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    PEG修飾的大黃酸偶聯(lián)物的合成及紫杉醇納米膠束的制備

    2018-10-26 06:54:40王夏英邱梁楨李青卓王曉穎
    關(guān)鍵詞:偶聯(lián)殼聚糖粒徑

    王夏英,邱梁楨,李青卓,徐 偉,王曉穎

    (福建中醫(yī)藥大學(xué),福州 350122)

    聚合物膠束作為一種納米藥物載體,近年來受到廣泛的關(guān)注。聚合物膠束的疏水內(nèi)核可作為疏水性藥物的存儲空間,將難溶性藥物包載于其中;其親水性外殼能提高膠束在水溶液中的穩(wěn)定性,并能保護(hù)膠束,避免其在體內(nèi)被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)識別而被快速清除[1-3]。聚合物膠束粒徑較小,能通過增強(qiáng)滲透滯留效應(yīng)(EPR)提高抗腫瘤藥物向腫瘤部位遞送的效果[4-5]。

    羧甲基殼聚糖(carboxymethyl chitosan,CMCS)為殼聚糖水溶性衍生物,具有良好的生物相容性,生物活性,抗菌活性及穩(wěn)定性。CMCS上具有多種官能團(tuán),例如-NH2和-COOH,具有良好的可修飾性。因此,CMCS作為藥物載體被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域[6-7]。大黃酸(rhein,R)為中藥大黃的主要成分之一,具有抗炎、抗腫瘤細(xì)胞增殖、抗腫瘤血管生成等作用[8-9],并與抗腫瘤藥物紫杉醇(paclitaxel,PTX)具有協(xié)同抗腫瘤作用[10]。

    聚乙二醇(PEG)由重復(fù)的氧乙烯基組成,其具有高度的親水性。研究人員于上世紀(jì)70年代首次提出將PEG用于藥物的修飾[11]。經(jīng)PEG化的藥物能增加水溶性,降低酶降解和腎小球?yàn)V過率,下調(diào)免疫原性或抗原性,保護(hù)其免遭體內(nèi)環(huán)境破壞[12-15]。目前,許多PEG化的化療制劑已被FDA批準(zhǔn)上市[16-18]。

    本研究以PEG修飾的羧甲基殼聚糖為骨架,接枝小分子大黃酸合成兩親性mPEG-羧甲基殼聚糖-大黃酸偶聯(lián)物(CRmP偶聯(lián)物)作為藥物遞送載體材料,并制備了載抗腫瘤藥物PTX的CRmP納米膠束(PTX/CRmP納米膠束),該膠束能增加PTX的水溶性,并提高PTX抗腫瘤的效果。

    1 材 料

    1.1 試 劑

    O-羧甲基殼聚糖(相對分子質(zhì)量1×105,青島弘海生物技術(shù)有限公司);大黃酸(陜西澳源生物技術(shù)有限公司,純度≥98%);紫杉醇(上海中西三維藥業(yè)有限公司);透析袋(MWCO14000,上海綠鳥科技發(fā)展有限公司);N-羥基琥珀酰亞胺(NHS,純度≥98%);1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl,純度≥98%)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);羧基化聚乙二醇單甲醚(mPEG-COOH,相對分子質(zhì)量2 000,純度≥98%,上海金穗生物科技有限公司);RPMI Medium Modified,磷酸鹽緩沖液(1×),0.25%胰蛋白酶(1×),青霉素鏈霉素溶液(美國HyClone公司)。

    1.2 儀 器

    MS105DU十萬分之一電子天平[特勒-托利多儀器(上海)有限公司];JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司);Alpha1-2 LD冷凍干燥機(jī)(德國Christ公司);NICOMPTM380ZLS激光粒徑測定儀(美國Santa Bbarbara公司);Avance III 500核磁共振波譜儀(瑞士Bruker公司);原子力顯微鏡5500(美國Agilent公司);Nicolet iS50傅里葉變換紅外光譜儀(美國Thermo Fisher公司);Infinite M200 PRO多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)。

