美金剛長(zhǎng)效注射劑的制備及其評(píng)價(jià)

林 霞，李其彬，石曉宇，楊子毅

(江南大學(xué)藥學(xué)院，無錫 214122)

阿爾茨海默病是一種進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)功能退行性變性疾病。迄今為止，已上市的阿爾茨海默病治療藥物僅有他克林、多奈哌齊、利斯的明、加蘭他敏、石杉?jí)A甲和鹽酸美金剛。其中，鹽酸美金剛是唯一一個(gè)被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)用于治療中度至重度阿爾茨海默病的藥物。鹽酸美金剛是一種低中度親和力的非競(jìng)爭(zhēng)性的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體拮抗劑，具有雙向調(diào)節(jié)作用[1]。

目前國內(nèi)外上市的鹽酸美金剛制劑包括普通片劑、口服溶液劑和緩釋膠囊。盡管口服制劑安全性高、服用方便、患者易于接受，但是鹽酸美金剛口服制劑需每日用藥1～2次，對(duì)于阿爾茨海默病患者而言，往往難以自主用藥，易出現(xiàn)錯(cuò)服、漏服甚至拒服，最終導(dǎo)致治療中止，病情進(jìn)一步惡化。因此，亟需開發(fā)一種可長(zhǎng)期釋藥的美金剛長(zhǎng)效注射劑，以改善阿爾茨海默病患者用藥依從性。

現(xiàn)有長(zhǎng)效注射劑技術(shù)主要包括前體藥物、微球、微囊、注射植入劑、凝膠、原位貯庫、難溶性鹽等技術(shù)[2-3]。其中，難溶性鹽技術(shù)是將藥物與疏水性的酸或堿成鹽，通過降低藥物溶解度，延長(zhǎng)藥物釋放時(shí)間[4]。如將卷曲霉素-油酸鹽制備成緩釋微球，與硫酸卷曲霉素相比，體內(nèi)緩釋時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)10 d[5]。將奧氮平制備成一水合奧氮平雙羥萘酸鹽注射劑，其給藥頻率可由每日1次降低至每2周或每4周給藥1次，血漿半衰期由30 h延長(zhǎng)至近30天[6]。此外，目前已上市的難溶性鹽長(zhǎng)效注射劑還包括曲普瑞林雙羥萘酸鹽長(zhǎng)效注射劑(每4周或12周或24周給藥1次)和帕瑞肽雙羥萘酸鹽長(zhǎng)效注射劑(每4周給藥1次)[7-8]。由此可見，難溶性鹽技術(shù)作為長(zhǎng)效注射劑技術(shù)中的一種簡(jiǎn)易途徑，有望在長(zhǎng)期釋藥領(lǐng)域得到更廣泛的應(yīng)用。

本研究采用難溶性鹽技術(shù)，制備了美金剛的一系列難溶性鹽，對(duì)其結(jié)構(gòu)表征和溶解性能進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)價(jià)；將4種難溶性鹽進(jìn)一步制備成納米混懸型長(zhǎng)效注射劑，并對(duì)不同難溶性鹽納米混懸劑的緩釋性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

鹽酸美金剛(武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司)；羧甲基纖維素鈉(AqualonTM，美國亞仕蘭集團(tuán)公司)；蛋黃卵磷脂(S45，德國Lipoid公司)；α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS，南京愛里凱德化工有限公司)；棕櫚酸鈉、油酸鈉、硬脂酸鈉和雙羥萘酸(武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司)；纖維素透析袋(截留相對(duì)分子質(zhì)量50 kD，上海源葉生物科技有限公司)；甲醇、乙腈(色譜純，美國天地有限公司)，其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；PSS380粒度測(cè)定儀(美國PSS公司)；高壓均質(zhì)機(jī)(ATS工業(yè)系統(tǒng)有限公司)；T18高速剪切機(jī)(德國IKA公司)；TENSORⅡ紅外光譜儀、D2-Advance 型X射線衍射儀、核磁共振波譜儀(瑞士Bruker公司)；BSA 124S分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；FE20 pH計(jì)(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

2 方 法

2.1 美金剛難溶性鹽的制備

采用沉淀法制備美金剛難溶性鹽，包括美金剛-油酸鹽(Mem-Ole)、美金剛-硬脂酸鹽(Mem-Ste)、美金剛-棕櫚酸鹽(Mem-Pal)和美金剛-雙羥萘酸鹽(Mem-Pam)。

