酸納米機(jī)器在藥物靶向遞送、生物成像的應(yīng)用。最后展望了功能核酸納米機(jī)器的應(yīng)用前景及可能遇到的挑戰(zhàn)。

1 G-四鏈體功能核酸介導(dǎo)的納米機(jī)器

G-四鏈體（G-quadruplexes）是一種特殊的DNA結(jié)構(gòu)，是由富G的核酸序列中4個(gè)鳥嘌呤（Guanine，G）兩兩間形成2個(gè)霍氏（Hoogsteen）氫鍵圍成的正方片層堆疊而成［5］。當(dāng)G-平面堆疊形成G-四鏈體時(shí)，需要金屬離子的穩(wěn)定，尤其是堿金屬離子，如K+、Na+等。這些金屬離子位于G-平面的中心，與鳥嘌呤的O6有靜電作用，因此可利用G-四鏈體的這種特性來(lái)構(gòu)建核酸納米機(jī)器。

2002年，佛羅里達(dá)大學(xué)的Tan［6］課題組和法國(guó)的Mergny［7］課題組先后利用G-四鏈體設(shè)計(jì)出了DNA分子馬達(dá)。該馬達(dá)由一條富G的單鏈DNA組成，在馬達(dá)兩端分別修飾熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，通過熒光信號(hào)強(qiáng)度變化表征馬達(dá)的運(yùn)轉(zhuǎn)。在K+、Na+、Li+鹽溶液中該單鏈DNA自組裝折疊成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，此時(shí)5′和3′端靠近，熒光被淬滅；當(dāng)加入富C的燃料鏈，其會(huì)與富G鏈配對(duì)結(jié)合形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，此時(shí)5′和3′端遠(yuǎn)離，熒光恢復(fù)。當(dāng)再加入富G的燃料鏈通過鏈置換反應(yīng)與富C鏈結(jié)合成廢棄的雙鏈，DNA又回到四鏈結(jié)構(gòu)。這種G-四鏈體納米機(jī)器實(shí)質(zhì)是基于鏈置換反應(yīng)，所以這類機(jī)器的效率和壽命有限。

G-四鏈體還可搭建在納米孔平臺(tái)上，Hou等［8］利用該特性，通過調(diào)節(jié)K+濃度來(lái)調(diào)節(jié)G-四鏈體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，然后誘導(dǎo)有效孔徑的變化，進(jìn)而控制膜的孔隙的離子滲透性。通常固定的DNA鏈以柔性的隨機(jī)卷曲狀態(tài)存在，這允許離子自由擴(kuò)散進(jìn)出；在K+存在的情況下，促進(jìn)了G-四鏈體的形成，壓縮的結(jié)構(gòu)有效地阻止了離子轉(zhuǎn)移；去除鉀離子后，四鏈體展開成柔性單鏈，恢復(fù)了通過膜的滲透性。

此外，G-四鏈體廣泛構(gòu)建在電化學(xué)平臺(tái)上組裝成納米機(jī)器，Wu等［9］將富G的核酸鏈一端用硫醇修飾，固定在金電極表面，二茂鐵衍生物偶聯(lián)到核酸鏈末端，用作電化學(xué)標(biāo)記，在不存在K+的情況下二茂鐵衍生物（Fe）和金電極之間有良好的電子轉(zhuǎn)移，在K+存在下核酸組裝成G-四鏈體，在得到的剛性結(jié)構(gòu)中，二茂鐵衍生物與電極在空間上分離，使得幾乎沒有任何電子轉(zhuǎn)移。

2 適配體功能核酸介導(dǎo)的納米機(jī)器

適配體是能夠通過特定的構(gòu)象來(lái)靶向特定的分子的單鏈DNA或RNA。其通過分子間作用力（如氫鍵、范德華力和靜電力等）與目標(biāo)分子結(jié)合，并具有高度的親和力和選擇性［10-11］，可以媲美抗體的優(yōu)勢(shì)。適配體是通過SELEX體外篩選得到的［12］，可以結(jié)合所選擇的任何目標(biāo)，應(yīng)用范圍廣。此外，適配體還具有設(shè)計(jì)靈活性、易于改性、化學(xué)穩(wěn)定性和快速的組織滲透等優(yōu)點(diǎn)。

Banerjee等［13］設(shè)計(jì)了一種新型DNA二十面體，可以由環(huán)鳥苷二磷酸（Cyclic guanosine diphosphate，cdGMP）外刺激，從中線劈裂成兩部分，釋放里面裝載的分子貨物。設(shè)計(jì)的該cdGMP刺激響應(yīng)型DNA二十面體，是通過在傳統(tǒng)的二十面體的連接處中引入cdGMP的核酸適配體實(shí)現(xiàn)的。cdGMP 是細(xì)菌里的一種二級(jí)信使（內(nèi)生性分子）可以調(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)程，與細(xì)菌的生命形式及代謝形式息息相關(guān)。當(dāng)cdGMP存在時(shí)，cdGMP與適配體結(jié)合引起適配體構(gòu)象變化，觸發(fā)鏈置換導(dǎo)致DNA二十面體解離成兩半，使得內(nèi)部裝載的貨物釋放出來(lái)。該研究用熒光左旋糖苷作為模式裝載物，因此可以用熒光檢測(cè)裝載貨物的釋放情況。這種適配體嵌入的二十面體，能通過改變適配體類型與多種生理分泌型分子信號(hào)相結(jié)合，在不同的生理環(huán)境中實(shí)現(xiàn)空間或時(shí)間可控的貨物釋放，對(duì)于體內(nèi)可控分子遞送具有一定的指導(dǎo)意義。

