膽堿能抗炎通路在病毒性心肌炎中的抗炎作用及其機(jī)制

陳學(xué)思，張麗梅，蔡敏敏

目前病毒性心肌炎的治療僅限于以對癥支持保守治療，并無有效的針對病因治療。雖大部分患者經(jīng)適當(dāng)治療可完全恢復(fù)，但少部分患者轉(zhuǎn)變?yōu)槁孕呐K病，最終發(fā)展為非特異性擴(kuò)張性心肌病[1-2]。最近研究發(fā)現(xiàn)，迷走神經(jīng)及其遞質(zhì)乙酰膽堿（ACh）所構(gòu)成的膽堿能抗炎通路（CAP）對炎癥反應(yīng)的調(diào)控具有重要的作用[3]。當(dāng)機(jī)體受到損傷后，產(chǎn)生一系列炎癥反應(yīng)，中樞接受到機(jī)體受到這種刺激信號(hào)后，將信息投射到迷走神經(jīng)核團(tuán)，激活傳出迷走神經(jīng)纖維，使外周神經(jīng)末梢釋放ACH，與免疫細(xì)胞7-nACh受體結(jié)合，通過細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制促炎因子的釋放，調(diào)控炎癥反應(yīng)[4-5]。這類炎癥因子包括IL-1、TNF-、IL-6 及 IL-17[6-7]；而對 IL-10、TGF-等抗炎因子沒有抑制作用[8]。然而CAP在病毒心肌炎中的作用尚不明確，本研究以CVB3感染BALB/C小鼠建立病毒性心肌炎模型，通過切斷右側(cè)迷走神經(jīng)及煙堿等不同處理，觀察心肌炎癥浸潤程度、炎癥因子TNF-、INF、IL-1 、IL-6及相關(guān)通道蛋白STAT3和磷酸化STAT3表達(dá)變化，探討CAP在病毒性心肌炎中的作用及其機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇和分組 健康雄性3周齡BALB/C小鼠200只，將BALB/C小鼠隨機(jī)分為5組：（1）正常對照組（n=40）：腹腔予注射不含病毒的病毒培養(yǎng)液；（2）假手術(shù)組（n=40）：分離右側(cè)迷走神經(jīng)，腹腔予注射CVB3病毒；（3）煙堿組（n=40）：腹腔注射CVB3 病毒，后每天腹腔予注射煙堿；（4）迷走神經(jīng)切斷+煙堿組：分離并切除右側(cè)迷走神經(jīng)，腹腔予注射CVB3病毒，后每天腹腔予注射煙堿；（5）迷走神經(jīng)切斷組（n=40）：分離并切除右側(cè)迷走神經(jīng)，腹腔予注射CVB3病毒。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立 將各實(shí)驗(yàn)處理組術(shù)前禁食8h，假手術(shù)組僅做迷走神經(jīng)分離，迷走神經(jīng)切斷組及迷走神經(jīng)切斷+煙堿組迷走神經(jīng)分離后予離斷，待小鼠飼養(yǎng)至4周齡后，正常對照組腹腔注射不含病毒的Eagel’s病毒培養(yǎng)液0.1ml，其余4組予腹腔注射100TCID 50/0.1 ml的CVB3稀釋液0.1 ml，接種當(dāng)天記為第0天，從第1天開始煙堿組及迷走神經(jīng)切斷組+煙堿組予煙堿腹腔注射處理（1.2 mg/kg，每天分3次注射），直至第14天末。

1.3 生存率 注射病毒當(dāng)天為第0天，5組實(shí)驗(yàn)組每組隨機(jī)選取20只小鼠進(jìn)行一般情況及生存情況觀察研究，觀察各實(shí)驗(yàn)組小鼠生存率。

1.4 標(biāo)本留取 5組實(shí)驗(yàn)組在接種第0天，分別取2只小鼠處死（留取ELISA用），第7和14天，分別取8只小鼠處死后，分離心臟備用。

