長(zhǎng)鏈非編碼RNA GHET1在肝癌肝移植組織中表達(dá)上調(diào)對(duì)患者預(yù)后的影響

張揚(yáng)平 柯瑞盛 ，王華翔 ，鄧橋 ，蔡秋程 ，楊芳 ，，張坤 ，，江藝 ，，呂立志 ，

（1. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬閩東醫(yī)院，福建，寧德 355000； 2.福建醫(yī)科大學(xué)，福州總醫(yī)院，福建 福州 350025；3.廈門大學(xué)附屬東方醫(yī)院，福建 福州 350025；4.中國(guó)人民解放軍福州總醫(yī)院，福建 福州 350025）

肝移植（liver transplantation，LT）是目前最主要的原發(fā)性肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）治療手段之一［1］，移植后預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移仍是肝癌肝移植研究熱點(diǎn)［2］，嚴(yán)重制約了患者的長(zhǎng)期生存［3］。腫瘤復(fù)發(fā)除了與腫瘤的臨床特征、術(shù)后治療藥物的使用等因素相關(guān)外，還與腫瘤本身的生物學(xué)行為關(guān)系密切，涉及多個(gè)基因產(chǎn)物參與［4］。面對(duì)供肝來源緊缺的現(xiàn)狀，在術(shù)前預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)高?；颊咭試?yán)格掌握手術(shù)指征，顯得極為迫切［5］， 長(zhǎng)鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸的內(nèi)源性細(xì)胞 RNA，雖缺乏開放閱讀框，但可通過表觀遺傳，轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)蛋白的編碼基因，可以在生理過程中發(fā)揮核心作用［6-7］。研究證實(shí)異常的 lncRNA 表達(dá)跟許多疾病相關(guān)［8-9］，其在惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制已經(jīng)逐漸被人們所關(guān)注。GHET1基因被歸類為lncRNA ，lncRNA GHET1在胃癌顯著上調(diào)，被認(rèn)為是胃癌特異性lncRNA之一［10］。目前GHET1和肝癌肝移植之間的關(guān)系以及GHET1在肝癌肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)中的功能作用研究相對(duì)較少。本研究旨在檢測(cè)GHET1在HCC組織中的表達(dá)情況，同時(shí)分析其表達(dá)與肝癌肝移植患者臨床病理特征和預(yù)后關(guān)系，為腫瘤的早期干預(yù)和個(gè)性化治療提供新的治療靶點(diǎn)和防治思路。

1 材料與方法

1.1 一般資料：收集福建醫(yī)科大學(xué)福州總醫(yī)院肝膽外科HCC手術(shù)患者的HCC組織和配對(duì)的2 cm 處正常組織（n＝20），實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測(cè)組織中的GHET1表達(dá)?；仡櫺允占?010年1月— 2015年12月106例同種異體原位肝癌肝移植患者的HCC組織和相應(yīng)臨床病理資料，qRT-PCR檢測(cè)組織中GHET1的RNA表達(dá)水平（所有組織均在術(shù)中采集后存放于-80℃超低溫冰箱）。所有患者術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)均為原發(fā)性肝癌。本研究采取雙盲方法，本課題入組前均先征得患者及家屬的知情同意，并于福州總醫(yī)院倫理委員會(huì)處備案并批準(zhǔn)實(shí)施。入組標(biāo)準(zhǔn)： ① 具有乙肝病毒感染背景；② 術(shù)前未行任何抗肝腫瘤相關(guān)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)： 術(shù)后3 個(gè)月內(nèi)因嚴(yán)重并發(fā)癥而死亡者。手術(shù)方法：采用原位經(jīng)典肝移植加經(jīng)下腔靜脈逆灌注。106例患者的供體來源為司法途徑供肝（81例，76.42%）和公民死亡器官捐獻(xiàn)供肝（25例，23.58%）?？挂腋尾《緩?fù)發(fā)方案為：恩替卡韋和乙型肝炎人免疫球蛋白聯(lián)用。術(shù)后免疫抑制劑使用：術(shù)后免疫抑制方案常規(guī)采用激素+他可莫司+嗎替麥考酚酯。106例肝癌肝移植患者的臨床參數(shù)見表1。

表 1 GHET1 的陽性表達(dá)與肝癌肝移植臨床參數(shù)的相關(guān)性

1.2 隨訪：隨訪截止至2017年12月，主要通過電話和門診復(fù)查等方式對(duì)患者進(jìn)行隨訪，詳細(xì)記錄患者術(shù)后的無瘤生存時(shí)間、腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)間、腫瘤復(fù)發(fā)部位、患者死亡時(shí)間等（均以月為單位），將1 年內(nèi)未到門診隨訪或電話無回音者視為失訪。