2.1.1 美金剛-油酸鹽、美金剛-硬脂酸鹽和美金剛-棕櫚酸鹽的制備 稱取適量油酸鈉，分散至75 ℃ 蒸餾水100 mL中，攪拌溶解，配制濃度為0.1 mol/L的油酸鈉水溶液；稱取適量鹽酸美金剛，溶解至75 ℃蒸餾水100 mL中，得濃度為0.1 mol/L的鹽酸美金剛水溶液。于75 ℃，在攪拌下，將上述鹽酸美金剛水溶液滴加至油酸鈉水溶液中，10 000 r/min離心10 min，收集上層油狀黏稠液體，熱水洗滌3次，將所得油狀黏稠液體40 ℃真空干燥24 h，即得Mem-Ole。

采用相同方法，分別制備Mem-Ste和Mem-Pal。

2.1.2 美金剛-雙羥萘酸鹽的制備 稱取適量雙羥萘酸，分散于75 ℃蒸餾水100 mL中，配制成濃度為0.1 mol/L的雙羥萘酸混懸液；于75℃，在攪拌下，向上述混懸液中滴加2.5 mol/L氫氧化鈉水溶液(雙羥萘酸與氫氧化鈉物質(zhì)的量比為1∶2)8 mL，攪拌至雙羥萘酸全部溶解，得雙羥萘酸二鈉水溶液。于75 ℃，在攪拌下，將0.2 mol/L鹽酸美金剛水溶液100 mL滴加至上述雙羥萘酸二鈉水溶液中。抽濾收集濾餅，將濾餅水洗3次，40 ℃真空干燥24 h，即得Mem-Pam。

2.1.3 美金剛的制備 配制濃度為0.1 mol/L的鹽酸美金剛水溶液100 mL，在10 ℃冰水浴條件下，加入2 mol/L氫氧化鈉水溶液5 mL，攪拌5 min，抽濾收集濾餅，將濾餅水洗3次，25 ℃真空干燥24 h，即得美金剛游離堿(Mem)。

2.2 美金剛難溶性鹽的表征

2.2.1 紅外光譜(FT-IR) 分別取鹽酸美金剛、Mem-Ole、Mem-Ste、Mem-Pal和Mem-Pam置于樣品臺(tái)上，波數(shù)掃描范圍為500～4 000 cm-1，分辨率為4 cm-1，進(jìn)行FT-IR分析。

2.2.2 核磁共振氫譜(1H NMR) 取適量鹽酸美金剛、Mem-Ole、Mem-Ste、Mem-Pal溶于氘代氯仿，稱取適量Mem-Pam溶于氘代二甲基亞砜，400 MHz頻率照射，核磁共振波譜儀記錄圖譜。

2.2.3 X射線衍射(PXRD) 取適量鹽酸美金剛、棕櫚酸、雙羥萘酸、Mem-Pal和Mem-Pam，采用布魯克公司D2-Advance型X射線衍射儀進(jìn)行分析，CuKal輻射(30 kV，10 mA)，2θ角掃描范圍：10°～80°。

2.3 美金剛含量測(cè)定

2.3.1 美金剛含量測(cè)定方法 參照文獻(xiàn)[9]，采用柱前衍生化高效液相色譜法測(cè)定美金剛難溶性鹽中美金剛含量。

色譜條件：Agilent Extend C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-水，梯度洗脫：0 min(71%乙腈)→12 min(71%乙腈)→16 min(100%乙腈)→26 min(100%乙腈)→30 min(71%乙腈)→36 min(71%乙腈)；檢測(cè)波長(zhǎng)225 nm；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流速1.0 mL/min。

樣品溶液配制：取美金剛難溶性鹽適量，以體積分?jǐn)?shù)為6%的三乙胺乙腈溶液為溶劑，配制質(zhì)量濃度約200 μg/mL(以美金剛計(jì))的美金剛難溶性鹽溶液，作為供試品溶液。精密移取供試品溶液2 mL至10 mL量瓶中，依次加入體積分?jǐn)?shù)為4%的苯甲酰氯乙腈溶液2 mL、體積分?jǐn)?shù)為6%的三乙胺乙腈溶液4 mL，于40 ℃水浴孵育10 min，冷卻至室溫，用水稀釋至刻度，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。另取鹽酸美金剛對(duì)照品適量，同法測(cè)定。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得美金剛含量。

2.3.2 美金剛含量測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證 參照《中華人民共和國藥典》(2015版)《9101藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》對(duì)鹽酸美金剛及美金剛難溶性鹽中美金剛含量測(cè)定分析方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

專屬性：配制質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL(以美金剛計(jì))的鹽酸美金剛水溶液、Mem-Ole、Mem-Ste、Mem-Pal和Mem-Pam的三乙胺-乙腈溶液，以純水作空白溶液。分別精密移取上述溶液及空白溶液2.0 mL，按“2.3.1”項(xiàng)下操作處理，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

