microRNA-16在人結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲、周期和凋亡的影響

王曉明，梁國(guó)棟，王巖，楊玉波，劉峰

吉林省腫瘤醫(yī)院結(jié)直腸胃腹部外科，長(zhǎng)春 130012

結(jié)腸癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，隨著人們生活水平的提高，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，研究表明結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展受多種基因和分子調(diào)控，其發(fā)病機(jī)制仍未完全清楚[1]。因此尋找具有特異性及敏感性的生物標(biāo)志物具有重要的臨床意義。微小RNA（microRNA，miRNA）是一種大小為21～23個(gè)堿基的單鏈小分子RNA，通過(guò)對(duì)靶向mRNA的降解和翻譯水平的調(diào)控，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著原癌基因和抑癌基因的雙重作用[2-3]。已有研究表明，miRNA-16在某些惡性腫瘤（如前列腺癌、肺癌及慢性淋巴細(xì)胞白血病）中均表達(dá)下降[4-6]，提示miRNA-16是具有抑癌作用的一類(lèi)miRNA，然而在結(jié)腸癌中miRNA-16如何發(fā)揮抑癌基因的作用及具體機(jī)制尚不明確。本研究分析miRNA-16在結(jié)腸癌組織和正常結(jié)腸組織中的表達(dá)情況，并探討miRNA-16在結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲、周期和凋亡中的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2015年12月至2016年12月于吉林省腫瘤醫(yī)院接受結(jié)腸手術(shù)的30例結(jié)腸癌患者的結(jié)腸癌組織、癌旁組織（距腫瘤邊緣2 cm以內(nèi)）及正常結(jié)腸組織標(biāo)本。30例結(jié)腸癌患者中，男13例，女17例；年齡41～60歲，中位年齡48歲；低分化17例，中高分化13例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例。所有患者術(shù)前均未行化療或放療。

1.2 細(xì)胞系和相關(guān)試劑

人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480購(gòu)自北京醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。IMDM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶均購(gòu)自美國(guó)HyClone公司，Cell Culture Insert購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，Matrigel膠、膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）試劑盒及細(xì)胞周期試劑盒均購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將SW480細(xì)胞置于含10%胎牛血清、1%青霉素和1%鏈霉素的IMDM培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中每2～3天傳代一次。

1.3.2 RT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)水平 應(yīng)用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。miRNA-16探針序列為5'-UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3'，GAPDH引物序列為5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR）條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，65 ℃退火 15 s，72 ℃延伸 32 s，共30個(gè)循環(huán)。應(yīng)用熒光定量PCR儀檢測(cè)基因表達(dá)，應(yīng)用2－△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量?！鰿t值=目的基因Ct值－內(nèi)參基因Ct值，△△Ct值=轉(zhuǎn)染組△Ct值－對(duì)照組△Ct值。將基因產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描電泳結(jié)果。每次實(shí)驗(yàn)平行做5個(gè)樣本，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染說(shuō)明書(shū)，將miRNA-16特異性過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的無(wú)血清培養(yǎng)的SW480細(xì)胞作為轉(zhuǎn)染組，以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對(duì)照組，4 h后兩組均更換為含體積分?jǐn)?shù)為20%胎牛血清的完全新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3.4 細(xì)胞增殖檢測(cè) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/ml，接種于96孔培養(yǎng)板，48 h后加入20 μl噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）孵育4 h，去除上清液，應(yīng)用150 μl的二甲基亞砜溶解MTT，在波長(zhǎng)為570 nm處檢測(cè)細(xì)胞的吸光度（optical density，OD）值，根據(jù)OD值的大小計(jì)算細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率=（OD48h－OD0h）/OD48h×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 細(xì)胞侵襲檢測(cè) 將Matrigel膠與無(wú)血清的IMDM培養(yǎng)基以1∶5比例稀釋?zhuān)瑢?00 μl細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，800 μl全血清加入下室，37℃孵育48 h，去除Matrigel膠，4%多聚甲醛固定10 min，0.005%結(jié)晶紫染色40 min。200倍顯微鏡下觀察透過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)取5個(gè)視野計(jì)數(shù)取平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6 細(xì)胞周期檢測(cè) 將SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后用胰酶消化，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）洗滌細(xì)胞2次，將細(xì)胞懸液緩慢加入預(yù)冷的70%乙醇中固定，4℃過(guò)夜后離心收集細(xì)胞，加入500 μl PI避光孵育30 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀Cell Quest軟件檢測(cè)細(xì)胞周期。每次實(shí)驗(yàn)平行做5個(gè)樣本，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480細(xì)胞，采用胰酶消化，1000 r/min離心5 min，棄上清，1×binding buffer洗滌細(xì)胞沉淀1次，100 μl 1×binding buffer重懸細(xì)胞，加入5 μl AnnexinV-FITC及5 μl PI染色，室溫避光孵育15 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。每次實(shí)驗(yàn)平行做5個(gè)樣本，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件對(duì)-數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌組織、癌旁組織和正常結(jié)腸組織中miRNA-16表達(dá)水平的比較

