毛萼香茶菜中黃酮和二萜化合物的分離制備及其抗病毒活性

王 俊，蔡靈巧，嚴 冬，郭 敏，王 慶，張 健，殷志琦

(1中國藥科大學中藥學院中藥制藥系，南京 210009；2江蘇省中醫(yī)藥研究院轉(zhuǎn)化醫(yī)學實驗室，南京 210028；3南京中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，南京 210028；4昆明生達制藥有限公司，昆明 650033)

毛萼香茶菜[Isodoneriocalyx(Dunn.) Hara]為唇形科(Labiatae)香茶菜屬植物，多年生草本或灌木，俗名火麻根、虎尾草和大馬鞭稍等，主要分布在我國的云南、貴州南部、四川西部及廣西西部，生長于海拔750～2 600 m的山坡陽處灌叢中。民間常用其葉治香港腳、根止瀉止痢[1-2]，現(xiàn)代藥理研究表明其主要有抗腫瘤、抗菌、抗炎和抗病毒等作用。

目前以毛萼香茶菜乙醇提取物作為主要成分的毛萼香茶菜清熱利咽片已上市銷售，用于緩解風熱上擾型急性咽炎引起的咽痛。這種上呼吸道感染引起的咽炎疼痛，常與流感病毒和呼吸道合胞病毒(RSV)感染相關(guān)。因此，推測毛萼香茶菜乙醇提取物具有抗病毒作用，但其作用物質(zhì)基礎(chǔ)并不明確。據(jù)報道，毛萼香茶菜中的化合物類型主要包括二萜、三萜、黃酮和其他類，尤以二萜中的對映-貝殼杉烷型二萜為主。而從單體化合物的含量上來看，對映-貝殼杉烷型二萜中的毛萼晶D和假細錐甲素以及黃酮中的8-羥基薊黃素和薊黃素均有報道分離得到克級以上，都屬于該植物中含量較高的成分[3-6]。而這些成分是否是毛萼香茶菜抗病毒活性成分仍有待研究。流感病毒中以甲型流感病毒最易發(fā)生變異，危害性大，故本研究中所選用的病毒株包括較具代表性的甲型流感病毒H1N1、H3N2以及RSV。因此，本研究擬以毛萼香茶菜為原料，利用現(xiàn)代柱色譜等分離技術(shù)制備該植物中的毛萼晶D、假細錐甲素、8-羥基薊黃素和薊黃素，并考察其體外抗流感病毒和抗RSV的活性，以期發(fā)現(xiàn)毛萼香茶菜抗病毒活性的藥效成分，為其臨床用藥提供科學依據(jù)。

1 材 料

1.1 藥品和試劑

毛萼香茶菜乙醇提取物(昆明生達制藥有限公司，批號20170213)；奧司他韋羧酸鹽(MedChem Express公司，批號HY-17016)，臨用前以生理鹽水配制成1 mg/mL的母液，以孔徑0.22 μm無菌濾膜過濾除菌，分裝凍存于-20 ℃?zhèn)溆?；MTT(合肥Bio Sharp公司)；DMEM和胎牛血清(美國Gibco公司)。

1.2 儀 器

Bruker Avance-300及Bruker Avance-500型核磁共振波譜儀(瑞士Bruker公司)；Waters Alliance半制備液相色譜儀配備Waters-Pack ODS半制備型色譜柱(250 mm×20 mm,5 μm)；iMark酶標儀(美國Bio-Rad公司)；倒置顯微鏡(上海長方光學儀器有限公司)。

1.3 病毒和細胞

流感病毒株A/FM1/1/47(H1N1)、A/Beijing/32/92(H3N2)，呼吸道合胞病毒(RSV)Long株、狗腎傳代細胞(MDCK細胞株)、人宮頸癌細胞(HeLa細胞株)均由中國藥科大學微生物學與免疫學實驗室提供；流感病毒株H1N1、H3N2經(jīng)雞胚(SPF級)傳代培養(yǎng)，收集尿囊液，經(jīng)血凝試驗測定病毒滴度為1∶512后，分裝于-80 ℃保存；呼吸道合胞病毒(RSV)Long株接種于HeLa細胞中傳代培養(yǎng)，分裝于-80 ℃保存。

