基于CdSe@ZnS量子點(diǎn)水溶性納米粒子的制備及熒光性能

莊慶一， 由芳田， 彭洪尚

(1. 北京交通大學(xué)光電子技術(shù)研究所 發(fā)光與光信息教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100044；

1 引 言

量子點(diǎn)，又可稱為半導(dǎo)體納米晶體，自上世紀(jì)70年代末起就引起了包括物理學(xué)家、材料科學(xué)家、化學(xué)家和電子工程學(xué)家等科研人員的廣泛關(guān)注。與傳統(tǒng)的有機(jī)染料相比，量子點(diǎn)具有窄的半峰寬、覆蓋可見光-近紅外區(qū)域的可調(diào)發(fā)射波長、高的熒光效率和穩(wěn)定性[1-2]，因此在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要的意義，如可用于熒光標(biāo)記、細(xì)胞追蹤、癌癥治療等[3-6]。

量子點(diǎn)的合成方法主要分為水相合成法與油相合成法。1996年，Meller首次在水相中合成了硫醇穩(wěn)定的CdTe量子點(diǎn)[7]。水相合成的量子點(diǎn)表面通常含有巰基配體[8-9]，因此有利于后續(xù)的生物功能化。雖然水相合成的方法簡單、毒性小、成本低，量子點(diǎn)具有良好的親水性和生物兼容性，但其量子效率較低且半峰寬較寬，這極大地限制了其在熒光檢測與成像中的應(yīng)用[10]。相比較而言，在有機(jī)溶劑中利用金屬有機(jī)化學(xué)法可制備高發(fā)光質(zhì)量的量子點(diǎn)，這也是迄今為止最成功的方法[11-14]。該方法的機(jī)理是利用金屬有機(jī)化合物前驅(qū)體在高溫下迅速成核，通過控制體系的反應(yīng)溫度和前驅(qū)體的反應(yīng)量來控制量子點(diǎn)的生長，同時(shí)利用油溶性配體對(duì)量子點(diǎn)表面的吸附來阻止量子點(diǎn)長大，并穩(wěn)定量子點(diǎn)。令人遺憾的是，油相合成的量子點(diǎn)無法直接應(yīng)用于生物標(biāo)記，需采用配體交換[15-16]或者表面包覆(采用二氧化硅[17-19]、高分子[20]等材料)等方案來提高其水溶性和生物兼容性。配體交換法或者表面包覆法不僅大大增加了制備過程的復(fù)雜程度，而且在轉(zhuǎn)到水相后量子點(diǎn)的發(fā)光效率會(huì)明顯降低[21]。因此，發(fā)展一種量子點(diǎn)由油溶轉(zhuǎn)水溶、且保持發(fā)光性能不發(fā)生改變的簡易方法，對(duì)于推進(jìn)量子點(diǎn)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用具有重要的意義。

在之前的研究工作中，我們發(fā)展了一種基于疏水相互作用及硅氧烷水解縮聚反應(yīng)來制備水溶性納米粒子的方法，即再沉淀-包覆法[22]。考慮到量子點(diǎn)為油溶性的特點(diǎn)，這啟發(fā)我們利用上述方法或許可容易實(shí)現(xiàn)對(duì)油溶性量子點(diǎn)的溶解性轉(zhuǎn)變。在本文中，我們首先制備了油溶性、核殼結(jié)構(gòu)的CdSe@ZnS量子點(diǎn)，然后利用再沉淀-包覆法將其包覆到水溶性納米粒子中。所制備的CdSe@ZnS摻雜納米粒子具有小的粒徑(～45 nm)、良好的生物兼容性(表面為多聚賴氨酸殼層，PLL)和高的熒光強(qiáng)度(單個(gè)顆粒內(nèi)包覆數(shù)十個(gè)量子點(diǎn))。將其與腫瘤細(xì)胞培育，可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的多色熒光標(biāo)記。考慮到所發(fā)展的納米粒子制備方法無需復(fù)雜的配體交換和表面修飾步驟，一步即可實(shí)現(xiàn)量子點(diǎn)由油相到水相的轉(zhuǎn)變，因此對(duì)于量子點(diǎn)的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用具有積極的推動(dòng)作用。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 材料與儀器