線性范圍：配制質(zhì)量濃度為0.10、0.15、0.20、0.25、0.30和0.35 mg/mL的鹽酸美金剛水溶液(以美金剛計(jì))，分別精密移取2.0 mL，按“2.3.1”項(xiàng)下操作處理，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

精密度：分別配制6份質(zhì)量濃度為0.20 mg/mL(以美金剛計(jì))的Mem-Ole、Mem-Ste、Mem-Pal和Mem-Pam的三乙胺-乙腈溶液，以鹽酸美金剛水溶液為對(duì)照品，分別精密移取2.0 mL，按“2.3.1”項(xiàng)下操作處理，注入液相色譜儀，記錄峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

準(zhǔn)確度：分別配制質(zhì)量濃度為0.16、0.20和0.24 mg/mL(以美金剛計(jì))的Mem-Ole、Mem-Ste、Mem-Pal和Mem-Pam的三乙胺-乙腈溶液，每個(gè)濃度平行配制3份。以鹽酸美金剛水溶液為對(duì)照品，分別精密移取2.0 mL，按“2.3.1”項(xiàng)下操作處理，注入液相色譜儀，記錄峰面積，計(jì)算準(zhǔn)確度。

2.4 美金剛難溶性鹽的平衡溶解度

分別配制pH 5.0、pH 6.0、pH 7.0、pH 7.4和pH 8.0的10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)，和蒸餾水。取適量以上溶劑分別置具塞錐形瓶中，分別加入過量Mem、Mem-Ole、Mem-Ste、Mem-Pal和Mem-Pam，于37 ℃恒溫水浴振蕩器中，100 r/min往復(fù)振搖，72 h后，10 000 r/min 離心10 min，取上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾后，按“2.3.1”項(xiàng)下操作處理，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算美金剛難溶性鹽在不同溶劑中的平衡溶解度。

2.5 美金剛難溶鹽納米混懸型長(zhǎng)效注射劑的制備

采用反溶劑-高壓均質(zhì)法制備美金剛難溶鹽的納米混懸型長(zhǎng)效注射劑。稱取處方量美金剛-油酸鹽(約含美金剛2.5 g)，溶解于二甲基亞砜10 mL，作為有機(jī)相；稱取蛋黃卵磷脂(EPC)1.0 g和TPGS 0.5 g分散至0.01 g/mL羧甲基纖維素鈉水溶液100 mL中，并加熱至70 ℃作為水相。在3 000 r/min高速攪拌條件下，將有機(jī)相加至水相中，攪拌3 min，得粗混懸液。將所制備粗混懸液迅速轉(zhuǎn)移至高壓均質(zhì)機(jī)中，80 MPa壓力下循環(huán)10次，得終混懸液。將所得終混懸液轉(zhuǎn)移至透析袋(截留相對(duì)分子質(zhì)量3 kD)中，以蒸餾水3 000 mL為透析介質(zhì)，透析2次，每3 h更換一次透析介質(zhì)，即得Mem-Ole納米混懸型長(zhǎng)效注射劑。同法制備Mem-Ste、Mem-Pal和Mem-Pam的納米混懸型長(zhǎng)效注射劑，以及Mem納米混懸液。

2.6 美金剛難溶鹽納米混懸型長(zhǎng)效注射劑的表征

2.6.1 粒徑及粒度分布 分別取美金剛難溶性鹽納米混懸型長(zhǎng)效注射劑20 μL，加入相應(yīng)美金剛難溶性鹽的飽和水溶液3 mL，采用NicompTMPSS380粒度測(cè)定儀，進(jìn)行粒度分析。

2.6.2 初步物理穩(wěn)定性考察 將美金剛難溶性鹽納米混懸型長(zhǎng)效注射劑，密封于西林瓶中，充氮?dú)廛埳w，分別置于4 ℃和37 ℃條件下。4 ℃樣品分別于1、15 和30 d取樣，進(jìn)行粒度分析；37 ℃樣品分別于1、5和10 d取樣，進(jìn)行粒度分析。

2.6.3 體外藥物釋放 采用透析法測(cè)定美金剛難溶性鹽納米混懸型長(zhǎng)效注射劑及美金剛納米混懸液的體外藥物釋放行為。精密移取納米混懸液(約含主藥25 mg，以美金剛計(jì))1 mL至裝有模擬體液(10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液，pH=7.4)1 mL的透析袋(截留相對(duì)分子質(zhì)量50 kD)中，兩端扎緊。將透析袋置于裝有模擬體液(10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液，pH=7.4)100 mL的具塞錐形瓶中，于37 ℃恒溫水浴振蕩器中，100 r/min往復(fù)振搖。分別于1、2、4、6、8、12、24、36、48、72、96、120、144和168 h，取出全部釋放介質(zhì)，同時(shí)補(bǔ)充釋放介質(zhì)100 mL。按“2.3.1” 項(xiàng)下測(cè)定釋放介質(zhì)中美金剛濃度，并計(jì)算藥物累積釋放百分比，繪制體外藥物釋放曲線。