2 方 法

2.1 化合物的分離制備

毛萼香茶菜乙醇提取物加水混懸，依次經(jīng)等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分別萃取，得到對應的萃取部位。取乙酸乙酯萃取部位(0.8 kg)經(jīng)硅膠柱色譜，以氯仿-丙酮(1∶0,9∶1,8∶2,7∶3,1∶1,0∶1)梯度洗脫，TLC薄層檢識，得到亞餾分(Fr.1～Fr.7)。Fr.1(128 g)經(jīng)硅膠柱色譜，以石油醚-乙酸乙酯(15∶1,10∶1,7∶1,0∶1)梯度洗脫，TLC薄層檢識，得到餾分(Fr.1-1～Fr.1-4)。Fr.1-2(30 g)經(jīng)凝膠柱色譜、反相ODS柱色譜及半制備型高效液相色譜(甲醇-水，63∶37)分離得到化合物3(1.8 g)、4(1.4 g)。Fr.2 (94.1 g)經(jīng)硅膠柱色譜，以石油醚-丙酮(5∶1、0∶1)梯度洗脫，TLC薄層檢識，得到餾分(Fr.2-1～Fr.2-3)。Fr.2-3(43 g)經(jīng)反相ODS柱色譜及半制備型高效液相色譜(甲醇-水，68∶32)分離得到化合物1(1.1 g)、2(1.5 g)。

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

通過核磁共振波譜儀分析得到化合物1～4的1H NMR、13C NMR圖譜。

2.3 化合物對MDCK細胞和HeLa細胞的毒性作用

將毛萼香茶菜乙醇提取物用DMSO配制成100 mg/mL母液，4個單體化合物用DMSO分別配制成100 mmol/L母液，-20 ℃保存。乙醇提取物用無血清DMEM培養(yǎng)基依次稀釋成10，5，2.5，1.25，0.63，0.31，0.15，0.08 μg/mL，化合物依次稀釋成800，400，200，100，50，25，12.5，6.25 μmol/L。MDCK細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基按每毫升5×104個細胞的濃度接種到96孔板中，每孔100 μL，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜形成細胞單層。棄去上清液，用PBS將細胞清洗2次，加入配好的不同濃度的藥物，每孔100 μL，同時設(shè)置不加藥物的正常細胞組、加含1% DMSO的培養(yǎng)液的溶劑對照組，每組設(shè)置4個復孔。置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)3 d逐日觀察藥液對細胞有無毒性作用。培養(yǎng)72 h后，用MTT法測定細胞活力，確定乙醇提取物和化合物最大無毒濃度。實驗重復3次，計算乙醇提取物和化合物對MDCK細胞的半數(shù)毒性濃度(CC50)。

將MDCK細胞替換為HeLa細胞，以相同方法測定對H1N1病毒有較好抑制效果的化合物對HeLa細胞的毒性作用。

2.4 病毒毒力測定

將-80 ℃保存的流感病毒尿囊液和RSV病毒以倍比梯度稀釋成11個濃度，分別感染在96孔板中長成單層的MDCK細胞和HeLa細胞，每個濃度設(shè)置4個復孔，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，觀察細胞病變，細胞病變程度評價方法：1%～25%為“+”，26%～50%為“2+”，51%～75%為“3+”，76%～100%為“4+”，以恰好2孔以上的細胞病變程度達到“2+”時對應的病毒濃度來計算病毒半數(shù)細胞感染量(TCID50)。

2.5 化合物對流感病毒和RSV病毒的體外抑制作用

根據(jù)細胞毒性實驗結(jié)果，將毛萼香茶菜乙醇提取物和4個化合物在無細胞毒濃度范圍內(nèi)稀釋成相應濃度梯度，分別以下列方法測定其體外抗病毒活性。

MDCK細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基按每毫升5×104個細胞的濃度接種到96孔板中，每孔100 μL，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜形成細胞單層。棄去上清液，細胞用PBS洗滌2次，加入100 TCID50流感病毒H1N1或H3N2感染細胞，每孔100 μL，37 ℃孵育2 h后，棄去病毒液。分別加入含不同濃度藥物的細胞維持液(含1%血清的DMEM培養(yǎng)基)，每孔100 μL，同時設(shè)正常細胞對照組、病毒對照組及陽性對照藥奧司他韋羧酸鹽(10 μmol/L)組，每組設(shè)置4個復孔。置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，每日觀察細胞病變。并用MTT法測定細胞活力，實驗共重復3次，計算樣品對病毒的抑制率、半數(shù)有效濃度(EC50)和選擇指數(shù)(SI)。