3 脫氧核酶功能核酸介導(dǎo)的納米機(jī)器

這類功能核酸納米機(jī)器都有脫氧核酶的參與，脫氧核酶（DNAzyme）是一種能特異結(jié)合并切割RNA或DNA分子的功能核酸DNA，具有高效的催化降解能力。DNAzyme具有容易制備，對(duì)于化學(xué)降解和酶降解不敏感等優(yōu)點(diǎn)［14-15］。8-17DNAzyme和10-23DNAzyme［16］以及它們的變體是研究最多以及應(yīng)用最廣泛的兩類DNAzyme。DNAzyme有類似于酶的催化活性［17］，在金屬離子的作用下可以對(duì)底物鏈的rA位點(diǎn)切割，底物鏈斷裂，通過熒光標(biāo)記的熒光信號(hào)或者是產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)的改變對(duì)靶標(biāo)物質(zhì)的含量進(jìn)行檢測(cè)。

近年來(lái)，基于脫氧核酶的功能核酸納米機(jī)器的研究越來(lái)越多，該類納米機(jī)器種類也豐富多樣。有結(jié)合鏈置換反應(yīng)形成雙鏈后將DNAzyme酶鏈釋放使其結(jié)合底物鏈，從而使得機(jī)器運(yùn)轉(zhuǎn)，Peng等［18］基于此構(gòu)建了一種檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miRNA的納米機(jī)器，其原理是首先將脫氧核酶運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)構(gòu)建在金納米粒子（Au nanoparticles，AuNP）上，AuNP被數(shù)百個(gè)底物鏈和幾十個(gè)DNAzyme分子官能化，每個(gè)分子都被一個(gè)鎖定鏈沉默。在細(xì)胞內(nèi)部，目標(biāo)miRNA與鎖定鏈雜交，并通過鏈置換反應(yīng)從DNAzyme釋放鎖鏈。解鎖的DNAzyme隨后與其底物雜交。二價(jià)金屬輔因子激活裂解底物的DNAzyme，產(chǎn)生兩個(gè)DNA片段F1、F2。其中含有FAM的F1片段從AuNP表面釋放，恢復(fù)由AuNP先前淬滅的熒光。同時(shí)，DNAzyme從F2片段解離，隨后與下一個(gè)底物鏈雜交，從而實(shí)現(xiàn)了從一個(gè)底物鏈到下一個(gè)底物鏈的電機(jī)行走。通過測(cè)量熒光增加，可以實(shí)時(shí)地對(duì)DNA馬達(dá)的細(xì)胞內(nèi)操作進(jìn)行成像。另外，熒光增加與細(xì)胞中目標(biāo)miRNA鏈的量成比例，使得能夠原位放大地檢測(cè)活細(xì)胞中的miRNA。Wu等［19］也基于類似的原理實(shí)現(xiàn)了功能核酸納米機(jī)器檢測(cè)體內(nèi)miRNA。

還有類似雙抗夾心介導(dǎo)的脫氧核酶納米機(jī)器，Chen等［20］將脫氧核酶連接上配體L1，AuNP上連接有熒光探針鏈和第二配體L2，當(dāng)加入靶標(biāo)物質(zhì)后，靶標(biāo)物質(zhì)與兩個(gè)配體結(jié)合將脫氧核酶加載到AuNP軌道上，誘導(dǎo)DNAzyme與其底物之間的雜交。在Mg2+的存在下，DNAzyme被活化以切割底物，從AuNP釋放F。釋放的F可以發(fā)熒光，可以實(shí)時(shí)監(jiān)控電機(jī)的運(yùn)行情況。

此外，還有將脫氧核酶鎖定在發(fā)卡結(jié)構(gòu)中的納米機(jī)器，Yang等［21］構(gòu)建了此納米機(jī)器用于在活細(xì)胞中對(duì)miRNA進(jìn)行擴(kuò)增成像。它由AuNP和發(fā)卡鎖定的脫氧核酶鏈組成。在沒有靶miRNA時(shí)，發(fā)夾鎖定的脫氧核酶鏈通過分子內(nèi)雜交形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，這樣就抑制了脫氧核酶鏈的催化活性，并且通過AuNP淬滅熒光。然而，在靶標(biāo)存在下，靶標(biāo)—探針雜交可打開發(fā)夾并在催化核心中形成活性二級(jí)結(jié)構(gòu)以產(chǎn)生“活性”DNAzyme，然后在Mg2+的輔助下切割自身鏈。切割的兩個(gè)較短的DNA片段與目標(biāo)分離。結(jié)果顯示，熒光團(tuán)從AuNP中釋放出來(lái)，并且熒光增強(qiáng)。同時(shí)，靶標(biāo)也被釋放并結(jié)合另一個(gè)發(fā)夾鎖定的脫氧核酶鏈以驅(qū)動(dòng)另一個(gè)循環(huán)。以這種方式，目標(biāo)回收擴(kuò)增導(dǎo)致顯著的信號(hào)增強(qiáng)，因此具有較高的檢測(cè)靈敏度。

4 霍利迪功能核酸介導(dǎo)的納米機(jī)器

2006年，Buranachai等［22］構(gòu)建了一種節(jié)拍器型功能核酸納米機(jī)器，該節(jié)拍器是由4條單鏈DNA組成，形成一個(gè)四路連接點(diǎn)（霍利迪連接點(diǎn)）［23］，兩條額外的單鏈突出部分能夠彼此形成堿基對(duì)。在存在二價(jià)金屬離子時(shí)，霍利迪連接處折疊成緊湊的構(gòu)象——IsoI構(gòu)象①和IsoII構(gòu)象③④，分子通過中間開放結(jié)構(gòu)②實(shí)現(xiàn)兩個(gè)緊湊構(gòu)象之間的轉(zhuǎn)變，黏性末端的堿基配對(duì)降低了結(jié)構(gòu)④的自由能，迫使納米節(jié)拍器保持更長(zhǎng)的IsoII構(gòu)象。二價(jià)金屬離子（如Mg2+）的存在對(duì)構(gòu)象的轉(zhuǎn)變至關(guān)重要，并且這種隨機(jī)節(jié)拍器的滴答速率取決于離子濃度。另外，可以通過一組基于DNA的開關(guān)（去活化劑/活化劑）來(lái)可逆的停止/重新激活黏性末端。去活化劑競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合到螺旋末端的單鏈突出端上，使黏性末端沉默。這種結(jié)合為活化劑結(jié)合留下懸突柄，并且隨后通過三股分支遷移移除去活化劑。在這種節(jié)拍器中，單鏈突出部分分別用熒光團(tuán)和淬滅劑功能化，熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）供體和受體分別連接到兩個(gè)螺旋末端，根據(jù)空間距離不同顯示不同頻率的FRET以此表征該納米機(jī)器的運(yùn)轉(zhuǎn)。