    2 方 法

    2.1 PEG修飾的羧甲基殼聚糖-大黃酸(CRmP)偶聯(lián)物的合成

    稱取適量的CMCS置反應(yīng)瓶中,加入蒸餾水10 mL溶脹30 min。取反應(yīng)量的大黃酸置廣口瓶中,加入1%NaHCO3溶液10 mL,加熱使溶解,冷卻至室溫。取反應(yīng)量的mPEG-COOH粉末置廣口瓶中,加入蒸餾水5 mL溶解。將mPEG-COOH溶液加入到已冷卻至室溫的大黃酸溶液中,加入EDC·HCl,活化20 min,再加入NHS,將此混合液攪拌下加入CMCS溶液中,避光攪拌24 h。反應(yīng)結(jié)束后,用丙酮沉淀反應(yīng)物,靜置后抽濾(0.45 μm的濾膜)。將抽干后的反應(yīng)產(chǎn)物溶解于水中,冰水浴條件下探頭超聲至澄清后過0.8 μm的濾膜,濾液轉(zhuǎn)置于透析袋中透析3 d。

    透析結(jié)束后,將產(chǎn)物水溶液再次在冰水浴條件下探頭超聲20 min后,取上清液過膜(0.8 μm),濾液-20 ℃冰箱預(yù)凍,冷凍干燥,即得CRmP偶聯(lián)物。

    2.2 CRmP偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)表征

    2.2.1 紅外光譜(FT-IR)表征 采用溴化鉀(KBr)壓片法。取適量CMCS、大黃酸、mPEG-COOH、CRmP偶聯(lián)物,分別加適量KBr,于紅外燈下研磨混合,壓片,進(jìn)行紅外檢測,記錄FT-IR光譜。

    2.2.2 核磁共振氫譜(1H NMR)表征 分別稱取CMCS、mPEG-COOH和CRmP偶聯(lián)物各10 mg,CMCS、mPEG-COOH以D2O為溶劑,CRmP偶聯(lián)物以D2O-DMSOd6,1∶1比例為溶劑,溶解后加入核磁管中,四甲基硅烷為內(nèi)標(biāo),采用核磁共振儀測定樣品的1H NMR。

    2.3 取代度的測定

    2.3.1 大黃酸取代度的測定 CRmP偶聯(lián)物上大黃酸的取代度采用紫外分光光度法測定。精密稱取大黃酸對照品適量,以甲醇為溶劑配制系列濃度,于229 nm波長處檢測,繪制大黃酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將供試品溶液所測的吸收度,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,得到大黃酸的濃度,根據(jù)公式(1)計(jì)算大黃酸在CRmP偶聯(lián)物上的取代度(DSR):

    (1)

    式中,mR為大黃酸接枝在CRmP偶聯(lián)物上的量(g);mCRmP為測定時(shí)所稱取的CRmP偶聯(lián)物的量(g)。

    2.3.2 mPEG-COOH取代度的測定 mPEG-COOH取代度通過1H NMR譜計(jì)算而得。CRmP偶聯(lián)物完成1H NMR譜圖分析后,根據(jù)特征峰峰面積的比值計(jì)算得到mPEG-COOH的取代度。

    2.4 PTX/CRmP納米膠束的制備

    稱取CRmP偶聯(lián)物18 mg,加蒸餾水適量,室溫下攪拌溶解后冰水浴探頭超聲10 min,將PTX溶于無水乙醇中,然后逐滴加至CRmP納米膠束溶液中,劇烈攪拌20 min,冰水浴探頭超聲30 min,透析24 h后,冰水浴探頭超聲20 min后用0.8 μm濾膜濾過,即得PTX/CRmP納米膠束溶液,凍干后得PTX/CRmP納米膠束凍干粉末。