3 結(jié)果和討論

3.1 美金剛難溶性鹽的制備及表征

3.1.1 美金剛難溶性鹽的制備 本研究選用油酸、硬脂酸、棕櫚酸和雙羥萘酸四種脂溶性酸為酸根，采用沉淀法制備了美金剛的四種難溶性鹽，包括Mem-Ole、Mem-Ste、Mem-Pal和Mem-Pam，其中Mem-Ole為黃色黏稠油狀物，收率為71.2%；Mem-Ste為類白色黏稠油狀物，產(chǎn)率為75.6%；Mem-Pal為類白色黏稠膏狀物，產(chǎn)率為76.8%；Mem-Pam為黃色固體粉末，產(chǎn)率為85.4%。

3.1.2 美金剛含量測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證 專屬性：空白水溶液、鹽酸美金剛、Mem-Ole、Mem-Ste、Mem-Pal和Mem-Pam經(jīng)衍生化處理后的色譜圖如圖1所示。圖1顯示，鹽酸美金剛及美金剛難溶性鹽經(jīng)衍生化反應(yīng)后美金剛保留時(shí)間為10.2～10.9 min，空白溶液經(jīng)衍生化反應(yīng)后在相同保留時(shí)間位置未見色譜峰。表明衍生化試劑對(duì)美金剛的測(cè)定無干擾，方法專屬性良好。

線性范圍：在0.1～0.35 mg/mL(以美金剛計(jì))濃度范圍內(nèi)，以美金剛衍生物峰面積對(duì)鹽酸美金剛濃度進(jìn)行線性回歸，回歸方程為y=6 217.4x-13.371，相關(guān)系數(shù)r=0.999 5，表明鹽酸美金剛在0.1～0.35 mg/mL(以美金剛計(jì))濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

精密度(重復(fù)性)：以鹽酸美金剛水溶液為對(duì)照，計(jì)算得Mem-Ole、Mem-Ste、Mem-Pal和Mem-Pam中美金剛平均含量分別為38.99%、38.78%、41.01%和47.98%，精密度(RSD，%)分別為0.94、0.71、0.52、1.0和0.86(n=6)，表明方法精密度良好。

準(zhǔn)確度：Mem-Ole高、中、低3個(gè)濃度回收率(%)分別為99.1、100.2和99.5；Mem-Ste高、中、低3個(gè)濃度回收率(%)分別為98.9、99.4和100.4；Mem-Pal高、中、低3個(gè)濃度回收率(%)分別為100.9、100.2和99.7；Mem-Pam高、中、低3個(gè)濃度回收率(%)分別為101.0、99.3和99.6。

最低定量下限：鹽酸美金剛最低定量下限為0.01 mg/mL，信噪比約為18。

上述結(jié)果表明，采用柱前衍生化高效液相色譜法測(cè)定美金剛難溶性鹽中美金剛含量，專屬性、線性范圍、精密度和準(zhǔn)確度均符合藥物分析方法學(xué)要求。

Figure1 HPLC chromatograms of purified water (Blank),memantine hydrochloride (Mem-HCl),memantine oleate (Mem-Ole),memantine stearate (Mem-Ste),memantine palmitate (Mem-Pal),and memantine pamoate (Mem-Pam)

3.1.3 美金剛難溶性鹽中美金剛的含量 采用柱前衍生化高效液相色譜法測(cè)定所制備的4種美金剛難溶性鹽中美金剛含量，Mem-Ole、Mem-Ste、Mem-Pal和Mem-Pam中美金剛含量分別為38.99%、38.78%、41.01%和47.98%，即4種難溶性鹽中美金剛與油酸、硬脂酸、棕櫚酸和雙羥萘酸的摩爾比分別約為1∶1、1∶1、1∶1和2∶1。

