HLA分型方法的發(fā)展及其在器官移植中的作用

Qiang Shi（石強(qiáng)）（Division of Transplantation，Department of Surgery，School of Medicine and Public Health，University of Wisconsin-Madison，Madison 53792，Wisconsin，American）

人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）分子表達(dá)于我們體內(nèi)幾乎所有的有核細(xì)胞表面。HLA分子控制識(shí)別“自身”和“異己”的生物學(xué)過程，它的主要功能是當(dāng)作載體將異體抗原遞交給T淋巴細(xì)胞，從而啟動(dòng)特異且適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)將異體成分排除。從進(jìn)化角度上看，HLA介導(dǎo)的免疫反應(yīng)是多細(xì)胞復(fù)雜有機(jī)體在簡(jiǎn)單向復(fù)雜個(gè)體過度過程中積累的保護(hù)物種不受外源生物體襲擊的重要途經(jīng)，但是它卻在臨床上成為影響器官移植生存期的主要免疫障礙。如果受體和供體的HLA不匹配，它們之間將引發(fā)細(xì)胞和抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)。組織相容實(shí)驗(yàn)室和免疫遺傳性實(shí)驗(yàn)室的工作就是鑒定受體和供體的HLA系統(tǒng)分子構(gòu)成，以確定兩者之間的HLA差異程度。

科學(xué)家早在20世紀(jì)30年代就已發(fā)現(xiàn)HLA。20年 后，Jean Dausset、Rose Payne及 Jon van Rood通過妊娠和輸血先后鑒定了HLA異源抗體。美國(guó)Jackson 實(shí)驗(yàn)室Snell小組以及英國(guó)Gorer小組使用純系小鼠在遺傳學(xué)上確定了HLA分子，并證實(shí)它們?cè)诋愺w器官移植中的作用［1］。隨著更多的HLA不斷地被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道，國(guó)際機(jī)構(gòu)要求科學(xué)化統(tǒng)一管理HLA分子，因此，第一屆國(guó)際會(huì)議于1964年在美國(guó)北卡Durham召開，其后的十四屆會(huì)議，命名了3種Ⅰ類HLA （Class Ⅰ， HLA-A，HLA-B，HLA-C）和五種Ⅱ類HLA（HLA-DR，HLA-DQ，HLA-DP，HLADM，HLA-DO）。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）HLA命名委員會(huì)2017年國(guó)際免疫遺傳學(xué)（the international immunogenetics，IMGT）／HLA數(shù)據(jù)庫資料，圖1展示了迄今Ⅰ類 （綠色）和Ⅱ類（黑色）已認(rèn)定的HLA 相關(guān)分子數(shù)［2］。

圖1 1987年- 2017年，IMGT認(rèn)定和命名的HLA分子的基因數(shù)目

血清學(xué)是最早用于確定HLA多態(tài)性的方法。1964年，美國(guó)的Terasaki和McClelland建立了補(bǔ)體依賴的淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)（complement dependent cytotoxicity test，CDC），他們使用天然存在的多克隆抗體特異性確定HLA的表性［3-4］。血清學(xué)方法依然是當(dāng)代鑒定HLA表型的黃金標(biāo)準(zhǔn)。雖然它只是確定HLA組織相容性低分辨率的方法，但它是唯一可鑒定細(xì)胞表面實(shí)際表達(dá)HLA表型和參與器官排異分子的手段， 是功能性試驗(yàn)。其不足之處是抗血清的來源和質(zhì)量控制影響試驗(yàn)結(jié)果，也不能提供基因序列的等位變異。在目前市場(chǎng)上，提供HLA實(shí)驗(yàn)室試劑的廠商以單抗為檢測(cè)試劑的，同時(shí)加抗體和補(bǔ)體，在1小時(shí)內(nèi)一步完成CDC。