5 基于納米材料的功能核酸納米機(jī)器

5.1 基于非金屬納米材料的功能核酸納米機(jī)器

5.1.1 基于碳納米材料的功能核酸納米機(jī)器 碳納米管是一種具有特殊結(jié)構(gòu)的一維量子材料，有單壁碳納米管（Single-wall carbon nanotubes，SWNTs）和多壁碳納米管（Multi-wall carbon nanotubes，MWNTs），相比較而言MWNTs具有較大的縱橫比［24］，直徑較大［25］。功能核酸與碳納米管主要以兩種方式結(jié)合，一是單鏈DNA（ssDNA）通過堿基芳環(huán)與碳納米管側(cè)壁之間的π-π電子相互作用吸附到碳納米管上［26］，也可能是通過范德華力、疏水相互作用、靜電作用等綜合的結(jié)果［27］，故碳納米管只吸附單鏈，對(duì)雙鏈的作用較弱；二是將碳納米管功能化通過靜電相互作用結(jié)合。通過篩選寡核苷酸文庫(kù)，Zheng等［28-29］已經(jīng)證明，單鏈DNA的特定序列可以自組裝成單個(gè)碳納米管周圍的螺旋結(jié)構(gòu)。2009年，Zhao等［30］首先提出了由單壁碳納米管誘導(dǎo)的DNA納米機(jī)器，它可以在生理pH下檢測(cè)人端粒i-motif DNA的形成。他們將人類端粒G-四聯(lián)體作為DNA馬達(dá)固定在金表面上，DNA馬達(dá)和其互補(bǔ)的人端粒i-motif DNA之間的可逆雜交可以通過SWNT調(diào)節(jié)而不改變?nèi)芤簆H。多壁碳納米管通過氧化作用，易形成可電離的羧基，羧基在水溶液中帶負(fù)電荷，會(huì)通過靜電作用吸附帶正電荷的納米金［31］。馮永成等［32］將多壁碳納米管氧化使其表面帶有羧基基團(tuán)，再通過多步化學(xué)反應(yīng)使羧基轉(zhuǎn)化為巰基，加入HAuCl4后，在模板上通過甲醛的還原生成金納米粒子，最后在模板的引導(dǎo)下連成金納米線。

除碳納米管外，二維單原子結(jié)構(gòu)的氧化石墨烯（Graphene oxide，GO）的應(yīng)用也較廣泛。單鏈DNA可以通過共價(jià)鍵結(jié)合作用和π-π電子堆積物理吸附在氧化石墨烯表面。此外，氧化石墨烯具有比較高的熒光淬滅效應(yīng)。Dong等［33］通過將氧化石墨烯距離依賴性熒光淬滅與等溫鏈置換聚合酶反應(yīng)（Isothermal chain displacement polymerase reaction，ISDPR）相結(jié)合來(lái)提高檢測(cè)miRNA的靈敏度。在缺乏特異性靶標(biāo)的情況下，ssDNA和GO之間的相互作用較強(qiáng)，以及基于FRET的GO機(jī)制的高熒光淬滅效率，使得用熒光染料標(biāo)記的ssDNA顯示最小的背景熒光。當(dāng)特定靶標(biāo)存在時(shí)，底物鏈識(shí)別靶標(biāo)形成雙鏈結(jié)構(gòu)，由于DNA-miRNA雙鏈螺旋與GO之間的相互作用較弱，因此觀察到強(qiáng)烈的熒光。

5.1.2 基于硅納米材料的功能核酸納米機(jī)器 介孔二氧化硅納米粒子（Mesoporous silica nanoparticles，MSNs）是一種新型的無(wú)機(jī)納米粒子，在藥物遞送系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用，其優(yōu)勢(shì)在于MSNs有較大的比表面積（600-1 000 m2/g）和比孔容（0.6-1.0 cm3/g），允許較高的載藥量；而且具有良好的生物相容性，所以MSNs不僅可以作為將不溶于水的藥物分子整合到細(xì)胞中的載體，還可以保護(hù)它們不被破壞，可應(yīng)用于臨床診斷和治療；另外，MSNs表面有豐富的硅羥基，可進(jìn)行化學(xué)修飾使其表面功能化，以滿足不同的生物學(xué)需求［34-35］。MSNs 易富集于肝臟和脾臟，是一種有潛力的肝靶向載體。Gu等［36］在MSNs外表面鏈接聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）分子，然后將D-半乳糖胺分子共價(jià)結(jié)合到MSNs- PEG上，其中PEG增加了MSNs在體循環(huán)中的停留時(shí)間，D-半乳糖胺是靶向肝癌細(xì)胞表面脫唾液酸蛋白受體。MSNs內(nèi)表面封裝阿霉素抗癌藥物，負(fù)載藥物以pH依賴性方式釋放，在pH5.5和6.5時(shí)比在pH 7.4時(shí)釋放得更快。