    2.5 PTX/CRmP納米膠束載藥量和包封率的測定

    2.5.1 色譜條件的建立 色譜柱為Inertsil ODS-SP(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相為甲醇-水(69∶31),流速為1.0 mL/min,柱溫為30 ℃,檢測波長為227 nm,進(jìn)樣量為20 μL。

    2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取PTX 3 mg,精密稱定,置10 mL的量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,得質(zhì)量濃度為307 μg/mL的儲備液。取此儲備液,以甲醇為溶劑,逐步稀釋配制質(zhì)量濃度分別為92.1,61.4、30.7,24.56,15.35,2.456,1.535 μg/mL的PTX溶液,按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件測定,記錄峰面積,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,

    2.5.3 測定方法 精密稱定適量的PTX/CRmP納米膠束凍干粉末,加水溶解,0.8 μm濾膜濾過。取適量的濾過液置10 mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,破壞膠束結(jié)構(gòu),使得PTX從膠束中游離出來溶解在甲醇溶液中,用0.22 μm濾膜濾過,取續(xù)濾液按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件測定,記錄峰面積,計(jì)算PTX含量,并計(jì)算該納米膠束的包封率(EE)和載藥量(DL)。

    2.6 PTX/CRmP納米膠束的表征

    2.6.1 PTX/CRmP納米膠束的粒徑分布與電位 稱取適量PTX/CRmP納米膠束凍干粉末,冰浴探頭超聲溶解,過0.8 μm濾膜,制備得到PTX/CRmP納米膠束溶液,用動態(tài)激光粒徑儀(DLS)測定膠束粒徑分布及Zeta電位。

    2.6.2 PTX/CRmP納米膠束的形態(tài)學(xué)分析 PTX/CRmP納米膠束的形貌研究采用原子力顯微鏡(atomic force microscopy,AFM)觀察。新剝離的云母片預(yù)先用雙面膠貼在金屬基片上,吸取載藥PTX/CRmP納米膠束溶液適量,滴加到云母表面上,用氮吹儀使其干燥完全。待云母片上的溶液干燥形成薄膜后,將云母片置AFM中進(jìn)行觀察進(jìn)行掃描觀察,顯微鏡探頭采用輕敲模式(tapping mode)探測膠束形貌。

    2.7 PTX/CRmP納米膠束的體外細(xì)胞毒性

    PTX/CRmP納米膠束的體外細(xì)胞毒性通過3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法評價(jià)。

    2.7.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將MCF-7細(xì)胞(ATCC)加入含有10% FBS、1%青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液,置于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中,隔天換液。當(dāng)細(xì)胞貼壁達(dá)到約為80%~90%,細(xì)胞單層貼壁生長時(shí)即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

    2.7.2 細(xì)胞種板 取對數(shù)生長期的細(xì)胞,按常規(guī)方法消化細(xì)胞制備單細(xì)胞混懸液,將細(xì)胞混懸液以1 200 r/min離心3 min,棄除上清液,加入新鮮的RPMI-1640完全培養(yǎng)液,調(diào)整濃度為每毫升5×104個細(xì)胞的懸浮液,接種于96孔板中,每個孔加入細(xì)胞懸浮液100 μL,培養(yǎng)箱中孵育24 h使其貼壁。

    2.7.3 細(xì)胞毒性試驗(yàn) 待細(xì)胞孵育24 h后,吸棄培養(yǎng)液。設(shè)置不同分組,包括Taxol?組、Cremophor EL:無水乙醇混合溶劑(1∶1)組、CRmP偶聯(lián)物組、PTX/CRmP納米膠束組、空白組和對照組。將上述各組受試液向96孔板中各加入150 μL,分別含PTX濃度為1 000,500,100,50,10,5,1 nmol/L 6種不同濃度的培養(yǎng)液,每個濃度平行6個孔,以不含細(xì)胞的培養(yǎng)基和MTT溶液為空白組,含細(xì)胞不給藥物的細(xì)胞為正常組,37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。分別于加藥后24,48,72 h,將培養(yǎng)板取出,每孔加入0.5 mg/mL MTT溶液100 μL,37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后取出,小心吸取上清液。每孔加入DMSO150 μL溶解藍(lán)紫色結(jié)晶物。用酶標(biāo)儀在570 nm處測定吸收度。并根據(jù)各孔的吸收度計(jì)算細(xì)胞的存活率。