3.1.4 美金剛難溶性鹽的紅外圖譜 采用FT-IR對(duì)鹽酸美金剛、美金剛難溶性鹽進(jìn)行表征，結(jié)果如圖2所示。其中鹽酸美金剛紅外圖譜中1 637 cm-1處為胺離子(伯胺鹽)的不對(duì)稱彎曲振動(dòng)峰；油酸鈉、硬脂酸鈉、棕櫚酸鈉和雙羥萘酸紅外圖譜中，分別可在1 558、1 554、1 557和1 653 cm-1處觀察到油酸鈉、硬脂酸鈉和棕櫚酸鈉中羧酸鹽C==O伸縮振動(dòng)峰和雙羥萘酸中游離羧酸C==O伸縮振動(dòng)峰；所制備的4種美金剛難溶性鹽，美金剛-油酸鹽、美金剛-硬脂酸鹽、美金剛-棕櫚酸鹽和美金剛-雙羥萘酸鹽的紅外圖譜中均可觀察到胺離子(伯胺鹽)的不對(duì)稱彎曲振動(dòng)峰(分別為1 632、1 634、1 639 和1 638 cm-1處吸收峰)和羧酸鹽C==O伸縮振動(dòng)峰(分別為1 558、1 552、1 557和 1 546 cm-1處吸收峰)，均未在1 725～1 650 cm-1范圍內(nèi)觀察到游離羧酸C==O的紅外特征吸收峰。上述結(jié)果表明，美金剛中的-NH3與油酸、硬脂酸、棕櫚酸和雙羥萘酸中的-COOH通過離子鍵作用，形成了新的美金剛鹽，即美金剛-油酸鹽、美金剛-硬脂酸鹽、美金剛-棕櫚酸鹽和美金剛-雙羥萘酸鹽。

Figure2 Fourier transform infrared spectra of Mem-HCl,sodium oleate (Ole-Na),Mem-Ole,sodium stearate (Ste-Na),Mem-Ste,sodium palmitate (Pal-Na),Mem-Pal,pamoic acid (Pam) and Mem-Pam

3.1.5 美金剛難溶性鹽的1H NMR圖譜 采用1H NMR 對(duì)鹽酸美金剛、美金剛難溶性鹽進(jìn)行表征，其1H NMR 圖譜及特征質(zhì)子峰如圖3所示。其中鹽酸美金剛δa=0.86處為甲基質(zhì)子峰，δb=1.89處為六元環(huán)亞甲基質(zhì)子峰，δc=8.34處為伯胺鹽質(zhì)子峰。Mem-Ole的1H NMR圖譜中，既可觀察到上述的美金剛特征質(zhì)子峰，也可觀察到油酸的特征質(zhì)子峰，其中δae=0.86處為油酸和美金剛的甲基質(zhì)子峰，δd=2.16處為油酸的亞甲基質(zhì)子峰，δc=4.75處為伯胺鹽質(zhì)子峰。Mem-Ste的1H NMR圖譜中，同樣可觀察到美金剛和硬脂酸的特征質(zhì)子峰，其中δah=0.86處為硬脂酸和美金剛的甲基質(zhì)子峰，δg=2.16處為硬脂酸的亞甲基質(zhì)子峰，δc=4.67處為伯胺鹽質(zhì)子峰。Mem-Ste的1H NMR圖譜中，可觀察到美金剛和棕櫚酸的特征質(zhì)子峰，其中δaj=0.86處為棕櫚酸和美金剛的甲基質(zhì)子峰，δi=2.20處為棕櫚酸的亞甲基質(zhì)子峰，δc=7.98處為伯胺鹽質(zhì)子峰。Mem-Pam的1H NMR圖譜中，可觀察到美金剛和棕櫚酸的特征質(zhì)子峰，其中δa=0.86處為美金剛的甲基質(zhì)子峰，δk=4.66處為雙羥萘酸的亞甲基質(zhì)子峰，δc=7.89處為伯胺鹽質(zhì)子峰。此外，在四種難溶性鹽的1H NMR 圖譜中均未觀察到游離羧基質(zhì)子峰和游離伯氨基質(zhì)子峰的化學(xué)位移。上述結(jié)果表明，本研究成功制備了新的美金剛鹽，即美金剛-油酸鹽、美金剛-硬脂酸鹽、美金剛-棕櫚酸鹽和美金剛-雙羥萘酸鹽。

3.1.6 美金剛難溶性鹽的X射線衍射圖譜 X射線衍射可用于固態(tài)藥物晶型的快速確證[10]，由于Mem-Ole和Mem-Ste為黏稠油狀物，因此，本研究?jī)H對(duì)鹽酸美金剛、棕櫚酸、雙羥萘酸、Mem-Pal和Mem-Pam進(jìn)行了X射線衍射分析，結(jié)果如圖4所示。其中鹽酸美金剛(Mem HCl)特征衍射峰位于2θ=10.84°、12.51°、14.11°、16.57°、18.80°處；棕櫚酸(Pal)特征衍射峰位于2θ=12.61°、21.63°、24.35°處；Mem-Pal特征衍射峰位于2θ=14.71°、15.70°、17.63°處，同時(shí)可觀察到無定型區(qū)域，未觀察到鹽酸美金剛和棕櫚酸的特征衍射峰，表明Mem-Pal是以晶體和無定型混合形式存在的美金剛棕櫚酸鹽。雙羥萘酸(Pam)特征衍射峰位于2θ=11.01°、15.51°、19.24°、23.03°、24.36°、26.16°、29.80°、33.71°處；Mem-Pam特征衍射峰位于2θ=10.95°、12.02°、14.14°、16.11°、17.27°、20.35°、21.07°、22.06°處，未觀察到鹽酸美金剛和雙羥萘酸的特征衍射峰，表明Mem-Pam是以晶體形式存在的美金剛雙羥萘酸鹽。