材料：硬脂酸鎘(CdSt2)、硒粉(Se)、三丁基磷(TBP)、正辛胺、己烷、甲醇、十二烷、油胺、硬脂酸鋅(ZnSt2)、二乙基二硫代氨基甲酸鋅(Zn-(DDTC)2)均購自阿拉丁試劑(上海)有限公司，聚苯乙烯(PS)、多聚賴氨酸(PLL)、十二烷基三甲氧基硅烷(DTS)、四氫呋喃(THF)均購自Sigma-Aldrich。

儀器：采用日立公司型號(hào)為JEM 1400EX透射電子顯微鏡對(duì)納米顆粒進(jìn)行形貌表征；利用馬爾文公司生產(chǎn)的型號(hào)為Nano ZS90的激光粒度儀測試納米顆粒的動(dòng)態(tài)光散射粒徑(DLS)；熒光分析使用的是日立公司生產(chǎn)的型號(hào)為F-4600的熒光光譜儀；熒光衰減采用法國HORIBA Jobin Yvon公司的TCSPC熒光壽命光譜儀測試。

2.2 油溶性CdSe@ZnS量子點(diǎn)的合成

核殼結(jié)構(gòu)CdSe@ZnS量子點(diǎn)的制備采用晶種生長法[23]。以合成紅光量子點(diǎn)為例，在50 mL四口瓶中，CdSt2溶液加熱到250 ℃，將1.2 mL硒懸濁液快速注入到四口瓶中，控制注入硒懸濁液的量和反應(yīng)時(shí)間使量子點(diǎn)的尺寸達(dá)到3 nm(綠光1.2 nm)。在50 ℃的溫度條件下，將三丁基磷和正辛胺分別注入到CdSe量子點(diǎn)的反應(yīng)溶液中攪拌，再將己烷和甲醇混合溶液注入攪拌，完成原位萃取提純，獲得CdSe種子。包覆采用連續(xù)離子吸附生長法，取3 mL十二烷、3 mL油胺和提純過的CdSe溶液混合加入到50 mL四口瓶中，150 ℃下反應(yīng)。Zn(DDTC)2作為包覆1～6層的前驅(qū)體加入，ZnSt2和Zn(DDTC)2作為包覆7～8層的前驅(qū)體加入，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程一直處于氮?dú)獗Ｗo(hù)狀態(tài)。反應(yīng)結(jié)束后對(duì)產(chǎn)物沉淀離心，再分散到THF中。

2.3 CdSe@ZnS摻雜水溶性納米粒子的制備

分別配置PS(2×10-3)、DTS(2×10-3)和CdSe@ZnS量子點(diǎn)(4×10-4)的THF溶液，然后按照50∶46∶4的質(zhì)量比取適量體積混合成總濃度為1×10-3的溶液。用移液槍取200L上述混合溶液，在超聲條件下迅速注入8 mL去離子水中(pH=9，氨水調(diào)節(jié)；含有160g PLL)。靜置2 h后，通入N2以移除THF，即得到CdSe@ZnS摻雜的水溶性熒光納米粒子。

2.4 MTT實(shí)驗(yàn)

將肝癌細(xì)胞(HepG2)均勻接種到96孔板中，每孔5 000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h。細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，在實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度梯度的熒光納米粒子溶液，對(duì)照組只需加入等量的完全培養(yǎng)基。24 h后，每孔中加入20L的MTT溶液(5 mg/mL溶于PBS中)，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，吸走廢液，每孔加入0.15 mL的DMSO溶液。避光條件下，將96孔板放入酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀中振蕩10 min，選擇490 nm波長，檢測每孔中的吸光值。利用公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率(100%)=(實(shí)驗(yàn)組OD平均值/對(duì)照組OD平均值)×100%。

2.5 共聚焦顯微鏡成像實(shí)驗(yàn)

HepG2細(xì)胞在35 mm共焦培養(yǎng)皿中培養(yǎng)1天，細(xì)胞密度為1×105個(gè)，再加入熒光納米粒子溶液培養(yǎng)24 h，之后用PBS洗滌細(xì)胞3次，在激光共聚焦掃描顯微鏡(Nikon Ti-E 全電動(dòng)倒置顯微鏡)下進(jìn)行熒光成像。G-NPs和R-NPs在405 nm波長下激發(fā)，收集波段分別為500～550 nm和580～630 nm。