    3 結(jié) 果

    3.1 CRmP偶聯(lián)物的合成

    CMCS分子鏈上有豐富的氨基,大黃酸、mPEG-COOH結(jié)構(gòu)上含有羧基。因此,本反應(yīng)以活性較高的酰胺反應(yīng)為基礎(chǔ),在EDC和NHS的催化下,同時(shí)活化大黃酸和mPEG-COOH的羧基,使其與CMCS的氨基發(fā)生酰胺反應(yīng),將大黃酸、mPEG-COOH接枝到CMCS上形成CRmP偶聯(lián)物。該合成工藝(見圖1)簡單,反應(yīng)條件溫和,產(chǎn)率較高,操作簡便易于重復(fù)。

    Figure1 Synthesis of CRmP conjugate

    CMCS:Carboxymethyl chitosan;CRmP:PEGylated carboxymethyl chitosan-rhein

    3.2 FT-IR圖譜解析

    圖2-d為mPEG-COOH的FT-IR譜圖,可以觀察到3 455 cm-1處的-OH的伸縮振動峰,2 889 cm-1處的-C-H的伸縮振動峰,1 742 cm-1處的C=O的伸縮振動峰,以及1 115 cm-1處的-C-O-C-鍵的伸縮振動峰。圖2-c為大黃酸的FT-IR譜圖。3 061 cm-1,1 693 cm-1為-COOH的振動峰。圖2-b為CMCS的FT-IR譜圖,3 423 cm-1處是-NH和-OH的伸縮振動峰,2 922 cm-1處吸收峰為-CH的伸縮振動峰,1 594 cm-1處為羧基上的-C=O伸縮振動吸收峰,1 410 cm-1處峰為-OH和-CH的環(huán)變形振動吸收峰,1 067 cm-1處峰為-C-O伸縮振動吸收峰。圖2-a為CRmP偶聯(lián)物的FT-IR譜圖,與CMCS譜圖相比,3 455 cm-1處-NH和-OH的伸縮振動吸收峰變窄,這是由于CMCS主鏈上的氨基接枝mPEG-COOH和大黃酸的影響結(jié)果,2 881 cm-1處為mPEG-COOH的重復(fù)單元(-CH2-CH2-O-)中的-C-H的伸縮振動峰,此處的伸縮振動峰變強(qiáng),表明接上mPEG-COOH后引入更多的碳?xì)滏I,1 208 cm-1處-C-O-C-鍵的伸縮振動峰,這些是mPEG主結(jié)構(gòu)的特征吸收峰;與mPEG-COOH紅外吸收峰相比較,結(jié)合物在1 742 cm-1處羰基的伸縮振動峰消失。1 629 cm-1、1 569 cm-1處出現(xiàn)酰胺鍵Ⅰ,Ⅱ譜帶,說明mPEG-COOH、大黃酸上的羰基轉(zhuǎn)變成為酰胺鍵上的羰基。