Figure31H NMR spectra of Mem-HCl,Mem-Ole,Mem-Ste,Mem-Pal and Mem-Pam

Figure4 Powder X-ray diffraction (XRD) patterns of Mem-HCl,Pal,Mem-Pal,Pam and Mem-Pam

3.2 美金剛難溶性鹽的平衡溶解度

藥物溶解度是影響藥物溶出速率或釋放速度的重要因素之一，通常藥物溶解度越小，藥物釋放速度越慢。難溶性鹽技術(shù)是通過成鹽技術(shù)降低藥物溶解度，延長(zhǎng)藥物釋放時(shí)間。因此，本研究系統(tǒng)研究了所制備美金剛難溶性鹽在不同介質(zhì)中的平衡溶解度，以初步評(píng)價(jià)其延緩藥物釋放性能。

3.2.1 不同酸根對(duì)美金剛難溶性鹽平衡溶解度的影響 本研究考察了4種美金剛難溶性鹽及美金剛在水及模擬體液(10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液，pH=7.4)中的平衡溶解度，結(jié)果如表1所示。

結(jié)果顯示，與美金剛游離堿相比，將美金剛制備成難溶性鹽可顯著降低藥物在水及模擬體液中的平衡溶解度。與Mem相比，Mem-Ole、Mem-Ste、Mem-Pal和Mem-Pam在水中溶解度分別降低了97.1%、95.6%、99.4%和99.6%，在模擬體液中溶解度分別降低了95.1%、96.2%、96.7%和99.6%。其中，Mem-Pam在水及模擬體液中平衡溶解度最低，均低于0.07 mg/mL，有望在給藥部位獲得優(yōu)良的緩釋作用。

Table1 Equilibrium solubility of different salt forms of memantine in water and 10 mmol/L phosphate buffer solution (PBS,pH 7.4)

Salt formEquilibrium solubility in water/(mg/mL)Equilibrium solubility in 10 mmol/L pH 7.4 PBS/(mg/mL)Mem15.9418.40Mem-Ole0.454 60.908 9Mem-Ste0.700 80.701 7Mem-Pal0.087 80.607 2Mem-Pam0.057 60.065 6

3.2.2 pH對(duì)不同美金剛難溶性鹽平衡溶解度的影響 肌肉注射通常會(huì)引起機(jī)體炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生大量炎性細(xì)胞如巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致注射部位pH降低[11]。因此，本研究考察了pH對(duì)美金剛難溶性鹽平衡溶解度的影響，結(jié)果如圖5所示。

結(jié)果顯示，Mem-Ole和Mem-Pal在磷酸鹽緩沖液中的平衡溶解度隨pH降低而顯著增加，pH為5.0時(shí)，平衡溶解度分別高達(dá)1.877和1.118 mg/mL。Mem-Ste平衡溶解度也具有較強(qiáng)的pH依賴性，當(dāng)pH>7時(shí)，其平衡溶解度隨pH增加而增加；當(dāng)pH<7時(shí)，其平衡溶解度隨pH降低而增加；pH為5.0時(shí)，Mem-Ste平衡溶解度高達(dá)1.017 mg/mL。在pH 5～8范圍內(nèi)，Mem-Pam平衡溶解度幾乎無pH依賴性，且均低于0.07 mg/mL。這可能是由于油酸、硬脂酸和棕櫚酸的pKa較高分別為4.99、4.95和4.95，當(dāng)pH為5.0時(shí)，美金剛與上述3種脂肪酸之間的離子鍵減弱，導(dǎo)致溶解度顯著增加；而雙羥萘酸的pKa較低，約為2.67，在pH 5～8范圍內(nèi)，與美金剛之間的離子鍵結(jié)合牢固，溶解度幾乎無顯著變化。

Figure5 Equilibrium solubility of different salt forms of memantine in 10 mmol/L phosphate buffer solution (PBS) with different pH values