自20世紀(jì)90年代，分子遺傳學(xué)和基因操縱技術(shù)的迅猛發(fā)展，實(shí)驗(yàn)室HLA檢測(cè)手段有了徹底的改變?；诙嗑勖告?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）的DNA序列分析分子診斷占據(jù)主導(dǎo)地位［1，5］。當(dāng)檢體基因組DNA被限制性內(nèi)切酶切割和擴(kuò)增后，在凝膠電泳板上顯示不同長(zhǎng)度的片段譜，依次決定HLA分型。與抗體分析相比，它可展示HLA基因的結(jié)構(gòu)，特別適合DR3 / 5 / 6單倍型，特異性得到提高，但方法繁雜，分辨率和準(zhǔn)確性有局限。然而，依據(jù)PCR基本原則卻衍生了多種HLA分型的方法，在眾多HLA分型試驗(yàn)中，PCR序列特異引物（PCR-SSP）和PCR序列特異的寡核苷酸引物（PCR-SSO）已是常規(guī)檢測(cè)方法。前者使用與對(duì)應(yīng)的3’末端特異性核酸引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增HLA基因外顯子，通過在凝膠上檢查陰性反應(yīng)帶決定等位基因存在與否；后者測(cè)定欲檢HLA基因擴(kuò)增產(chǎn)物與連接在載體上的寡核苷酸片段雜交程度判斷結(jié)果。PCR-SSP和PCR-SSO兩個(gè)方法均可提供一定程度的等位基因中／高分辨率結(jié)果，但不同實(shí)驗(yàn)室使用時(shí)有側(cè)重。Applied Biosystems公司依據(jù)realtime PCR原理改進(jìn)了PCR-SSP的凝膠電泳，顯示PCR產(chǎn)物的設(shè)計(jì)并以熒光分析代替定量產(chǎn)物，使檢測(cè)時(shí)間縮短至45～60分鐘，是臨床快速HLA分析最常用的技術(shù)。

被廣泛接受具有高分辨率HLA分型的方法是測(cè)定PCR產(chǎn)物的基因序列［6］。最早的測(cè)序手段是使用毛細(xì)管的Sanger序列， 亦稱為PCR-SBT。它的可靠性和特異性高于其他測(cè)序，但是它不能很好地區(qū)分異質(zhì)樣本內(nèi)堿基的順／反排序，從而產(chǎn)生不確定的雙關(guān)性結(jié)果，這是高分辨率分析中重要的障礙。為了解決此問題，許多實(shí)驗(yàn)室的工作流程中使用PCR-SSO或PCR-SSP給出初步結(jié)果，然后將異質(zhì)標(biāo)本的等位基因雙鏈分別擴(kuò)增，各自進(jìn)行Sanger測(cè)序。如果雙關(guān)性依然不能排除，要使用多項(xiàng)PCR-SSP逐一鑒定。

近十年來，高通量下一代測(cè)序?yàn)榻鉀QHLA測(cè)序雙關(guān)性結(jié)果有了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。下一代測(cè)序在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上有兩個(gè)巨大的優(yōu)勢(shì)，從而使測(cè)序過程中的雙關(guān)性結(jié)果減至最少。① 它采用了“克隆性測(cè)序”可使連鎖多態(tài)基因在同一復(fù)制子內(nèi)進(jìn)行；② “高通量平行測(cè)序”可使眾多序列在同一運(yùn)行內(nèi)完成。下一代測(cè)序不僅決定外顯子亦可測(cè)定內(nèi)含子的序列。已有四家不同平臺(tái)的下一代測(cè)序設(shè)備在商業(yè)運(yùn)行：Thermo Fisher離子半導(dǎo)體系統(tǒng)（Ion Torrente Sequencing）、Roche焦磷酸454測(cè)序系統(tǒng)、Illumina Miseq邊合成邊測(cè)序系統(tǒng)以及Life Technology SoLiD邊連接邊測(cè)序系統(tǒng)，它們的區(qū)別在于用不同的方法完成克隆測(cè)序步驟。據(jù)統(tǒng)計(jì)，已有270萬份標(biāo)本使用新方法［7］。在未來的幾年內(nèi)，下一代測(cè)序?qū)?huì)有2個(gè)突破：① HLAⅠ和Ⅱ類的測(cè)序工作流程更快、更自動(dòng)化及更加經(jīng)濟(jì)；② HLA數(shù)據(jù)庫更完整。屆時(shí)，HLA實(shí)驗(yàn)室的測(cè)序結(jié)果更加準(zhǔn)確。