3 結(jié)果與討論

3.1 CdSe@ZnS量子點(diǎn)的制備與表征

油溶性CdSe@ZnS量子點(diǎn)的制備采用晶種生長法[23]，其合成機(jī)制是先制備CdSe量子點(diǎn)內(nèi)核，然后通過調(diào)整ZnS包覆層的厚度來調(diào)節(jié)量子點(diǎn)的發(fā)射波長。本論文以發(fā)射綠光(G-QDs)和紅光的CdSe@ZnS量子點(diǎn)(R-QDs)為例，包覆的ZnS殼層層數(shù)分別為6層和8層。所制備綠光G-QDs量子點(diǎn)的發(fā)射波長峰值位于529 nm，如圖1(a)右下插圖所示，紅光R-QDs量子點(diǎn)發(fā)射波長為610 nm，如圖1(b)右下插圖所示。 CdSe@ZnS量子點(diǎn)的透射電鏡(TEM)照片如圖1所示。由圖中可以看出，G-QDs量子點(diǎn)的形狀基本為球形，粒徑約為2.5 nm；而隨著包覆層數(shù)的增加，R-QDs量子點(diǎn)增大至～4 nm，且形狀逐漸偏離圓形。量子點(diǎn)形貌變化是外延生長的一個(gè)必然結(jié)果，因?yàn)殡S著ZnS層數(shù)的增加，殼層的體積占整個(gè)量子點(diǎn)體積比逐漸增大，量子點(diǎn)的晶格常數(shù)會(huì)慢慢趨近體相ZnS水平。

圖1 核殼結(jié)構(gòu)CdSe@ZnS量子點(diǎn)的透射電鏡照片。(a)G-QDs;(b)R-QDs。量子點(diǎn)的粒徑統(tǒng)計(jì)見右上插圖，THF中的熒光發(fā)射光譜見右下插圖。

3.2 CdSe@ZnS摻雜水溶性納米粒子的制備與表征

利用再沉淀-包覆法將CdSe@ZnS摻雜到水溶性納米粒子中，實(shí)現(xiàn)CdSe@ZnS量子點(diǎn)由油溶到水溶的轉(zhuǎn)相[22]。其制備原理是：(1)疏水性物質(zhì)因?yàn)榫钟颦h(huán)境由非極性到極性的劇變而發(fā)生聚集，進(jìn)而形成納米粒子；(2)納米粒子中有機(jī)硅氧化在堿性環(huán)境中的快速水解和縮聚而在粒子表面形成SiO2殼層；(3)水溶液中帶正電的PLL分子與納米粒子表面負(fù)電SiO2殼層的吸引而形成PLL外包覆層。圖2(a)為制備的摻雜G-QDs量子點(diǎn)綠光納米粒子(G-NPs)的TEM照片，經(jīng)統(tǒng)計(jì)得到G-NPs的粒徑為50 nm左右，這與動(dòng)態(tài)光散射(DLS)得到的水力學(xué)粒徑也基本相符(圖2(b))。另外，在納米粒子上可以觀察到數(shù)目眾多的黑色小點(diǎn)。由于納米粒子的基質(zhì)主要成分為有機(jī)物(PS，DTS和PLL)，量子點(diǎn)具有更高的電子密度，因此可以斷定其上的黑點(diǎn)即為所摻雜的CdSe@ZnS量子點(diǎn)，即量子點(diǎn)的確摻雜到了水溶性納米粒子內(nèi)。納米基質(zhì)的保護(hù)作用可以大大降低CdSe@ZnS量子點(diǎn)的外泄幾率，因此可減小其生物毒性；同時(shí)，PLL殼層的包覆使得納米粒子具有良好的水溶性和生物兼容性，且表面荷正電的氨基有利于納米粒子通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞[22]。摻雜R-QDs量子點(diǎn)的紅光納米粒子(R-NPs)具有相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在此不再贅述。

圖2 摻雜綠光CdSe@ZnS量子點(diǎn)的納米粒子(G-NPs)。(a)透射電鏡照片，左上插圖為粒徑統(tǒng)計(jì)分布；(b)動(dòng)態(tài)光散射粒徑分布。