將MDCK細胞替換為HeLa細胞，以相同方法測定對H1N1病毒有較好抑制效果的單體化合物對RSV病毒的體外抑制作用。

病毒抑制率(%)=(加藥組吸收度-病毒對照組吸收度)/(正常細胞對照組吸收度-病毒對照組吸收度)×100；選擇指數(shù)SI=CC50/EC50。

2.6 數(shù)據(jù)分析

Figure1 Chemical structures of compounds1-4

3 結(jié) 果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 橘色針晶(氯仿-甲醇)，濃硫酸-香草醛反應顯黃色。1H NMR (DMSO-d6,300 MHz)δ：12.46 (1H,s,5-OH),10.34(1H,s,4′-OH),9.28(1H,s,8-OH),8.03(2H,d,J=8.6 Hz,H-2′,6′),6.95(2H,d,J=8.5 Hz,H-3′,5′),6.83(1H,s,H-3),3.95(3H,s,7-OCH3),3.84(3H,s,6-OCH3)。13C NMR(DMSO-d6,75 MHz)δ：182.7(C-4),164.1(C-2),161.3(C-4′),148.0(C-7),144.6(C-5),141.3(C-9),136.1(C-6),130.5(C-8),128.7(C-2′),128.7(C-6′),121.2(C-1′),115.9(C-3′),115.9(C-5′),106.3(C-10),102.4(C-3),61.1(7-OCH3),60.4(6-OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[3]對照基本一致，故確定化合物1為8-羥基薊黃素(isothymusin)。

化合物2黃色片晶(甲醇)，濃硫酸-香草醛反應顯黃色。1H NMR(DMSO-d6,300 MHz)δ：12.93(1H,s,5-OH),10.37(1H,s,4′-OH),7.96(2H,d,J=8.5 Hz,H-2′,6′),6.94(2H,d,J=8.4 Hz,H-3′,5′),6.91(1H,s,H-8),6.83(1H,s,H-3),3.93(3H,s,7-OCH3),3.74(3H,s,6-OCH3)。13C NMR(DMSO-d6,75 MHz)δ：182.1(C-4),164.0(C-2),161.2(C-4′),158.5(C-7),152.5(C-5),152.0(C-9),131.8(C-6),128.4(C-2′),128.4(C-6′),121.0(C-1′),115.9(C-3′),115.9(C-5′),105.0(C-10),102.6(C-3),91.5(C-8),59.9(6-OCH3),56.3(7-OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[3]對照基本一致，故確定化合物2為薊黃素(cirsimaritin)。

化合物3白色針晶(甲醇)，濃硫酸-香草醛反應顯墨綠色。1H NMR(C5D5N,500 MHz)δ：10.80(1H,s,6-OH),6.84(1H,t,J=2.6 Hz,H-15α),5.26(1H,d,J=2.1 Hz,H-17a),5.05(1H,d,J=2.7 Hz,H-17b),4.79(1H,d,J=8.9 Hz,H-20a),4.39(1H,d,J=9.0 Hz,H-20b),3.87(1H,t,J=2.7 Hz,H-3β),3.73(1H,br.d,J=7.6 Hz,H-9β),3.04(1H,dd,J=19.2,3.4 Hz,H-2α),2.90(1H,dd,J=19.3,2.1 Hz,H-2β),2.69(1H,br.s,H-13α),2.22(1H,m,H-11β),1.98(3H,s,15-OAc),1.81(3H,s,Me-18),1.32(3H,s,Me-19)。13C NMR(C5D5N,125 MHz)δ：206.0(C-1),194.2(C-7),170.3(OAc),152.3(C-16),145.9(C-6),132.8(C-5),108.2(C-17),77.6(C-3),76.1(C-15),67.1(C-20),54.1(C-8),53.6(C-10),41.7(C-2),41.3(C-13),40.6(C-4),37.8(C-14),31.8(C-12),27.7(C-9),23.3(C-18),21.6(C-19),20.5(OAc),19.4(C-11)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[7]對照基本一致，故確定化合物3為假細錐甲素(coetsoidin A)。