HLA分型技術(shù)在不斷地發(fā)展，它對(duì)器官移植的影響日益加深。但是，移植醫(yī)師對(duì)供者與受者的HLA匹配程度要求則與器官移植的種類有很大的關(guān)聯(lián)。不同國(guó)家和地區(qū)均有各自的操作程序和規(guī)則。一般來講，實(shí)體器官移植的匹配程度以低分辨率為基點(diǎn)，而造血干細(xì)胞的移植需要在高分辨率基礎(chǔ)上。 基于單一和多中心的數(shù)據(jù)分析，例如Opelz報(bào)告腎移植受／供者HLA完全不匹配的器官存活率比完全匹配者低17%［5，8］。 眾多臨床工作者對(duì)依據(jù)HLA匹配程度而決定器官分配的政策提出了挑戰(zhàn)：① 多種高劑量免疫抑制劑方案可降低HLA不匹配患者的排異反應(yīng)；② 為HLA配型而延長(zhǎng)器官運(yùn)輸時(shí)間會(huì)加大組織的損傷而降低器官存活時(shí)間。因此，如何平衡兩者的關(guān)系是臨床治療方案的考慮因素。在心臟移植的問題上，HLA分型匹配的作用遠(yuǎn)不及腎移植清楚，主要原因是供者數(shù)量有限，收集的數(shù)據(jù)說服力有限。肺移植亦如此。HLA相容性對(duì)肝移植的影響至今尚未有清楚的結(jié)論，正面和負(fù)面影響均有臨床試驗(yàn)報(bào)道。HLA相容匹配在異體造血干細(xì)胞的重要性是十分顯著的。造血干細(xì)胞移植的供／受體不僅要一類HLA-A、HLA-B、HLA-C完全匹配，而且二類HLA-DR、HLA-DQ，甚至HLA-DP亦要相同，特別是它的匹配是在高分辨率的基礎(chǔ)上。如果配型不當(dāng)，供者造血干細(xì)胞繁衍的免疫細(xì)胞會(huì)將受者的細(xì)胞視為異體而發(fā)起攻擊，引發(fā)移植物抗宿主病（graft versus host disease，GVHD）綜合征。不過有趣的是，當(dāng)一卵同生的雙胞胎在治療白血病時(shí)，造血干細(xì)胞移植后，其復(fù)發(fā)的機(jī)會(huì)比HLA相同的一級(jí)或二級(jí)親屬要高。幾個(gè)不同研究單位的結(jié)果顯示，在非親屬造血干細(xì)胞移植時(shí)，單一位點(diǎn)在等位基因水平上（四位數(shù)字）HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR、HLA-DQ及HLA-DP有一位差異不會(huì)導(dǎo)致移植失敗，但是組群水平上（二位數(shù)字）的差異則會(huì)對(duì)預(yù)后有嚴(yán)重影響［9］。

器官移植在治療終端器官衰竭有不可質(zhì)疑的療效，因而，有關(guān)HLA的分型的基礎(chǔ)和臨床領(lǐng)域有大幅度擴(kuò)展。開發(fā)高分辨率HLA的技術(shù)會(huì)不斷取得突破和進(jìn)展，Luminex和基因芯片與PCR結(jié)合是未來發(fā)展的方向。從臨床角度來看，單一細(xì)胞群移植是新的課題，如胰島細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞，已在多家醫(yī)院開展實(shí)用性治療。使用胚胎干細(xì)胞衍生的確定細(xì)胞制劑可能占據(jù)重要的一席。在移植免疫學(xué)未找到解決排除反應(yīng)的辦法之前，HLA分型就一直有市場(chǎng)和醫(yī)學(xué)價(jià)值。