5.2 基于金屬納米材料的功能核酸納米機(jī)器

5.2.1 金納米粒子介導(dǎo)的納米機(jī)器 AuNPs合成方式簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性好，抗氧化能力強(qiáng)，能使用合適的配體提供高比表面積，對(duì)人體無(wú)害［37］，且具有良好的生物相容性，能提供一個(gè)類似生物分子本體環(huán)境的微環(huán)境，較好的保持生物組分的活性［38］。金納米粒子大多是用氯金酸和還原劑（通常檸檬酸鈉鹽或硼氫化物）反應(yīng)制得，納米金顆粒比較容易同巰基結(jié)合形成很強(qiáng)的Au-S共價(jià)鍵［39］，將帶有各種活性基團(tuán)的巰基化合物通過共價(jià)鍵結(jié)合在金納米表面，還可通過靜電吸附作用將氨基非共價(jià)結(jié)合到金納米上，形成的探針可用于生物體系的檢測(cè)。金納米粒子起信號(hào)增強(qiáng)和放大的作用，提高了生物傳感器的靈敏度。

AuNPs能夠高效的淬滅染料分子的熒光，所以當(dāng)帶有熒光基團(tuán)的探針結(jié)合在金納米顆粒上，其熒光被淬滅，無(wú)熒光信號(hào)輸出，當(dāng)用酶或其他物質(zhì)切割探針，使得熒光基團(tuán)從金納米顆粒上釋放，則發(fā)出熒光。AuNPs常與脫氧核酶等一起運(yùn)用于功能核酸納米機(jī)器，下文有詳細(xì)闡述。

5.2.2 基于Fe3O4磁納米粒子的納米機(jī)器 磁納米粒子（Magnetic nanoparticles，MNPS）具有異常的磁學(xué)性質(zhì)：超順磁性、高矯頑力、高磁化率和低居里溫度［40］等特性，其中超順磁性Fe3O4納米粒子由于其具有粒徑小、毒性低、磁響應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，被視為最佳的磁性納米材料［41］，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。Bacon等［42］開發(fā)了一種用于細(xì)胞凋亡信號(hào)的磁性開關(guān)，他們?cè)贛NPs表面修飾死亡受體4（Death receptor 4，DR4）單克隆抗體，可以特異性結(jié)合DLD-1人結(jié)直腸腺癌上皮細(xì)胞表面的死亡因子。在磁場(chǎng)開關(guān)處于On模式時(shí)施加磁場(chǎng)，在磁力作用下誘導(dǎo)死亡因子聚集，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并且成功誘導(dǎo)了斑馬魚的細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致形態(tài)發(fā)生明顯變化。

Fe3O4有其獨(dú)特的磁學(xué)特性，但由于其比表面積較高，具有強(qiáng)烈的聚集傾向，所以通過表面包覆或分子修飾可降低表面能，調(diào)節(jié)磁納米粒子的生物相容性和反應(yīng)特性［43］。同時(shí)，金具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性和生物相容性及特殊的光譜性質(zhì)，且易表面修飾，故在Fe3O4表面修飾Au以提高納米顆粒的化學(xué)穩(wěn)定性，這種具有金包裹層的核殼結(jié)構(gòu)能減少內(nèi)核的氧化和腐蝕，金殼的等離子體共振性質(zhì)還能用于光熱治療［44-45］。

5.2.3 基于金屬有機(jī)骨架的納米機(jī)器 金屬-有機(jī)骨架（Metal-organic frameworks，MOFs）也稱為配位聚合物或配位網(wǎng)絡(luò)，是一類由金屬離子或簇與有機(jī)連接基團(tuán)在相對(duì)溫和的條件下自組裝形成的混合材料［46-48］。MOFs屬于一種新興的結(jié)晶分子功能材料，具有很多特性，其中包括超高的孔隙率、優(yōu)異的結(jié)構(gòu)可調(diào)性、巨大的內(nèi)部表面積、結(jié)構(gòu)多樣性、高的化學(xué)穩(wěn)定性和強(qiáng)大的熱穩(wěn)定性等［47］。MOFs的結(jié)構(gòu)也可以從一維（One-dimensional，1D）、二維（Two-dimensional，2D）到三維（Three-dimensional，3D）［48］。目前，MOFs已被廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域，其中包括均相催化、氣體儲(chǔ)存與分離、作為藥物遞送載體及生物成像等。

Kahn等［49］進(jìn)一步推進(jìn)了MOFs與功能核酸相結(jié)合的檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展。他們首次將刺激響應(yīng)性DNA作為加帽單元固定在MOFs的表面來(lái)控制MOFs的加載和卸載。他們應(yīng)用 4，4’，4’’-苯 -1，3，5-三 -苯甲酸（4，4’，4’’-benzene-1，3，5-tri-benzoic acid，BTB）、氨基對(duì)苯二甲酸這兩種有機(jī)配體和羧酸鋅簇為原料反應(yīng)生成MOFs，并利用酰胺鍵將單鏈DNA修飾在MOFs表面分別設(shè)計(jì)了3種pH和K+刺激響應(yīng)性DNA功能化MOFs。第一種是pH刺激響應(yīng)性系統(tǒng)，通過將pH在5.5和7.4之間進(jìn)行切換使富含C堿基的一段DNA序列在C-四鏈體和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)之間進(jìn)行變換來(lái)實(shí)現(xiàn)MOFs孔中貨物分子的可控釋放。第二種同樣是pH刺激響應(yīng)性系統(tǒng)，通過調(diào)控pH形成三螺旋DNA來(lái)實(shí)現(xiàn)MOFs的卸載。第三種則是K+刺激響應(yīng)性系統(tǒng)，通過控制反應(yīng)液中K+和螯合劑的濃度使一段富含G堿基的DNA序列在K+依賴性G-四鏈體結(jié)構(gòu)和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)之間進(jìn)行變換來(lái)實(shí)現(xiàn)MOFs孔中貨物分子的可控釋放。

6 基于鏈置換的功能核酸納米機(jī)器

核酸單雙鏈有明顯的不同，單鏈自由度高、柔性強(qiáng)，其構(gòu)象可以自由轉(zhuǎn)變，而雙鏈?zhǔn)莿傂越Y(jié)構(gòu)，在溫和的條件下，單鏈DNA 會(huì)選擇體系中與其互補(bǔ)性最強(qiáng)的其他單鏈分子組成雙鏈，因此通過控制雙鏈的形成或破壞就可以實(shí)現(xiàn)納米機(jī)器的驅(qū)動(dòng)［50］。