1.5 病理組織學(xué)檢查 心臟組織固定、脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋后切片，再將切片進(jìn)行HE染色后在電子顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞排列及形態(tài)、心肌組織損傷、壞死、纖維化及炎性細(xì)胞浸潤程度，以心肌炎癥浸潤（I）及心肌壞死（N）進(jìn)行評(píng)分。

1.6 Western blot檢測 5組心臟組織分別加入組織裂解液，冰上勻漿，超聲破碎，4℃下12 000 r/min離心15 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度。取50g蛋白上樣，電泳、蛋白轉(zhuǎn)膜、抗體結(jié)合后，加ECL化學(xué)發(fā)光反應(yīng)2min，采用AlhaimagerTM2200圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行處理，AlphaEase40軟件進(jìn)行分析。

1.7 雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測 取5組心臟組織研磨成10%勻漿液體，超聲破碎細(xì)胞，4℃下3000 r/min

低速離心20min，取上清液，按說明書要求準(zhǔn)備試劑后，對各組標(biāo)本進(jìn)行檢測，按照標(biāo)準(zhǔn)品OD值在半對數(shù)紙上作圖，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)本OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線圖上查出相應(yīng)待測炎癥因子的含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率表示，采用2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生存率 正常對照組小鼠第14天無死亡，生存率為100%；假手術(shù)組小鼠第14天的生存率為45%（18/40），煙堿組小鼠生存率為80%（32/40），迷走神經(jīng)切斷+煙堿組小鼠生存率為70%（28/40），迷走神經(jīng)切斷組小鼠生存率35%（14/40）。以注射病毒記為第0天，其死亡高峰在第6天到第10天，且煙堿組生存率高于假手術(shù)組（2=10.5，P＜0.05），迷走神經(jīng)切斷+煙堿組生存率高于迷走神經(jīng)切斷組（2=9.8，P＜ 0.05）。

2.2 心肌組織病理變化 光鏡下第7、14天，與假手術(shù)組相比，煙堿組及迷走神經(jīng)切除+煙堿組的心肌組織炎癥浸潤及壞死減輕（t≥2.74，P＜0.05），而迷走神經(jīng)切斷組的心肌組織炎癥浸潤及壞死加重（t≥14.20，P＜0.05）；與迷走神經(jīng)切斷+煙堿組比較，迷走神經(jīng)切除組心肌組織炎癥浸潤及壞死加重（t≥25.81，P＜0.05）。正常對照組心肌沒有病理變化。見表1。

2.3 WB檢測小鼠心肌信號(hào)蛋白表達(dá)水平

2.3.1 p-STAT3表達(dá)水平測定 在第7天，4組實(shí)驗(yàn)處理組小鼠心肌較正常對照組p-STAT3表達(dá)均升高（t≥10.95，均P＜0.05），且煙堿組小鼠心肌表達(dá)低于假手術(shù)組（t=21.71，P＜0.05），迷走切斷+煙堿組及假手術(shù)組小鼠心肌表達(dá)均低于迷走切斷組（t≥21.34，均P＜0.05）；在第14天，5組實(shí)驗(yàn)組小鼠心肌p-STAT3表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.64，P＞0.05）。見表2。

2.4 ELISA法檢測心肌炎癥因子 在第7天和第14天，與正常對照組比較，4組實(shí)驗(yàn)處理組TNF-、INF、IL-1 、IL-6炎癥因子均升高（t≥7.46，均P＜0.05）；與假手術(shù)組比較，煙堿組TNF-、INF、IL-1 、IL-6炎癥因子均下降（t≥10.55，均P＜0.05），而迷走切斷組均升高（t≥10.69，均P＜0.05）；與迷走神經(jīng)切斷組比較，迷走神經(jīng)切斷+煙堿組TNF-、INF、IL-1 、IL-6炎癥因子均下降（t≥11.72，均P＜0.05）。見表4。