圖3為CdSe@ZnS量子點(diǎn)摻雜到納米粒子前后的發(fā)射光譜。由圖中可以看出，量子點(diǎn)在納米粒子中的發(fā)射波長相比于在THF中均發(fā)生了紅移，移動(dòng)距離分別為5 nm(G-QDs)和3 nm(R-QDs)?？紤]到量子點(diǎn)表面原本吸附有機(jī)配體(三丁基膦和油胺)，摻雜到PS-DTS為基質(zhì)的納米粒子后其周圍微環(huán)境的介電常數(shù)變化較小，因此可以忽略介電限域效應(yīng)的影響。我們注意到，在納米粒子內(nèi)CdSe@ZnS量子點(diǎn)是隨機(jī)分布的，如圖2(a)所示，因此當(dāng)相互之間距離足夠近時(shí)則會(huì)通過電偶極-電偶極相互作用而產(chǎn)生能量傳遞。由于量子點(diǎn)本身存在尺寸差異，能量傳遞的結(jié)果是小尺寸量子點(diǎn)(具有短發(fā)射波長)將激發(fā)能傳遞給大尺寸的量子點(diǎn)(具有長發(fā)射波長)，從而使得摻雜納米粒子的整體發(fā)射波長向長波側(cè)移動(dòng)，即發(fā)生紅移[24-25]。此外，由圖3可以看到CdSe@ZnS量子點(diǎn)在摻雜到水溶性納米粒子前后的半峰寬保持不變，表明量子點(diǎn)在納米粒子內(nèi)以單分散的形式存在，沒有發(fā)生聚集。這與通過TEM照片觀察到的結(jié)果也一致。

圖3 CdSe@ZnS量子點(diǎn)在THF(虛線)和納米粒子中(實(shí)線)的熒光發(fā)射光譜。左側(cè)為綠光量子點(diǎn)，右側(cè)為紅光量子點(diǎn)，激發(fā)波長為365 nm。

為進(jìn)一步研究CdSe@ZnS量子點(diǎn)在納米粒子內(nèi)的發(fā)光特性，對(duì)綠光和紅光量子點(diǎn)摻雜到納米粒子前后的熒光強(qiáng)度衰減進(jìn)行了測量，結(jié)果如圖4所示?？梢郧宄乜吹?，量子點(diǎn)在摻雜到納米粒子后熒光強(qiáng)度的衰減速率均加快。對(duì)于THF溶液中量子點(diǎn)的熒光衰減采用雙指數(shù)函數(shù)可得到較好的擬合結(jié)果：

I(t)=A1exp(-t/τ1)+A2exp(-t/τ2)，

(1)

其中，τ1和τ2分別代表量子點(diǎn)中與本征激發(fā)態(tài)和表面缺陷態(tài)相關(guān)的熒光壽命，A1和A2代表不同衰減成分在t=0時(shí)的幅度[26]。而對(duì)于納米粒子中量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度衰減，雙指數(shù)函數(shù)無法得到合理的擬合結(jié)果，須采用三指數(shù)函數(shù)進(jìn)行擬合：

I(t)=A1exp(-t/τ1)+

A2exp(-t/τ2)+A3exp(-t/τ3)，

(2)

其中，τ1和τ2具有與公式(1)中相同的物理意義，τ3則認(rèn)為是與能量傳遞(量子點(diǎn)濃度)相關(guān)的熒光壽命[27]，A1、A2和A3分別代表不同衰減成分在t=0時(shí)的幅度。熒光強(qiáng)度衰減擬合得到的參數(shù)如表1所列，平均壽命τav依據(jù)下列公式計(jì)算得到:

(3)

分析表中擬合數(shù)據(jù)可以得到如下結(jié)論：量子點(diǎn)在摻雜到納米粒子后本征態(tài)短熒光壽命τ1變化不大，然而表面缺陷態(tài)的長壽命τ2卻顯著變短，并且與能量傳遞相關(guān)的熒光壽命τ3具有最長的壽命。顯然，在納米粒子內(nèi)的摻雜并沒有改變量子點(diǎn)內(nèi)激子的本征躍遷速率，因此τ1變化較?。患{米粒子內(nèi)固體基質(zhì)對(duì)量子點(diǎn)表面有機(jī)配體的影響則比較明顯，可能導(dǎo)致與表面態(tài)相關(guān)的無輻射弛豫速率增加，從而引起τ2壽命變短；納米粒子內(nèi)量子點(diǎn)之間相互能量傳遞的結(jié)果，最終使得激發(fā)能或通過本征態(tài)或通過表面態(tài)輻射(或無輻射)弛豫掉，因此壽命τ3顯著慢于τ1和τ2。后兩者共同作用的結(jié)果使得納米粒子的熒光強(qiáng)度的衰減要快于量子點(diǎn)的衰減，即τav(NPs)<τav(QDs)。這也與表1中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

