解毒消瘰方治療非霍奇金淋巴瘤的療效及對Th17/Treg細(xì)胞水平的影響

許曉娜，張宇，宋巖松，李航超，周郁鴻

非霍奇金淋巴瘤是起源于淋巴造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，主要臨床表現(xiàn)以無痛性淋巴結(jié)腫大為主，根據(jù)臨床特點(diǎn)通常采取不同的治療策略，主要是大劑量化療聯(lián)合自體造血干細(xì)胞移植，但仍有部分患者原發(fā)耐藥或遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)[1]。筆者采用解毒消瘰方聯(lián)合化療治療非霍奇金淋巴瘤，取得了良好療效，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理活檢證實(shí)為惡性淋巴瘤的初治患者，按2008年WHO淋巴瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類，按AnnArbor標(biāo)準(zhǔn)分期，按IPI評分系統(tǒng)評價(jià)危險(xiǎn)度[2]，性別不限，年齡18～75歲，患者預(yù)計(jì)生存期≥3個(gè)月。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并嚴(yán)重心血管、肝、腎、造血系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)疾病、精神病患者；（2）有嚴(yán)重不可控制的感染、出血等癥狀的患者；（3）妊娠或哺乳期婦女，對本試驗(yàn)處方組成過敏者；（4）其他引起Th17/Treg細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子異常的疾病。

1.2 一般資料 選取2011年7月至2016年7月浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院收治的患者60例，依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表分為治療組及對照組，各30例。治療組男15例，女15例；年齡19～73歲，中位年齡42歲；病理分型：濾泡型5例，彌漫大B型21例，套細(xì)胞型3例，伯基特型1例；Ann Arbor分期：I期5例，II期10例，III期8例，IV期7例；按IPI評分：低危組8例，中低危組13例，中高危組5例，高危組4例。對照組男18例，女12例；年齡25～75歲，中位年齡43歲；病理分型：濾泡型4例，彌漫大B型23例，套細(xì)胞型胞型2例，伯基特型1例。Ann Arbor分期：I期6例，II期11例，III期7例，IV期6例。按IPI評分：低危組5例，中低危組10例，中高危組8例，高危組7例。兩組上述資料差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），具有可比性。

1.3 治療方法

1.3.1 對照組 根據(jù)2016NCCN指南選擇不同病理類型非霍奇金淋巴瘤的化療方案，連續(xù)進(jìn)行4個(gè)療程[2]。

1.3.2 治療組 在對照組基礎(chǔ)上聯(lián)合解毒消瘰方，方含：蛇六谷、紫菀、半枝蓮、藤梨根、桔梗、前胡、茯苓、白術(shù)、山海螺和蛇莓，每天1劑，早晚分服，3周為1個(gè)療程，連續(xù)服用4個(gè)療程。

1.3.3 支持治療 治療期間若中性粒細(xì)胞＜1.0×109/L，則給予粒細(xì)胞集落刺激因子（75g，惠爾血，日本麒麟鯤鵬）5～10g/kg皮下注射，每天1次，直至中性粒細(xì)胞＞1×109/L；治療期間有粒缺和/或發(fā)熱患者，預(yù)防性或根據(jù)藥敏試驗(yàn)和經(jīng)驗(yàn)性給予抗生素治療；化療期間常規(guī)給予止吐處理。

1.3.4 隨癥加減 兼往來寒熱者，為肝膽有熱：加柴胡10g、炒梔子6g、丹皮10g；兼胸脅滿痛者，為氣郁重：加青皮10g、厚樸6g；兼倦怠乏力，為正氣虧虛：加炙黃芪15 g、生曬參6 g；兼潮熱盜汗，為陰虧：加麥冬12 g，沙參12 g。

1.4 檢測方法 （1）Treg細(xì)胞檢測：取2支流式試管，做好標(biāo)記，分別取100l肝素鈉抗凝全血加入每支試管，然后依次加入20l同型對照（鼠IgG1/IgG2a）及抗CD4、CD25熒光單克隆抗體各10l，室溫避光保存20 min。取出試管，每管加入10倍稀釋了的1×紅細(xì)胞裂解液2ml，渦旋混勻，室溫避光10min。3000r/min離心5 min，棄上清。每管加入磷酸鹽緩沖液（PBS）2ml，渦旋混勻，離心后棄去上清液，最后加入PBS液0.5ml混勻。4℃避光1h內(nèi)上機(jī)檢測。使用流式細(xì)胞分析儀進(jìn)行檢測，按規(guī)程操作。（2）Th17細(xì)胞檢測：采用常規(guī)密度梯度離心法獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），接種于培養(yǎng)板后加佛波酯（PMA）50g/L，離子霉素1mol/L，莫能霉素500g/L，在37℃、5%CO2溫箱中孵育培養(yǎng)6h。收集細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/ml。取2支試管，做好標(biāo)記，對應(yīng)每管加細(xì)胞懸液100l，隨后加入CD4-FITC10l，混勻后室溫下避光反應(yīng)20min。取出試管，PBS洗滌2次，加入固定液100l室溫避光固定反應(yīng)20min。離心棄上清液，PBS洗滌2次，加入破膜劑50l進(jìn)行細(xì)胞打孔，室溫避光固定反應(yīng)20min。離心棄上清液后測定管加入IL-17 A-PE 10l，對照管加入IgG1-PE 10l，室溫下避光反應(yīng)20min，PBS洗滌2次后上流式細(xì)胞儀檢測。（3）血清TGF-1、IL-17檢測：取患者EDTA抗凝靜脈血5 ml，3000 r/min離心30 min取上清。用間接酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒檢測，操作流程以相應(yīng)試劑盒說明書為準(zhǔn)。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 近期療效[3]完全緩解（CR），腫瘤消失并至少維持4周以上；部分緩解（PR），腫塊縮?。?0%，并維持4周以上；穩(wěn)定（SD），腫塊縮?。?0%或增大＜25%，無新病灶出現(xiàn)；進(jìn)展（PD），腫塊增大＞25%或有新病灶出現(xiàn)；總緩解率=CR+PR。