    3.3 1H NMR圖譜解析

    mPEG-COOH、大黃酸、CMCS和CRmP偶聯(lián)物的1H NMR圖譜如圖3所示。圖3-c為CMCS的1H NMR 圖譜,δ4.7為溶劑(D2O)峰,δ2.00殼聚糖上脫乙酰度不完全的乙酰氨基(-NHCOH3)的質(zhì)子峰,δ3.55~3.85是殼聚糖糖環(huán)上的質(zhì)子峰(H-3,H-4,H-5,H-6),δ3.03為CMCS糖環(huán)上C2-H質(zhì)子峰。圖3-a為mPEG-COOH核磁氫譜圖,δ4.68為溶劑(D2O)峰,δ3.34為mPEG-COOH末端甲氧基(-OCH3)質(zhì)子峰,δ3.5~3.7為mPEG-COOH重復(fù)單元(-CH2-CH2-O-)。與圖3-a、c相比較,圖3-d CRmP偶聯(lián)物1H NMR圖中δ3.47~3.87處出現(xiàn)了將強(qiáng)的峰,此為mPEG-COOH上的重復(fù)單元-OCH2CH2的質(zhì)子峰,此外在δ3.34出現(xiàn)了mPEG-COOH甲氧基-OCH3質(zhì)子峰,除了mPEG-COOH峰外,在δ8.12、7.84、7.75、7.73、7.41(圖3中放大部分)處出現(xiàn)了大黃酸結(jié)構(gòu)上(-CH,-OH)的質(zhì)子信號峰,此為大黃酸的特征信號峰,由此推斷CRmP偶聯(lián)物已成功合成。

    Figure2 FT-IR spectra of CRmP conjugate (a),CMCS (b),rhein (c),mPEG-COOH (d)

    Figure31H NMR spectra of mPEG-COOH (a),CMCS (C) in D2O,and rhein (b) in DMSO,and CRmP conjugate (d) in D2O/DMSO cosolvent (1∶1)

    3.4 取代度分析

    通過紫外分光光度法測得大黃酸的取代度為7.6%。從CRmP的1H NMR譜圖中可以看出,δ3.03處CMCS糖環(huán)上C2-H的質(zhì)子峰與δ3.34處mPEG-COOH末端甲氧基(-OCH3)的質(zhì)子峰易于分辨,故采用δ3.03 與δ3.34的峰面積的比值計(jì)算得到mPEG的取代度為36%。

    3.5 PTX/CRmP納米膠束的形態(tài)分析

    經(jīng)測定,PTX/CRmP納米膠束的平均粒徑為(204.1±10.7)nm(圖略),PDI為(0.13±0.01),Zeta電位為(-30.21±3.69)mV。AFM圖(圖4)中可見PTX/CRmP納米膠束形態(tài)均一,近似球形,粒徑在200 nm左右,與DLS測定的膠束粒徑結(jié)果相一致。

    Figure4 AFM images of PTX/CRmP at the mode of 2D(A)and 3D(B)

    PTX:Paclitaxel

    3.6 PTX/CRmP納米膠束載藥量與包封率

    PTX質(zhì)量濃度在1.00~90.0 μg/mL內(nèi),其線性關(guān)系良好。線性回歸方程為A=35 855c-43 558,其相關(guān)系數(shù)為r=0.999 7。分別選取3組制備得到的PTX/CRmP納米膠束,分別測定PTX的載藥量和包封率。PTX/CRmP納米膠束載藥量為(38.24±2.78)%,包封率為(79.85±7.32)%。

    3.7 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

    通過MTT法分別考察Taxol?的溶劑Cremophor EL-無水乙醇混合溶劑(1∶1)和載體材料CRmP偶聯(lián)物對MCF-7細(xì)胞的殺傷作用。結(jié)果(圖5)顯示,對于空白載體材料,MCF-7細(xì)胞在培養(yǎng)24、48、72 h后,載體材料CRmP偶聯(lián)物具有良好的安全性,即使孵育濃度為1 mmol/L時(shí),對細(xì)胞的存活率也并無顯著影響,細(xì)胞存活率均在95%以上。對于PTX制劑,Taxol?及PTX/CRmP納米膠束均對MCF-7細(xì)胞有一定的抑制率。在藥物作用24、48、72 h時(shí),Taxol?及PTX/CRmP納米膠束對MCF-7細(xì)胞的抑制作用均隨著PTX濃度的增加,表明Taxol?及PTX/CRmP納米膠束對MCF-7細(xì)胞均有時(shí)間依賴性和濃度依賴性。