化合物4白色片晶(甲醇)，濃硫酸-香草醛反應顯紫紅色。1H NMR(C5D5N,500 MHz)δ：8.46(1H,s,OH-7β),6.17(1H,s,H-15α),5.69(1H,d,J=9.2 Hz,H-6α),5.18(1H,br.s,H-17a),5.15(1H,br.s,H-17b),4.63(1H,d,J=10.2 Hz,H-20a),4.17(1H,d,J=10.1 Hz,H-20b),2.34(3H,s,15-OAc),2.14(3H,s,6-OAc),0.96(3H,s,Me-18),0.92(3H,s,Me-19)。13C NMR(C5D5N,125 MHz)δ：212.4(C-1),170.9(15-OAc),170.7(6-OAc),158.7(C-16),109.7(C-17),96.3(C-7),75.3(C-15),74.0(C-6),64.9(C-20),54.3(C-5),52.2(C-8),49.1(C-10),42.8(C-9),38.5(C-3),36.0(C-13),35.7(C-2),32.7(C-4),32.3(C-12),29.5(C-18),27.1(C-14),23.0(C-19),22.0(15-OAc),21.2(6-OAc),17.9(C-11)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[8]對照基本一致，故確定化合物4為毛萼晶D(maoecrystal D)。

3.2 化合物對MDCK細胞的毒性作用

在0～10 μg/mL范圍內(nèi)，毛萼香茶菜乙醇提取物對MDCK細胞正常生長沒有影響，表明在此濃度范圍內(nèi)乙醇提取物無明顯毒性作用。4個單體化合物在較低濃度時(<100 μmol/L)對MDCK細胞的正常生長均沒有明顯影響，細胞形態(tài)在鏡下未見明顯改變。而隨著濃度的增大，化合物1和3兩組的細胞活力呈現(xiàn)濃度依賴性降低，化合物2和4兩組的細胞活力未受明顯影響。4個化合物對MDCK細胞沒有明顯細胞毒性的濃度范圍分別為：化合物1(0～100 μmol/L)、化合物2(0～800 μmol/L)、化合物3(0～400 μmol/L)、化合物4(0～800 μmol/L)，4個化合物對MDCK細胞的CC50分別為363.1±9.2、>800、562.3±8.7和>800 μmol/L。

3.3 化合物對HeLa細胞的毒性作用

化合物1和2對HeLa細胞的毒性作用比對MDCK細胞的毒性作用要明顯，在0～100 μmol/L時，其細胞活力隨著化合物濃度增大均呈現(xiàn)濃度依賴性降低。經(jīng)計算可得其CC50分別為(51.8±4.93)和(24.5±3.75) μmol/L。

3.4 病毒毒力測定

通過觀察細胞病變程度發(fā)現(xiàn)，流感病毒H1N1的TCID50為1×10-4/100 μL，流感病毒H3N2的TCID50為1×10-3/100 μL，RSV的TCID50為1×10-3/100 μL。

3.5 化合物對流感病毒H1N1的體外抑制作用

流感病毒H1N1感染MDCK細胞后，導致細胞發(fā)生病變，細胞活力明顯降低。在安全濃度范圍內(nèi)考察化合物對流感病毒H1N1感染MDCK細胞的抑制作用，結(jié)果顯示，隨著毛萼香茶菜乙醇提取物濃度遞增，其病毒抑制率逐漸上升，在5 μg/mL時抑制率已達60%，表明毛萼香茶菜乙醇提取物對H1N1病毒有較好的抑制作用。而化合物1和2在較低濃度時(<30 μmol/L)對H1N1病毒就表現(xiàn)出較好的抑制作用，化合物3和4在較高濃度時(>200 μmol/L)才表現(xiàn)出明顯的抑制作用。4個化合物對流感病毒H1N1的EC50分別為(14.45±4.90)、(24.54±3.82)、(257.0±10.7)和(177.8±7.6) μmol/L；選擇指數(shù)SI分別為25.13、32.60、2.19、4.50；陽性藥奧司他韋羧酸鹽在實驗濃度(10 μmol/L)下對H1N1病毒的抑制率為(56.74±7.48)%。