1.3 主要試劑：Trizol試劑、real-time PCR SYBR Green試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司。內(nèi)參GAPDH、目的基因lncRNA GHETl均由上海英駿（Invitrogen）公司設(shè)計(jì)合成，引物序列如下：GAPDH F：5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'和R：5'-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3'；GHET1 F：5'-GAACAAAGCAGGTAAACATTGG-3'和 R：5'-GCAAAGGCAGAGTGAAAGGT-3'。

1.4 RNA提取和qRT-PCR檢測(cè)：按Trizol試劑說明書提取組織中的RNA，應(yīng)用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA的第一鏈，按照SYBR Green試劑盒說明書操作，基因定量經(jīng)LightCycler 480 PCR儀測(cè)定，每個(gè)樣本3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次，最終數(shù)據(jù)以2-△△Ct進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析：采用SPSS23.0軟件和GraphPad Prism5.0軟件處理，通過t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。GHET1表達(dá)水平與其他因素的相關(guān)性采用卡方檢驗(yàn)或獨(dú)立t檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier方法計(jì)算患者生存期，根據(jù)術(shù)后隨訪結(jié)果計(jì)算患者總生存期。組間生存期比較則采用秩和檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝ 0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肝癌肝移植患者隨訪結(jié)果：所有患者均獲得隨訪。本組患者平均年齡為（49.60±11.40）歲，腫瘤平均直徑6.0 cm（4.0～17.0 cm）。截止至2017年12月，106例肝癌肝移植患者隨訪時(shí)間3～96個(gè)月，中位隨訪時(shí)間35個(gè)月，5年總累積生存率為18.87 %（20例），隨訪期間共有50例（復(fù)發(fā)率46.17 %）腫瘤復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)時(shí)間為術(shù)后2～55個(gè)月，中位時(shí)間14個(gè)月。復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移部位依次是肺26例（52.00 %）、肝22例（44.00 %）、骨8例（16.00 %）、腦6例（12.00 %）、腹腔1例（2.00 %）、腹膜3例（6.00 %）、胸膜2例（4.00 %）、膈2例（4.00 %）、縱隔1例 （2.00 %）、腎上腺1例 （2.00 %）、胰1例（2.00 %）。

2.2 肝癌肝移植組織中GHET1表達(dá)檢測(cè)及與肝癌復(fù)發(fā)的關(guān)系：qRT-PCR檢測(cè)20對(duì)肝癌及相對(duì)應(yīng)癌旁組織中mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，GHET1在HCC組織中明顯高于配對(duì)的鄰近非腫瘤組織（圖1A），提示在肝癌組織中GHET1表達(dá)水平增高（P＜0.001）。將106例肝癌肝移植患者分成肝癌復(fù)發(fā)組（n＝50）和肝癌未復(fù)發(fā)組（n＝56），與肝癌未復(fù)發(fā)組相比，復(fù)發(fā)組GHET1表達(dá)明顯升高（P＜0.001），見圖1B，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果表明GHET1表達(dá)與術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)具有相關(guān)性。

圖1 a：HCC組織和鄰近非腫瘤組織GHET1表達(dá)檢測(cè)；b：實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)106例肝癌肝移植組織中 GHET1表達(dá)及與肝癌復(fù)發(fā)關(guān)系，aP＜0.001， n＝20

2.3 GHET1表達(dá)與HCC患者臨床病理學(xué)特征關(guān)系：本研究結(jié)果表明GHET1表達(dá)與腫瘤包膜（P ＜0.001）、腫瘤直徑（P＜0.01）、分化程度（P＜0.01）、血管侵犯（P＜0.01）和TNM分期（P＜0.01）密切相關(guān)，而與患者的年齡、性別、肝硬化、AFP水平、血清NLR值、腫瘤位置和腫瘤數(shù)量無關(guān)（P＞0.05），見表1。

2.4 GHET1表達(dá)與肝癌肝移植患者疾病預(yù)后：根據(jù)106例患者肝癌肝移植組織標(biāo)本GHET1表達(dá)檢測(cè)的中位值（中位值＝4.939），將其分為低表達(dá)組（53例）和高表達(dá)組（53例），對(duì)患者的生存預(yù)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果提示GHET1高表達(dá)組累積復(fù)發(fā)率顯著高于低表達(dá)組（P＜0.05），GHET1高表達(dá)組累積生存率顯著低于低表達(dá)組（P＜0.001），提示在肝癌肝移植術(shù)后發(fā)生發(fā)展的過程中GHET1起著一定的作用，可用于判斷患者的預(yù)后（圖2）。兩組肝癌肝移植患者1、3、5年累積復(fù)發(fā)及生存情況見表2。

圖 2 GHET1不同表達(dá)與肝癌肝移植患者累計(jì)術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率和累計(jì)術(shù)后生存率的關(guān)系