結(jié)腸癌組織、癌旁組織和正常結(jié)腸組織中miRNA-16的表達(dá)水平分別為（0.375±0.156）、（1.000±0.020）和（0.941±0.102），3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=304.978，P＜0.01）；結(jié)腸癌組織中miRNA-16的表達(dá)水平明顯低于癌旁組織和正常結(jié)腸組織（t=21.766，P＜0.01；t=16.633，P＜0.01）。

2.2 結(jié)腸癌組織中miRNA-16的表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者臨床特征的關(guān)系

有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、疾病進(jìn)展結(jié)腸癌患者結(jié)腸癌組織的miRNA-16表達(dá)水平均低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、疾病未進(jìn)展的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。不同年齡、性別、分化程度、結(jié)腸癌家族史、腫瘤直徑、腫瘤部位、TNM分期的結(jié)腸癌患者結(jié)腸癌組織的miRNA-16表達(dá)水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

2.3 轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組細(xì)胞中miRNA-16表達(dá)水平的比較

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組中miRNA-16凝膠條帶的亮度明顯強(qiáng)于對(duì)照組，其灰度值分別為（2.20±0.23）和（1.01±0.02），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.986，P＜0.01）。

2.4 miRNA-16過(guò)表達(dá)對(duì)SW480細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響

MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組細(xì)胞的增殖率分別為（0.78±0.12）%和（0.81±0.28）%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組中穿透Matrigel膠的SW480細(xì)胞數(shù)量為（28.0±3.0），明顯少于對(duì)照組的（91.0±4.0），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.617，P＜0.01）。

2.5 miRNA-16過(guò)表達(dá)對(duì)SW480細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組中G1期、S期及G2期細(xì)胞所占比例比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

2.6 miRNA-16過(guò)表達(dá)對(duì)SW480細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的早期凋亡率為（13.770±3.460）%，明顯高于對(duì)照組的（1.250±0.410）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.917，P＜0.01）；轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組細(xì)胞的晚期凋亡率分別為（3.210±1.120）%和（2.980±1.450）%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.486，P=0.631）。

表1 結(jié)腸癌組織中miRNA-16的表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者臨床特征的關(guān)系（n=30）

表2 對(duì)照組和轉(zhuǎn)染組中G1期、S期和G2期SW480細(xì)胞所占比例的比較（%，±s）

表2 對(duì)照組和轉(zhuǎn)染組中G1期、S期和G2期SW480細(xì)胞所占比例的比較（%，±s）

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3 討論

miRNA-16缺失、突變甚至重排與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[7-8]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究表明，miRNA-16在多種實(shí)質(zhì)性腫瘤組織中均呈低表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)展階段呈負(fù)相關(guān)[9-12]。本研究結(jié)果顯示，miRNA-16在結(jié)腸癌組織中低表達(dá)，且其表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，但miRNA-16對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)影響的研究結(jié)論不一。

細(xì)胞黏附和侵襲是腫瘤細(xì)胞發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要因素，本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探索了miRNA-16過(guò)表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞和組織的侵襲能力。楊天權(quán)等[13]在裸鼠模型中發(fā)現(xiàn)，miRNA-16通過(guò)調(diào)控NF-κB1、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）的表達(dá)，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和生長(zhǎng)。Wang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-16-1-3p通過(guò)調(diào)控Twist1的表達(dá)，抑制胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。

本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中miRNA-16的表達(dá)水平明顯低于癌旁組織和正常結(jié)腸組織（P＜0.01），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、疾病進(jìn)展結(jié)腸癌患者結(jié)腸癌組織的miRNA-16表達(dá)水平均低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、疾病未進(jìn)展的患者（P＜0.05）。汪旭東等[15]研究證實(shí)，miRNA-16在肺腺癌細(xì)胞中低表達(dá)，并可以抑制肺腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞早期凋亡。Patel等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-16通過(guò)下調(diào)抑制癌基因BMI1，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞線粒體依賴的細(xì)胞凋亡。本研究進(jìn)一步探討了miRNA-16過(guò)表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲、周期和凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組的細(xì)胞增殖率和細(xì)胞周期比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但miRNA-16過(guò)表達(dá)能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞早期凋亡。

本研究具有一定的局限性。已有研究報(bào)道，miRNA-16低表達(dá)與腫瘤預(yù)后具有一定的關(guān)系，miRNA-16可以通過(guò)調(diào)控Bcl-2蛋白的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細(xì)胞的耐藥性[17-18]，這部分研究在本文中并未體現(xiàn)，更多的試驗(yàn)（例如體內(nèi)動(dòng)物和臨床試驗(yàn)等）亟待開(kāi)展。

綜上所述，miRNA-16在多種腫瘤的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，對(duì)miRNA-16的深入研究將為相關(guān)腫瘤的治療提供新的思路并有望成為結(jié)腸癌靶向治療的新靶點(diǎn)。