1.5.2 Th17/Treg細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子比較 治療組及對照組血清Treg、Th17細(xì)胞百分率，血清TGF-1、IL-17水平變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。計(jì)數(shù)資料比較采用2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 近期療效 治療組與對照組總緩解率分別為86.67%和83.33%，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2=0.131＞ 0.05），見表 1。

2.2 外周血Treg、Th17細(xì)胞百分率比較 治療組外周血Treg細(xì)胞百分率低于對照組，Th17細(xì)胞百分率高于對照組（均＜0.05），見表2。治療組血清TGF-1低于對照組，IL-17水平高于對照組（均＜ 0.05），見表 3。

3 討論

研究表明，誘發(fā)非霍奇金淋巴瘤的獨(dú)立危險(xiǎn)因素是機(jī)體免疫缺陷及慢性炎性反應(yīng)[4]。Th17和Treg細(xì)胞為初始CD+4T細(xì)胞分化的不同T細(xì)胞亞群，在機(jī)體免疫級聯(lián)反應(yīng)及炎性反應(yīng)中起十分重要作用[5]。Th17細(xì)胞存在明顯抗腫瘤作用[6]；而Treg細(xì)胞則以“主動”方式使機(jī)體免疫功能抑制[7]。全麗娜等[8]研究顯示，B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤患者淋巴結(jié)組織內(nèi)Th17細(xì)胞比例顯著低于良性淋巴結(jié)。由此得出Treg細(xì)胞增加可能導(dǎo)致非霍奇金淋巴瘤患者機(jī)體免疫抑制，Th17細(xì)胞減少導(dǎo)致機(jī)體抗腫瘤機(jī)制減弱，從而易于腫瘤免疫逃逸。Th細(xì)胞分化的關(guān)鍵因子是TGF-1，其表達(dá)水平與Treg和Th17分化密切相關(guān)。Th17細(xì)胞分泌最具特征性細(xì)胞因子就是IL-17，它具有很強(qiáng)的促炎癥作用，內(nèi)源性IL-17還可能對腫瘤免疫方面發(fā)揮保護(hù)性作用。解毒消瘰方可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，進(jìn)而提高Th17及IL-17水平，抑制Treg細(xì)胞及TGF-1水平?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對該病的治療措施主要包括放化療。雖然大部分患者能緩解或者得到治愈；但對于部分淋巴瘤患者療效仍不理想，出現(xiàn)復(fù)發(fā)耐藥，病情發(fā)展可致死亡。

表1 兩組近期療效比較 例

表2 兩組外周血Treg、Th17細(xì)胞百分率比較 %

表3 兩組血清TGF-1、IL-17水平比較 pg/ml

非霍奇金淋巴瘤以無痛性淋巴結(jié)腫大為主，祖國醫(yī)學(xué)并無非霍奇金淋巴瘤的記載，本病根據(jù)臨床癥狀歸屬中醫(yī)“瘰癘”、“石疽”、“瘤病”、“惡核”、“痰核”等范疇。中醫(yī)在調(diào)節(jié)免疫的同時(shí)能增加化療的效果并且減輕放化療的毒副作用[9]。研古通今，結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為：此病本虛標(biāo)實(shí)，發(fā)病的根本是正氣虧虛，正所謂“正氣不足而后邪氣踞之”。淋巴瘤發(fā)病的重要病因是“毒”，毒分內(nèi)外，外感之“疫毒”、“溫毒”等稱之為外毒；陰陽平衡失司、五臟六腑功能紊亂而滋生出的“痰毒”、“瘀毒”、“火毒”等稱之為內(nèi)毒。根據(jù)其病因病機(jī)及臨床表現(xiàn)自創(chuàng)了“解毒消瘰方”，方中蛇六谷化痰軟堅(jiān)、散結(jié)解毒，聯(lián)合紫菀解“痰毒”；半枝蓮辛苦寒，可清熱解毒、消腫止痛，聯(lián)合藤梨根解外邪毒；桔梗行氣散瘀消積、散瘀解毒，聯(lián)合前胡、蛇莓解“瘀毒”；山海螺益氣養(yǎng)陰清內(nèi)熱解“火毒”，茯苓、白術(shù)匡扶正氣，以扶正驅(qū)邪。全方解外感之邪毒，驅(qū)內(nèi)在之痰瘀火毒，并扶住正氣，使正氣升邪毒乃去。有現(xiàn)代研究表明：紫菀、半枝蓮、山海螺、前胡有抑瘤及抗腫瘤活性；蛇六谷對部分癌細(xì)胞敏感并對白血病細(xì)胞有抑制作用。

本研究提示，非霍奇金淋巴瘤使用解毒消瘰方后在總緩解率方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），這可能由于觀察時(shí)間相對較短，但中醫(yī)發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫的時(shí)間較長有關(guān)。此研究數(shù)據(jù)表示治療組外周血Treg細(xì)胞百分率、血清TGF-1較對照組顯著降低，Th17細(xì)胞百分及IL-17水平顯著升高，表明非霍奇金淋巴瘤患者外周血Treg、Th17細(xì)胞比例及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平異常，監(jiān)測外周血Th17/Treg免疫平衡對NHL預(yù)后判定可能有重要意義。