上述結(jié)果表明，4種難溶性鹽中，Mem-Pam在模擬體液環(huán)境中溶解度最低，低于0.07 mg/mL，并且其平衡溶解度在pH 5～8范圍內(nèi)幾乎無明顯變化，無pH依賴性，有望在給藥部位獲得優(yōu)良的緩釋作用。

3.3 美金剛難溶性鹽長(zhǎng)效注射劑的制備

參照文獻(xiàn)[12]，以蛋黃卵磷脂和TPGS(2∶1)為穩(wěn)定劑，采用反溶劑-高壓均質(zhì)法制備美金剛難溶鹽的納米混懸型長(zhǎng)效注射劑。以粒徑及粒度分布為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)穩(wěn)定劑與藥物的比例進(jìn)行了考察，結(jié)果如表2所示。

結(jié)果顯示，隨著穩(wěn)定劑與藥物(以美金剛計(jì))比例的增加，所制備的4種美金剛難溶性鹽及美金剛納米混懸劑的粒徑均逐漸減小。由于粒徑是影響固體藥物溶解速率(即藥物釋放速度)的重要因素，最終以穩(wěn)定劑與藥物比例為3∶5，制備美金剛納米混懸型長(zhǎng)效注射劑，以使粒徑對(duì)藥物釋放行為的影響最小化。

Salt form1∶5Size/nmPDIa3∶5Size/nmPDI5∶5Size/nmPDIMem760.5±215.10.399341.1±192.10.317203.9±120.90.352Mem-Ole240.6±127.30.280203.9±86.20.179199.4±122.80.379Mem-Ste237.0±141.50.356185.6±96.00.267154.4±76.40.245Mem-Pal538.0±592.31.212195.9±127.90.426176.9±77.70.193Mem-Pam755.5±268.20.126599.1±215.10.129620.0±116.00.035

aPolymey disperse index of memantine long-acting injectable nanosuspensions

3.4 美金剛難溶性鹽長(zhǎng)效注射劑的物理穩(wěn)定性

納米混懸劑屬于熱力學(xué)不穩(wěn)定體系，在貯存過程中極易發(fā)生沉降、聚集等物理穩(wěn)定性問題。因此，本研究以粒徑為評(píng)價(jià)指標(biāo)，初步考察了美金剛難溶性鹽納米混懸液在4 ℃條件下的物理穩(wěn)定性，以初步確定美金剛難溶性鹽長(zhǎng)效注射劑的貯存形式。同時(shí)，本文還考察了納米混懸液在37 ℃條件下的物理穩(wěn)定性，以預(yù)測(cè)美金剛難溶性鹽長(zhǎng)效注射劑在體外釋放及經(jīng)肌肉注射后的穩(wěn)定性，結(jié)果如表3所示。

由表3可知，在4 ℃貯存30 d時(shí)，Mem、Mem-Ole、Mem-Ste和Mem-Pal納米混懸液的粒徑均明顯增加，而Mem-Pam納米混懸液粒徑略有增加。上述結(jié)果表明，Mem-Pam納米混懸液物理穩(wěn)定性顯著優(yōu)于其他難溶性鹽，但在4 ℃貯存30 d后粒徑仍略有增加，后續(xù)研究中可通過凍干來改善制劑的物理穩(wěn)定性。

37 ℃ 條件下貯存1 d時(shí)，Mem、Mem-Ole和Mem-Pal納米混懸液的粒徑已顯著增加，物理穩(wěn)定性較差，5 d時(shí)粒徑已增加至400 nm以上，10 d時(shí)，Mem和Mem-Ole納米混懸液可分別觀察到分層和絮凝現(xiàn)象；Mem-Ste納米混懸液的粒徑也隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增加，但仍為均一混懸液；Mem-Pam納米混懸液37 ℃貯存10 d時(shí)，與0時(shí)相比，平均粒徑約增加了100 nm，物理穩(wěn)定性顯著優(yōu)于其他難溶性鹽。上述結(jié)果提示，在體外釋放過程中，由于Mem、Mem-Ole、Mem-Ste和Mem-Pal納米混懸液的物理穩(wěn)定性較差，釋藥前期粒徑較小，藥物釋放速度快，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，粒子不斷聚集，粒徑增加，可能會(huì)導(dǎo)致后期藥物釋放度過慢。Mem-Pam納米混懸液的物理穩(wěn)定性較好，粒徑略有增加，有望獲得更平穩(wěn)的藥物釋放速度。