第一批核酸納米機(jī)器之一——鑷子就是鏈置換反應(yīng)介導(dǎo)的核酸納米機(jī)器。2000年，Yurke等［51］構(gòu)建了鑷子這一核酸納米機(jī)器，該納米機(jī)器由3 條DNA 單鏈A、B 和C 組成，其中A鏈含有兩個(gè)18堿基序列區(qū)域，分別與B、C鏈的末端通過沃森-克里克氫鍵結(jié)合成雙鏈。通過加入單鏈DNA與鑷子特定相互作用來(lái)驅(qū)動(dòng)納米機(jī)器的運(yùn)轉(zhuǎn)。以在A鏈兩端修飾熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)表征鑷子的“開”“關(guān)”狀態(tài)。當(dāng)加入燃料鏈，其與鑷子的B、C鏈的游離堿基配對(duì)結(jié)合，使鑷子處于關(guān)閉狀態(tài)，當(dāng)加入與燃料鏈完全互補(bǔ)的反燃料鏈后，通過鏈置換反應(yīng)與燃料鏈形成穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)，從而將燃料鏈從鑷子上移下來(lái)，鑷子恢復(fù)打開狀態(tài)。2004年，Chen等［52］將脫氧核酶引入了納米鑷子中，DNA馬達(dá)由兩條單鏈組成，其中一條鏈含有能切割RNA的10-23DNAzyme，燃料鏈?zhǔn)荄NAzyme的底物，當(dāng)加入燃料鏈后其與DNAzyme鏈結(jié)合使得鑷子打開，當(dāng)有金屬離子存在時(shí)，DNAzyme切割底物，鑷子又回到關(guān)閉狀態(tài)。

2004年，Shin等［53］構(gòu)建的DNA步行者（Walker），也是鏈置換反應(yīng)介導(dǎo)的核酸納米機(jī)器，兩條部分互補(bǔ)的核酸鏈作為walker，A1鏈作為連接者將walker錨定在軌道（track）的特定單鏈上，再加入與A1鏈互補(bǔ)的D1鏈通過鏈置換反應(yīng)產(chǎn)生雙鏈廢料并釋放，然后可加入下一個(gè)連接鏈?zhǔn)箇alker錨定在track的另一個(gè)單鏈上，以此往復(fù)可實(shí)現(xiàn)walker在track上的行走，該納米機(jī)器類似于鑷子，以DNA為燃料，以鏈雜合能作為驅(qū)動(dòng)力。

7 基于點(diǎn)擊反應(yīng)的功能核酸納米機(jī)器

點(diǎn)擊化學(xué)是在溫和條件下以簡(jiǎn)便、快速、可靠和高效率反應(yīng)將兩個(gè)活性伴侶偶聯(lián)起來(lái)的最通用和模塊化的方法之一［54］。點(diǎn)擊化學(xué)已成為共價(jià)連接分子的最常用和最可靠的方法之一，已經(jīng)運(yùn)用于納米材料的化學(xué)［55］、化學(xué)生物學(xué)、藥物輸送和藥物化學(xué)［56-57］等學(xué)科中。點(diǎn)擊化學(xué)最大的魅力是可能產(chǎn)生新穎的結(jié)構(gòu)，點(diǎn)擊反應(yīng)主要有4 種類型：環(huán)加成反應(yīng)，特別是1，3-偶極環(huán)加成反應(yīng)，也包括雜環(huán)Diels-Alder反應(yīng)；親核開環(huán)反應(yīng)，特別是張力雜環(huán)的親電試劑開環(huán)；非醇醛的羰基化學(xué)；碳碳多鍵的加成反應(yīng)。其中銅（I）催化疊氮化物和末端乙炔形成1，2，3-三唑是一個(gè)特別強(qiáng)大的連接反應(yīng)，因?yàn)樗哂懈叨鹊目煽啃?，完整的特異性和反?yīng)物的生物相容性。三唑產(chǎn)品不僅僅是被動(dòng)連接器，它們很容易通過氫鍵和偶極相互作用與生物靶標(biāo)相關(guān)聯(lián)。Ge等［58］根據(jù)一價(jià)銅離子催化點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)以及DNAzyme的催化作用，并利用點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)連接劈裂DNAzyme實(shí)現(xiàn)了對(duì)銅離子的可視化定量檢測(cè)。Ni等［59］通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，將DNA與聚乳酸（Polylactide，PLA）連接形成DNA-PLA結(jié)合物，然后自組裝成兩親性DNA-PLA膠束；接下來(lái)，使用綴合的DNA作為啟動(dòng)子，通過原位滾環(huán)轉(zhuǎn)錄（Rolling circle transcription，RCT）在DNA-PLA膠束上合成多短發(fā)卡RNA（Poly-short hairpin RNA，polyshRNA），產(chǎn)生聚乳酸@多短發(fā)卡RNA微流（PLA @poly-shRNA microflowers）；最后，使用生物相容性和多功能聚（乙二醇）轉(zhuǎn)接多肽（Multifunctional poly（Ethylene glycol）-grafted polypeptides，PPT-g-PEG）將微絨毛靜電凝結(jié)成納米顆粒。這些PLA @ polyshRNA @ PPT-g-PEG納米粒子被有效地遞送到多藥耐藥蛋白（Multidrug resistance protein，MDR）乳腺癌細(xì)胞中，并在異種移植腫瘤中積累，導(dǎo)致MDR1沉默，細(xì)胞內(nèi)阿霉素（Doxorubicin，Dox）積累，增強(qiáng)了細(xì)胞凋亡和腫瘤治療功效。

8 基于三螺旋核酸的功能核酸納米機(jī)器

三螺旋核酸（Triplex nucleic acids，TNAs）是在經(jīng)典的沃森-克里克（Waston-Crick）氫鍵形成的雙鏈核酸基礎(chǔ)上，第三條寡核苷酸鏈以非經(jīng)典的胡斯特（Hoogsteen）氫鍵嵌入到雙鏈大溝中形成的超分子核酸組裝體［60］。