3.6 化合物對流感病毒H3N2的體外抑制作用

對流感病毒H1N1抑制活性較好的化合物1和2，繼續(xù)考察它們在安全濃度下對流感病毒H3N2感染MDCK細胞的抑制作用。結(jié)果表明，化合物1和2在實驗濃度范圍內(nèi)對H3N2病毒的抑制作用不如對H1N1病毒的抑制作用，隨著實驗濃度的增大，其抑制率并沒有顯著提高。陽性藥奧司他韋羧酸鹽在實驗濃度(10 μmol/L)下對H3N2的抑制率可達(65.66±4.59)%。

3.7 化合物對RSV病毒的體外抑制作用

對流感病毒H1N1抑制活性較好的化合物1和2，繼續(xù)考察它們在安全濃度下對RSV感染HeLa細胞的抑制作用。結(jié)果表明，化合物1和2在實驗濃度范圍內(nèi)對RSV的抑制作用也不如對H1N1病毒的抑制作用明顯，其抑制率基本維持在40%以下。陽性藥奧司他韋羧酸鹽在實驗濃度(10 μmol/L)下對RSV的抑制率為(43.67±2.44) %。

4 討 論

本研究通過色譜分離技術(shù)從毛萼香茶菜乙醇提取物中分離制備了4個含量較高的化合物，分別鑒定為2個黃酮類成分：8-羥基薊黃素(1)和薊黃素(2)，以及2個對映-貝殼杉烷二萜類成分：假細錐甲素(3)和毛萼晶D(4)，并考察了其體外抗病毒活性。結(jié)果表明，毛萼香茶菜乙醇提取物及化合物1～4對流感病毒H1N1均具有一定的抑制作用，兩個黃酮類成分的抑制活性更顯著，但其對流感病毒H3N2和RSV的抑制作用則相對較弱。

有研究報道雞血藤水提物對流感病毒H1N1的EC50為74.5 μg/mL[9]，本研究中毛萼香茶菜乙醇提取物在5 μg/mL時對流感病毒H1N1的抑制作用已達60%。但該乙醇提取物樣品較低的溶解度導致無法精確計算其EC50。以上初步活性測試結(jié)果顯示，毛萼香茶菜乙醇提取物可能具有較優(yōu)的抗病毒作用，值得深入探究。

抗病毒是黃酮類成分顯著藥理活性之一。已有報道木犀草素對流感病毒H1N1的EC50為11.282 μg/mL[10]，黃芩苷對流感病毒H1N1、H3N2的EC50分別為43.3和104.9 μg/mL[11]。而本研究中的8-羥基薊黃素(1)和薊黃素(2)對流感病毒H1N1的EC50經(jīng)單位換算后分別為4.77和7.71 μg/mL，顯示了優(yōu)于木犀草素和黃芩苷的抗病毒活性，也與前人報道的薊黃素抗病毒活性結(jié)果一致[12]。此外，在較低濃度下薊黃素(2)就顯示了較好的抑制H1N1病毒活性，濃度遞增后其抑制作用反而降低，而這兩個黃酮對H3N2和RSV的抑制作用均不如對H1N1的抑制作用，推測這可能與化合物結(jié)構(gòu)以及抗病毒作用機制有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)D環(huán)上含有α,β-不飽和酮結(jié)構(gòu)的對映-貝殼杉烷二萜具有顯著的抗腫瘤和抗菌等活性[13]，但其是否具有良好的抗病毒活性并未見報道。本研究獲得的2個對映-貝殼杉烷二萜沒有顯示出類似于8-羥基薊黃素(1)和薊黃素(2)的明顯抗病毒活性，可能與該結(jié)構(gòu)的取代基有關(guān)。由于藥材產(chǎn)地的不同，本文研究暫未獲得D環(huán)上含α,β-不飽和酮結(jié)構(gòu)的二萜，毛萼香茶菜中二萜類成分的抗病毒活性仍需繼續(xù)深入研究。

綜上，本研究初步證實毛萼香茶菜乙醇提取物、8-羥基薊黃素(1)、薊黃素(2)對流感病毒H1N1具有顯著的抑制作用，但該類成分還需要更廣譜的抗病毒活性評價和進一步的機制研究。同時也有必要對不同產(chǎn)地毛萼香茶菜、不同結(jié)構(gòu)類型的對映-貝殼杉烷二萜開展抗病毒活性篩選，以期明確該植物的抗病毒活性及其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為毛萼香茶菜臨床治療呼吸道感染提供科學的依據(jù)。