Salt form04 °C11530 d37 °C1510 dMem341.1±192.1331.2±181.9362.1±179.2371.2±199.2431.2±296.4769.3±456.2DelaminationMem-Ole203.9±86.2203.6±142.6226.3±167.7269.3±189.2278.9±169.3637.3±421.3FlocculationMem-Ste185.6±96.0189.3±101.2201.3±76.1221.4±91.2201.3±73.4234.4±134.4456.4±163.1Mem-Pal195.9±127.9214.3±145.1227.4±103.1273.2±154.3303.1±193.1404.2±201.3576.7±321.3Mem-Pam599.1±215.1590.5±204.3604.2±241.1621.9±215.4590.5±206.1634.0±232.1701.0±208.3

3.5 體外藥物釋放

本研究采用透析法測(cè)定了Mem、Mem-Ole、Mem-Ste、Mem-Pal和Mem-Pam納米混懸劑在pH 7.4 10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(模擬體液)中的體外藥物釋放行為，結(jié)果如圖6所示。

結(jié)果顯示，美金剛游離堿所制備的納米混懸劑在模擬體液環(huán)境中2 h時(shí)，累積藥物釋放量已達(dá)到90%以上，無明顯緩釋作用。將美金剛制備成其硬脂酸鹽，緩釋時(shí)間可延長(zhǎng)至2 d。將美金剛制備成其棕櫚酸鹽和油酸鹽，即Mem-Pal和Mem-Ole，緩釋時(shí)間可延長(zhǎng)至5 d，但前期藥物釋放速度較快，1 d時(shí)累積藥物釋放量均約為60%，1 d后緩慢釋放藥物。而將美金剛制備成其雙羥萘酸鹽，緩釋時(shí)間延長(zhǎng)至7 d，且藥物釋放速度較為平穩(wěn)，2 h藥物釋放量不足5%，1 d時(shí)累積藥物釋放量約為25%。采用零級(jí)釋放方程對(duì)Mem-Pam納米混懸劑體外藥物釋放曲線進(jìn)行擬合，擬合方程為y=0.549 9x+7.594 2(r=0.988 3)，表明Mem-Pam納米混懸劑呈現(xiàn)近零級(jí)藥物釋放特點(diǎn)。

上述結(jié)果顯示，與美金剛游離堿相比，4種美金剛難溶性鹽均具有一定的緩釋作用，藥物釋放速度由大到小依次為：Mem-Ste、Mem-Pal≈Mem-Ole、Mem-Pam。藥物釋放速度與4種美金剛難溶性鹽在模擬體液中的平衡溶解度成正比，其中Mem-Ole在模擬體液中平衡溶解度高于Mem-Ste和Mem-Pal，但其藥物釋放速度卻低于Mem-Ste和Mem-Pal，可能是由于Mem-Ole納米混懸劑穩(wěn)定性較差，在釋放過程中粒子發(fā)生聚集，并有少量油滴黏附于透析袋壁，導(dǎo)致其藥物釋放速度略小，且后期釋放不完全。Mem-Pam由于在模擬體液中平衡溶解度僅為0.065 6 mg/mL，與美金剛游離堿相比，約降低了99.6%，并且其在37 ℃條件下粒徑幾乎無明顯變化，在模擬體液中呈現(xiàn)近零級(jí)藥物釋放特點(diǎn)，可緩慢釋藥7 d，有望在體內(nèi)獲得平穩(wěn)的血藥濃度。

4 結(jié) 論

本研究采用難溶性鹽技術(shù)，制備了一系列美金剛難溶性鹽納米混懸型長(zhǎng)效注射劑，包括美金剛油酸鹽(Mem-Ole)、美金剛硬脂酸鹽(Mem-Ste)、美金剛棕櫚酸鹽(Mem-Pal)和美金剛雙羥萘酸鹽(Mem-Pam)納米混懸型長(zhǎng)效注射劑。采用FT-IR、1H NMR和PXRD對(duì)4種難溶性鹽進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，表明其均以美金剛鹽形式存在；與美金剛游離堿相比，Mem-Ole、Mem-Ste、Mem-Pal和Mem-Pam在模擬體液中的平衡溶解度分別降低了95.1%、96.2%、96.7%和99.6%，其中，Mem-Pam在pH 5～8范圍內(nèi)的模擬體液中平衡溶解度均低于0.07 mg/mL。體外藥物釋放實(shí)驗(yàn)表明，與美金剛納米混懸劑相比，4種美金剛難溶性鹽納米混懸劑均具有一定的緩釋作用，藥物釋放速度由大到小依次為：Mem-Ste、Mem-Pal≈Mem-Ole、Mem-Pam。其中Mem-Pam納米混懸型長(zhǎng)效注射劑在模擬體液中可緩釋7 d，藥物釋放曲線符合零級(jí)藥物釋放方程(y=0.549 9x+7.594 2，r=0.988 3)，有望在體內(nèi)獲得平穩(wěn)的血藥濃度，后續(xù)將通過藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)進(jìn)一步確證。