    PTX市售注射劑Taxol?與PTX/CRmP納米膠束均顯示出較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。Taxol?與PTX/CRmP納米膠束24 和48 h孵育濃度小于5 nmol/L時(shí),沒有顯著的細(xì)胞毒性,而PTX/CRmP納米膠束在72 h孵育濃度為5 nmol/L時(shí)表現(xiàn)出了顯著的細(xì)胞毒性,說明PTX/CRmP納米膠束在低濃度并長時(shí)間給藥后顯示出優(yōu)于Taxol?對MCF-7細(xì)胞的殺傷作用。表1中,Taxol?與PTX/CRmP納米膠束對MCF-7的IC50數(shù)據(jù)中可以看出,隨作用時(shí)間延長,PTX/CRmP納米膠束顯示出比Taxol?更好的細(xì)胞殺傷效果。

    Figure5Invitrocytotoxicity of CRmP conjugate and PTX/CRmP against MCF-7 cells

    Blank vehicle:Cremophor EL:ethanol (1∶1)

    *P<0.05,**P<0.01

    Table1 IC50values of Taxol?and PTX/CRmP against MCF-7 cells

    4 討 論

    在本研究中,通過PEG修飾CMCS并接枝大黃酸成功合成CRmP偶聯(lián)物,高分子CMCS和PEG具有親水性,小分子大黃酸為疏水性,因此,該偶聯(lián)物具有兩親性,能夠在水中自組裝成聚合物膠束。PTX為疏水性藥物,能夠被包載于CRmP膠束的疏水內(nèi)核中,形成載PTX的納米膠束。CRmP作為PTX的遞送載體,既增強(qiáng)了PTX的水溶性,同時(shí)可避免PTX直接與正常組織細(xì)胞接觸而產(chǎn)生的毒副作用。

    PTX/CRmP納米膠束具有出色載藥能力,載藥量達(dá)38%;并且粒徑較小,粒徑分布均勻,能夠有效避免載藥膠束被體內(nèi)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬而清除,也能更多地通過EPR效應(yīng)遞送藥物到達(dá)腫瘤部位[19];載藥膠束呈電負(fù)性,避免了對人體正常組織細(xì)胞的殺傷作用;PEG修飾后,可以降低膠束在體內(nèi)遞送藥物過程中與蛋白質(zhì)的結(jié)合率[20],避免在體內(nèi)被快速清除。實(shí)驗(yàn)初步結(jié)果表明PTX/CRmP納米膠束具體對PTX具有較好的負(fù)載和遞送能力,相關(guān)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)有待進(jìn)一步研究。

    MTT法細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)證明了CRmP偶聯(lián)物具有極低的細(xì)胞毒性,因此,其可以作為安全的載體材料應(yīng)用于水難溶性藥物的遞送。PTX/CRmP納米膠束在MCF-7細(xì)胞系體現(xiàn)出的時(shí)間依賴性的體外細(xì)胞毒性,表明PTX/CRmP納米膠束由于載體材料的包載,在短時(shí)間內(nèi)細(xì)胞毒性作用并未體現(xiàn)出明顯優(yōu)勢,但能夠隨時(shí)間推移而呈現(xiàn)較強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞殺傷作用,其對腫瘤細(xì)胞的殺傷機(jī)制是否與載體材料上的小分子大黃酸的抗腫瘤作用相關(guān),有待深入研究。

    綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本研究所合成的CRmP偶聯(lián)物具有較好的納米載體特征,所制備的PTX/CRmP納米膠束預(yù)期能夠?qū)TX起到很好的體內(nèi)遞送作用,其將在通過EPR效應(yīng)的被動靶向腫瘤給藥方向具有良好的應(yīng)用前景。

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