2014年，Amodio等［61］研究出一種pH響應(yīng)的以鏈置換反應(yīng)為基礎(chǔ)的TNAs納米機(jī)器，在OH-誘導(dǎo)下，以胞嘧啶-鳥嘌呤（Guanine，G）*胞嘧啶-（C-G*C）為主要序列組成的三螺旋結(jié)構(gòu)中的Hoogsteen鍵斷裂形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，加入侵入鏈（Invading strand，IS）發(fā)生鏈置換、產(chǎn)生游離的三螺旋第三鏈、進(jìn)而發(fā)生后續(xù)的鏈置換反應(yīng)。利用標(biāo)記在DNA鏈上的熒光供體基團(tuán)與熒光受體基團(tuán)表征納米機(jī)器的運(yùn)轉(zhuǎn)。

2017年，Ranallo等［62］設(shè)計(jì)了一種模塊化的TNAs納米機(jī)器。該納米機(jī)器由特異性抗體驅(qū)動(dòng)，利用胸腺嘧啶-腺嘌呤（Adenine，A）*胸腺嘧啶-（T-A*T）、C-G*C的三鏈核酸堿基互補(bǔ)配對(duì)規(guī)則，使用夾鉗狀結(jié)構(gòu)的黑色核酸鏈特異性識(shí)別藍(lán)色核酸鏈（DNA Cargo），形成三鏈核酸納米機(jī)器，并且在夾鉗狀核酸鏈的兩側(cè)末端共價(jià)偶聯(lián)一對(duì)抗體。當(dāng)抗體特異性與納米機(jī)器上的抗原結(jié)合，會(huì)驅(qū)動(dòng)三鏈核酸納米機(jī)器的構(gòu)象變化，先打開亞穩(wěn)態(tài)的Hoogsteen氫鍵、再打開不穩(wěn)定的Watson-Crick氫鍵，進(jìn)而釋放DNA Cargo。他們?cè)贒NA Cargo兩側(cè)分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，通過熒光強(qiáng)度的差異表征抗體驅(qū)動(dòng)的三鏈核酸納米機(jī)器的構(gòu)象變化。該納米機(jī)器能夠快速、通用、可逆及快速的攜帶并釋放以單鏈核酸為模型的分子貨物，在藥物遞送與釋放，現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)和細(xì)胞內(nèi)成像等應(yīng)用領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。

9 基于pH響應(yīng)的功能核酸納米機(jī)器

核酸四鏈體結(jié)構(gòu)除上文中提到的G-四鏈體，還有C-四鏈體（i-motif），它是由富C核酸序列中的兩個(gè)胞嘧啶C通過結(jié)合一個(gè)質(zhì)子形成3個(gè)氫鍵作為一層而交叉堆疊起來(lái)的［63-64］。i-motif的四螺旋結(jié)構(gòu)只有在弱酸性條件下能維持，在中性或堿性條件下四螺旋結(jié)構(gòu)會(huì)解開形成單鏈。Liu等［65］利用i-motif響應(yīng)pH的性質(zhì)設(shè)計(jì)了一種納米機(jī)器，該納米機(jī)器就是一段富C序列，通過在該鏈兩端標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)來(lái)表征該納米機(jī)器的運(yùn)作狀態(tài)。在弱酸性（pH ＜6.3）條件下該單鏈DNA折疊成i-motif 結(jié)構(gòu)，鏈的兩端相互靠近，熒光淬滅，此時(shí)納米機(jī)器呈關(guān)閉狀態(tài)。當(dāng)向溶液中加入堿使溶液pH達(dá)到8.0左右，i-motif 結(jié)構(gòu)不能維持，解開呈單鏈結(jié)構(gòu)，鏈兩端遠(yuǎn)離，熒光恢復(fù)，納米機(jī)器呈打開狀態(tài)。該過程是可逆的，再加入酸，又可形成i-motif 結(jié)構(gòu)，如此循環(huán)往復(fù)，通過不斷加入酸堿促使納米機(jī)器的運(yùn)轉(zhuǎn)。

Mao等［66］設(shè)計(jì)出利用pH誘導(dǎo)包裹釋放小分子的納米機(jī)器。富C的單鏈DNA修飾在金納米表面上形成單層膜，此時(shí)填充密度較低，允許小分子自由擴(kuò)散，當(dāng)加入酸使pH4.5時(shí)，形成i-motif四螺旋結(jié)構(gòu)，由于四鏈DNA空間位阻大于單鏈，此時(shí)該膜不允許小分子滲透，實(shí)現(xiàn)小分子的包裹，當(dāng)再加入堿使pH4.5時(shí)i-motif結(jié)構(gòu)被轉(zhuǎn)化為單鏈，小分子得以釋放。

10 基于光誘導(dǎo)的功能核酸納米機(jī)器

大多數(shù)納米機(jī)器需要分子燃料驅(qū)動(dòng)，典型的是需要互補(bǔ)的DNA鏈作為燃料通過鏈置換反應(yīng)來(lái)驅(qū)動(dòng)，這樣會(huì)產(chǎn)生廢棄的DNA雙鏈，在機(jī)器重復(fù)操作時(shí)溶液中廢棄的雙鏈持續(xù)堆積必定會(huì)影響機(jī)器運(yùn)作效率。另外，還面臨著“環(huán)境問題”，所以使用清潔能源來(lái)驅(qū)動(dòng)已經(jīng)成為必然，而光就是其中之一，一些光響應(yīng)分子（如螺吡喃、二芳基乙烯、芪和偶氮苯等）可通過幾何形狀的變化將光能轉(zhuǎn)化為機(jī)械能。