3 討 論

對(duì)于肝癌肝移植患者而言，預(yù)防肝移植術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)仍然是患者術(shù)后能否長(zhǎng)期生存率的關(guān)鍵問題。因此，在肝癌肝移植術(shù)前能預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)高危患者并以嚴(yán)格掌握手術(shù)指征，顯得極為重要［5，12］。甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）作為一種生化標(biāo)志，在肝癌的鑒別、早期診斷及治療中扮演著重要角色［13］。但約30%肝癌患者的AFP為陰性，而且這類患者近年來更加常見［14］，發(fā)現(xiàn)其他敏感腫瘤生化標(biāo)志，并進(jìn)一步研究其分子機(jī)制，對(duì)于AFP陰性肝癌患者尤其具有重要意義［14］。因此，需要綜合的方法來確定和驗(yàn)證新的腫瘤標(biāo)志物，并找到更有效的治療策略來改善HCC診斷、預(yù)后及治療。

表2 兩組肝癌肝移植患者 1、3、5年累積復(fù)發(fā)和累積生存情況比較

LncRNA能夠調(diào)節(jié)不同層次基因表達(dá)，包括染色質(zhì)、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾和翻譯［15］。研究結(jié)果表明，許多l(xiāng)ncRNA在HCC中有差異表達(dá)，這些lncRNA的失調(diào)與HCC進(jìn)展相關(guān)，可能作為HCC診斷和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。lncRNA可能通過結(jié)合啟動(dòng)子區(qū)域和/或改變組蛋白標(biāo)記和染色質(zhì)狀態(tài)來調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄［16］。另外，它們可能與蛋白質(zhì)的相互作用和改變相關(guān)，對(duì)癌癥生物學(xué)具有重要作用［17］。之前的研究中發(fā)現(xiàn)位于染色質(zhì)第7基因間區(qū)域的GHET1通過上述機(jī)制發(fā)揮其作用［10］。

目前，已知 GHET1與結(jié)直腸癌［18］、胃癌［10］及膀胱癌［19］的發(fā)生相關(guān)，并作為與腫瘤增殖和侵襲密切相關(guān)的癌基因，與腫瘤預(yù)后相關(guān)。在一項(xiàng)研究中，證實(shí)GHET1在HCC組織和細(xì)胞系中的上調(diào)部分是由其啟動(dòng)子的H3K27Ac乙?；降脑黾铀閷?dǎo)的，GHET1并可通過ATF1調(diào)節(jié)HCC細(xì)胞的增殖和侵襲［20］。另一項(xiàng)研究認(rèn)為GHET1是一種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，敲低GHET1可抑制HCC的細(xì)胞增殖，并且還引起細(xì)胞周期停滯誘導(dǎo)HCC細(xì)胞凋亡，GHET1可以通過募集PRC2到KLF2啟動(dòng)子區(qū)域，調(diào)節(jié)Kruppel樣因子2 （KLF2） 在HCC細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄［21］。

在本研究中，我們檢測(cè)了GHET1在肝癌組織和周圍正常肝組織中的表達(dá)。我們的研究結(jié)果表明，與鄰近的正常肝組織相比，GHET1在肝癌組織中上調(diào)，并且GHET1上調(diào)與腫瘤包膜、腫瘤直徑、分化程度、血管侵犯和TNM分期密切相關(guān)，而與患者的年齡、性別、肝硬化、血清AFP水平、血清NLR值、實(shí)體瘤位置和實(shí)體瘤數(shù)量無關(guān)。同時(shí)比較兩組實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)GHET1表達(dá)量及與肝癌復(fù)發(fā)關(guān)系，結(jié)果表明GHET1表達(dá)與有無肝癌復(fù)發(fā)具有相關(guān)性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究結(jié)果同時(shí)也提示GHET1過表達(dá)肝癌肝移植患者累積復(fù)發(fā)率顯著高于低表達(dá)患者（P＜0.05），GHET1過表達(dá)肝癌肝移植患者累積生存率顯著低于低表達(dá)患者（P＜0.001），提示肝癌組織中GHET1異常高表達(dá)者可能具有復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的潛在風(fēng)險(xiǎn)，說明GHET1可能在肝癌發(fā)生發(fā)展及肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)均具有一定的作用，可能作為肝癌肝移植患者中診斷和預(yù)后的候選生物標(biāo)志物。

然而，由于本研究為單中心回顧性研究，上述結(jié)論仍需大樣本和多中心臨床研究進(jìn)一步證實(shí)。但本研究仍證明GHET1在肝癌中的表達(dá)上調(diào)，與肝移植術(shù)后肝癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)。目前GHET1在肝癌肝移植復(fù)發(fā)中的調(diào)控尚未明確，有待進(jìn)一步研究。

利益沖突：所有作者聲明沒有利益沖突。