表1 各組小鼠第7、14天心肌組織病理評(píng)分比較 分

表2 各組小鼠第7天、14天心肌組織p-STAT3表達(dá)水平

表3 各組小鼠第7天、14天心肌組織 7nAChR表達(dá)水平

3 討論

2000年，Borovikova等[7]通過人外周血巨噬細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，刺激外周迷走神經(jīng)或其遞質(zhì)ACh能夠抑制炎癥性細(xì)胞釋放炎癥因子，減輕全身炎癥反應(yīng)，并將其命名為“CAP”。Wang等[9]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，對敲除7亞基基因小鼠刺激迷走神經(jīng)，這種炎癥抑制作用不會(huì)發(fā)生，確定了7煙堿型乙酰膽堿受體（7nAChR）在CAP中起關(guān)鍵作用。迷走神經(jīng)不僅通過特有的中樞神經(jīng)細(xì)胞7nAChR發(fā)揮抗炎作用，還用于巨噬細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞等免疫細(xì)胞7nAChR[10-11]，信號(hào)遞質(zhì)ACh作用于人巨噬細(xì)胞減少了TNF-、IL-1 、IL-6、IL-18等促炎因子的產(chǎn)生[12]。然而研究證實(shí)，煙堿作為7nAChR特異性激動(dòng)劑，與ACh相比能更有效的抑制巨噬細(xì)胞促炎因子的產(chǎn)生[13]。7nAChR介導(dǎo)的抗炎作用通過影響核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB，同時(shí)JAK2/STAT3通路也參與了其中[14]；已經(jīng)充分證實(shí)激活CAP可以減輕炎癥反應(yīng)，改善膿毒血癥、內(nèi)毒素血癥、缺血再灌注損傷、失血性休克、胰腺炎、關(guān)節(jié)炎及其他炎癥反應(yīng)綜合癥的預(yù)后。也有研究證實(shí)了用煙堿激活 CAP可以減輕自身免疫性心肌炎的炎癥，但是CAP在急性病毒性心肌炎中的作用研究尚不足。

表4 各組小鼠第7天、14天心肌組織炎癥因子表達(dá)水平 pg/ml

本研究通過煙堿和切斷右側(cè)迷走神經(jīng)等不同處理，觀察病毒性心肌炎小鼠的生存率、心肌病理組織改變及心肌炎癥因子表達(dá)變化等來探討 CAP在病毒性心肌炎的作用。研究發(fā)現(xiàn)選擇7nAChR特異性激動(dòng)劑煙堿激活CAP，可減輕心肌炎小鼠心肌的病理損傷和炎癥浸潤，提高小鼠的生存率。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，第7和14天，小鼠心肌的TNF-、INF、IL-1 、IL-6炎癥因子表達(dá)均下調(diào)（均P＜0.05）。而切斷右側(cè)迷走神經(jīng)拮抗CAP，加重了小鼠心肌病理損傷和炎癥浸潤，降低了小鼠的生存率；且在第7和14天，小鼠心肌的TNF-、INF、IL-1及IL-6炎癥因子表達(dá)均較假手術(shù)組上調(diào)（均P＜0.05）。同時(shí)與迷走神經(jīng)切除組比較，切斷右側(cè)迷走神經(jīng)+煙堿其心肌病理組織損傷及炎癥浸潤減輕，TNF-、INF、IL-1及IL-6炎癥因子的表達(dá)均下調(diào)（均P＜0.05）。因此筆者推測煙堿對病毒性心肌炎具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能為煙堿作用與巨噬細(xì)胞7nAChR抑制TNF-、INF、IL-1及IL-6炎癥因子表達(dá)；迷走神經(jīng)參與了膽堿能抗炎的作用通路，切斷右側(cè)迷走神經(jīng) CAP的保護(hù)作用減弱。與正常對照組比較，假手術(shù)組、煙堿組、迷走神經(jīng)切斷＋煙堿組、迷走神經(jīng)切斷組STAT3的磷酸化水平升高（P＜0.05），提示JAK/STAT3通路STAT3磷酸化參與了炎癥反應(yīng)；在第7天，與假手術(shù)組比較，煙堿組STAT3磷酸化水平降低，而迷走神經(jīng)切斷組STAT3磷酸化水平增高。因此筆者推斷煙堿激動(dòng)7nAChR可能通過抑制JAK2/STAT3通路STAT3磷酸化參與炎癥保護(hù)作用。