Liu等［67］研究了光驅(qū)動(dòng)i-motif DNA馬達(dá)運(yùn)轉(zhuǎn)。他們將含有DNA X，孔雀石綠甲醇?jí)A（Malachite green carbinol base，MGCB）和十六烷基三甲基溴化銨（Cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）的初始溶液配制成微酸性，這有助于DNA X形成i-motif結(jié)構(gòu)，在302 nm紫外光的存在下，MGCB釋放出氫氧根離子（OH-）導(dǎo)致pH值的增加，以及顯示出明顯的顏色變化，所以i-motif結(jié)構(gòu)將變形為去質(zhì)子化的無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。光線關(guān)閉后，孔雀石綠（Malachite green，MG）陽(yáng)離子會(huì)與OH-結(jié)合成MGCB進(jìn)行循環(huán)，溶液pH值相應(yīng)降低，并且DNA X再次切換回i-motif構(gòu)象。因此，可以通過交替打開和關(guān)閉紫外線來(lái)循環(huán)DNA X的構(gòu)象轉(zhuǎn)換。2008年，Liang等［68］報(bào)道了一種利用光誘導(dǎo)來(lái)控制納米機(jī)器的開關(guān)，他們改進(jìn)了控制納米鑷子開關(guān)的燃料鏈，在燃料鏈的堿基之間修飾一定數(shù)量的偶氮苯，偶氮苯是一種光敏基團(tuán)，在可見光下呈反式構(gòu)象，在紫外光下呈順式構(gòu)象，通過切換不同的光使構(gòu)象改變，導(dǎo)致堿基發(fā)生扭轉(zhuǎn)，氫鍵被破壞，燃料鏈從鑷子上脫離。所以使用紫外光照射（λ= 330-350 nm）將鑷子光開關(guān)切換至開路狀態(tài)，并且在可見光（λ= 440-460 nm）下將光鑷切換至閉合狀態(tài)。這種控制是非接觸的，且不需要添加另外的寡核苷酸作為燃料。

11 功能核酸納米機(jī)器藥物靶向遞送

Sun等［69］開發(fā)了一種生物感應(yīng)的繭狀抗癌藥物輸送系統(tǒng)，由嵌入了酸敏脫氧核糖核酸酶I（DNAase I）納米膠囊（Nanocapsule，NCa）的脫氧核酶可降解DNA納米纖維（Nanoclew，NCl）組成，用于靶向癌癥治療（圖3-A）。NCl由通過滾環(huán)擴(kuò)增（Rolling circle amplification，RCA）合成的長(zhǎng)鏈單鏈DNA組裝而成。將多個(gè)GC配對(duì)序列整合到NCl中以增強(qiáng)抗癌藥物多柔比星（Doxorubicin，DOX）的負(fù)載能力。同時(shí)，帶負(fù)電的DNAase I被包封在帶正電荷的酸可降解聚合物納米凝膠中，以便通過靜電相互作用將DNase I修飾到NCl中。在酸性環(huán)境中，DNase I的活性通過NCa的聚合物殼的酸觸發(fā)脫落而活化，導(dǎo)致NCl的繭樣自我降解并促進(jìn)DOX的釋放以增強(qiáng)治療功效。

Mou等［70］構(gòu)建了一種自組裝含氟尿苷的DNA多面體用于藥物靶向遞送以治療癌癥（圖 3-A）。氟尿苷（Fluorouridine，F(xiàn)）是一種核苷類似物治療劑，它的結(jié)構(gòu)和天然的胸腺嘧啶（Thymine，T）脫氧核糖核苷的結(jié)構(gòu)非常相似，所以通過常規(guī)固相合成將F整合到DNA鏈中，然后將這些鏈組裝成DNA四面體、十二面體和巴基球，具有確定的載藥比以及可調(diào)的大小和形態(tài)。作為一種新型的藥物輸送系統(tǒng)，這些含有藥物的DNA多面體可以理想地模擬特洛伊木馬，將化療藥物輸送到腫瘤細(xì)胞中并與癌癥作斗爭(zhēng)。體外和體內(nèi)結(jié)果表明，具有巴基球結(jié)構(gòu)的DNA特洛伊木馬具有優(yōu)于游離藥物和其他制劑的抗癌能力。通過精確控制納米載體的載藥量和結(jié)構(gòu)，DNA特洛伊木馬可能在抗癌治療中發(fā)揮重要作用，并在納米醫(yī)學(xué)領(lǐng)域表現(xiàn)出巨大的潛力。

圖3 功能核酸納米機(jī)器在藥物靶向遞送和生物成像上的應(yīng)用圖

2006年，Rothemund等［71］將長(zhǎng)鏈單鏈DNA分子折疊成“笑臉”、“五角星”等復(fù)雜的二維形狀（圖3-C），該研究創(chuàng)建了“DNA折紙術(shù)”，為后續(xù)在其上修飾更多功能基團(tuán)，實(shí)現(xiàn)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。2018年，Li等［72］利用DNA折紙術(shù)構(gòu)建出一種DNA納米機(jī)器人，可靶向運(yùn)輸凝血酶到腫瘤細(xì)胞處，從而能夠阻塞腫瘤處血管，阻礙對(duì)于腫瘤的營(yíng)養(yǎng)和氧氣的供應(yīng)，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡（圖3-D）。他們首先構(gòu)建出一種DNA自組裝的長(zhǎng)方形折紙片，然后將凝血酶固定到折紙片表面，再在折紙片兩端連接核仁素適配體使得長(zhǎng)方形折紙片能夠自動(dòng)折疊為管狀，從而形成了內(nèi)部攜帶有凝血酶的DNA納米機(jī)器人。當(dāng)該機(jī)器人被運(yùn)送至腫瘤細(xì)胞處接觸到腫瘤細(xì)胞特異性表達(dá)的核仁素時(shí)便會(huì)再次自動(dòng)打開，釋放凝血酶，在凝血酶的作用下促使腫瘤細(xì)胞處血管堵塞從而殺死腫瘤細(xì)胞。較高或相當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒DNA在COS-7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞中的基因表達(dá)。CD-PEI內(nèi)化到細(xì)胞中，在不同的激發(fā)波長(zhǎng)下顯示出可調(diào)諧的熒光發(fā)射，表明CD-PEI在基因遞送和生物成像中的潛在應(yīng)用。