圖4 CdSe@ZnS量子點(diǎn)摻雜到納米粒子前后的熒光強(qiáng)度衰減。(a)綠光量子點(diǎn)；(b)紅光量子點(diǎn)。激發(fā)波長為453 nm，監(jiān)測波長分別為520 nm和609 nm。散點(diǎn)為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，實(shí)線為對(duì)應(yīng)的擬合函數(shù)。

表1 CdSe@ZnS量子點(diǎn)在THF和納米粒子中熒光衰減的雙指數(shù)和三指數(shù)函數(shù)擬合數(shù)據(jù)結(jié)果

3.3 CdSe@ZnS摻雜納米粒子的細(xì)胞毒性與熒光標(biāo)記

由于CdSe@ZnS摻雜納米粒子在保持量子點(diǎn)原有光學(xué)特性的同時(shí)，具有良好的水溶性、穩(wěn)定性、高的熒光強(qiáng)度(單個(gè)粒子內(nèi)摻雜數(shù)目眾多的量子點(diǎn))，因此非常有利于進(jìn)行生物熒光標(biāo)記。在進(jìn)行生物標(biāo)記前首先利用MTT法對(duì)納米粒子的生物毒性進(jìn)行了測試。MTT測試的原理是利用活細(xì)胞線粒體中產(chǎn)生的琥珀酸脫氫酶將MTT還原成不溶于水的甲臜，而死細(xì)胞沒有該功能。利用DMSO將甲臜溶解，測定它在490 nm波長下的吸光度，通過吸光度來評(píng)估細(xì)胞的存活率。以紅色納米粒子(R-NPs)為例，由圖5(a)所示的MTT測試結(jié)果可知，當(dāng)R-NPs的濃度小于30g/mL時(shí)，細(xì)胞活性基本不被抑制。這說明PLL包覆的納米粒子具有良好的生物兼容性，對(duì)細(xì)胞增殖影響小，從而可以忽略摻雜于其中的量子點(diǎn)的細(xì)胞毒性。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中均采用30g/mL的劑量進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

圖5 (a)與不同濃度CdSe@ZnS摻雜納米粒子(R-NPs)孵育后HepG2細(xì)胞的活性，R-NPs的濃度分別為0，10，20，30，40 g/mL；(b)吞噬G-NPs(上)與R-NPs(下)細(xì)胞激光共聚焦顯微鏡照片。共聚焦成像的激發(fā)波長405 nm，綠光和紅光的成像通道分別為500～550 nm和580～630 nm。

隨后對(duì)吞噬了納米粒子的HepG2細(xì)胞進(jìn)行了激光共聚焦掃描成像的研究。分別利用綠光和紅光通道成像，可以清楚地觀察到細(xì)胞內(nèi)G-NPs和R-NPs納米粒子的發(fā)光，如圖5(b)所示。顯然，CdSe@ZnS摻雜納米粒子可以有效地被細(xì)胞吞噬。從圖中可以看出，納米粒子隨機(jī)分布于細(xì)胞質(zhì)以及其他除細(xì)胞核之外的細(xì)胞器中。這主要是由于納米粒子帶正電的PLL殼層與其他生物分子的非特異性吸附所致。此外，由于納米粒子尺寸相對(duì)較大，在細(xì)胞核中觀察不到納米粒子的存在。

4 結(jié) 論

本文報(bào)道了一種用于生物熒光標(biāo)記的CdSe@ZnS量子點(diǎn)摻雜水溶性納米粒子。首先通過高溫注入的方法合成了具有優(yōu)良光學(xué)特性的CdSe@ZnS量子點(diǎn)，其在油相中具有高的熒光強(qiáng)度與穩(wěn)定性。然后采用再沉淀包覆的方法使量子點(diǎn)成功轉(zhuǎn)移到水相中，無需配體交換等繁瑣步驟，且能保持量子點(diǎn)原有的光學(xué)性能。對(duì)量子點(diǎn)摻雜納米粒子的發(fā)光特性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其發(fā)射光譜較摻雜前發(fā)生少量紅移，且熒光壽命縮短。究其原因，認(rèn)為主要是量子點(diǎn)之間能量傳遞的結(jié)果。最后對(duì)其生物毒性和熒光標(biāo)記性能進(jìn)行了研究，證明其具有良好的生物相容性和生物標(biāo)記能力。該工作提供了一種將油溶性量子點(diǎn)轉(zhuǎn)到水相的簡易方法，為拓展量子點(diǎn)在生物標(biāo)記方面的應(yīng)用提供了有益的參考。