12 功能核酸納米機(jī)器生物成像

Yuan等［73］報(bào)道了一種針對(duì)生物成像和光動(dòng)力療法的特定適體引導(dǎo)的G-四鏈體DNA納米機(jī)器，并且它能夠?qū)Π┘?xì)胞進(jìn)行選擇性識(shí)別和成像，可控制和有效地激活光敏劑，改善治療效果（圖3-E）。他們將富含鳥嘌呤的DNA片段與適體連接形成雙功能DNA序列，稱為G4適體。G4適體不僅加載光敏劑，而且特異性識(shí)別目標(biāo)細(xì)胞。將G4適體與上轉(zhuǎn)換納米顆粒（Upconversion nanoparticles，UCNP）生物偶聯(lián)，因此將光敏劑5，10，15，20-四-（1-甲基-4-吡啶基）-21H，23H-卟吩（5，10，15，20-tetrakis-（1-methyl-4-pyridyl）-21H，23H-porphine，TMPyP4）置于UCNP附近的位置，用于UCNP和TMPyP4之間的能量轉(zhuǎn)移。當(dāng)納米機(jī)器被遞送到癌細(xì)胞中，UCNP就被近紅外光（Near-infrared light，NIR）激發(fā)，發(fā)射可見光以使癌細(xì)胞成像，并且反過來(lái)激活TMPyP4，使得最終產(chǎn)生足夠的活性氧簇（Reactive oxygen species，ROS）以有效地殺死癌細(xì)胞。

Liu等［74］將基于聚乙烯亞胺（Polyethyleneimine，PEI）鈍化增強(qiáng)熒光的碳點(diǎn)納米載體用于生物成像，他們采用一步微波輔助熱解甘油和支化PEI25k混合物制備了PEI官能化碳點(diǎn)（CD-PEI），其中碳納米粒子的形成和表面鈍化同時(shí)完成（圖3-F）。在這個(gè)混合的C點(diǎn)中，PEI分子在該系統(tǒng)中起到兩個(gè)關(guān)鍵作用——作為富含氮的化合物來(lái)鈍化表面以增強(qiáng)熒光，并作為聚電解質(zhì)來(lái)濃縮DNA。該CD-PEI被證明是水溶性的并且依靠激發(fā)波長(zhǎng)發(fā)出穩(wěn)定的明亮的多色熒光。CD-PEI的DNA縮合能力和細(xì)胞毒性可以通過熱解時(shí)間來(lái)調(diào)節(jié)，可能是由于在形成碳點(diǎn)期間PEI的某種程度的破壞。相對(duì)于對(duì)照PEI25k，在合適的熱解時(shí)間獲得的CD-PEI表現(xiàn)出較低的毒性，

13 總結(jié)與展望

目前基于G-四鏈體功能核酸介導(dǎo)的、適配子功能核酸介導(dǎo)的、脫氧核酶介導(dǎo)的、霍利迪結(jié)功能核酸介導(dǎo)的、基于非金屬、金屬材料的、鏈置換的、點(diǎn)擊反應(yīng)的、三螺旋核酸的、pH響應(yīng)的及光誘導(dǎo)的功能核酸納米機(jī)器有很多，但是這些納米機(jī)器存在很多不足，如鏈置換反應(yīng)產(chǎn)生廢棄的雙鏈，影響機(jī)器的效率和壽命；脫氧核酶介導(dǎo)的需要體外進(jìn)行金屬離子的補(bǔ)充，所需操作時(shí)間過長(zhǎng)，不適合在實(shí)際應(yīng)用中；pH響應(yīng)的需要不斷加入酸堿，產(chǎn)生的鹽經(jīng)多次循環(huán)也會(huì)影響機(jī)器效率；遇到活性生物大分子時(shí)缺少程序性的響應(yīng)模塊，無(wú)法進(jìn)行類似于基因回路機(jī)制的胞內(nèi)調(diào)控，并且DNA納米元件在胞內(nèi)動(dòng)態(tài)環(huán)境下進(jìn)行組裝、折疊效率較低，擴(kuò)散效率以及雜交率與體外環(huán)境相比也大大降低。

功能核酸納米機(jī)器處于剛剛起步階段，隨著科技的進(jìn)步與發(fā)展功能核酸納米機(jī)器將會(huì)有更廣闊的應(yīng)用前景，其未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)：（1）復(fù)合型生物納米機(jī)器的開發(fā)，功能核酸納米機(jī)器與其他生物納米機(jī)器的功能組件的聯(lián)合使用，以期達(dá)到更高效的、友好的、簡(jiǎn)潔的效果。（2）胞內(nèi)、體內(nèi)驅(qū)動(dòng)可控納米機(jī)器的開發(fā)，一是克服體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境，二是由細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)提供驅(qū)動(dòng)力［75］，實(shí)現(xiàn)納米機(jī)器智能化控制，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)控制生物反應(yīng)進(jìn)程。（3）一體化、多元化功能核酸納米機(jī)器的開發(fā)，一體化設(shè)計(jì)以解決不同反應(yīng)組件散落于細(xì)胞內(nèi)由于時(shí)空差異而造成運(yùn)行效率低的問題［76］，多元化驅(qū)動(dòng)可使功能核酸納米機(jī)器同時(shí)發(fā)揮多重作用，豐富功能核酸納米機(jī)器的運(yùn)動(dòng)模式；更高效持久的執(zhí)行復(fù)雜生物任務(wù)。（4）搭載功能核酸的非核酸納米材料的納米毒性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，安全無(wú)毒副作用的劑量是我們開展體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的前提，將重點(diǎn)評(píng)估靶向納米材料在體內(nèi)局部組織及器官的高濃度富集所帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)，復(fù)合納米材料的體內(nèi)協(xié)同毒性，以及緩釋納米材料的慢性毒性。