ICAM-1、MMP-9及E-cadherin在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及意義

楊學(xué)民，李朝路，李兆陽(yáng)

1北京市石景山醫(yī)院普外科，北京 100043

2中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，沈陽(yáng) 110001

結(jié)直腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，在發(fā)達(dá)國(guó)家發(fā)病率居第2位，在中國(guó)發(fā)病率及病死率呈上升趨勢(shì)[1-3]。雖然診斷、手術(shù)技術(shù)不斷發(fā)展，但是結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移仍是患者術(shù)后復(fù)發(fā)甚至死亡的主要原因[1-2]。結(jié)直腸癌等惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)多基因、多步驟、多種信號(hào)通路參與的復(fù)雜過(guò)程，涉及細(xì)胞的增殖、黏附、遷移、侵襲轉(zhuǎn)移等過(guò)程[1-2]。細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）是一種常見的白細(xì)胞分化抗原，能夠介導(dǎo)淋巴細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的黏附，使腫瘤細(xì)胞局部附著形成轉(zhuǎn)移灶，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移[4]?；|(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）能夠介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，為腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)擴(kuò)散提供充足條件[5]。上皮細(xì)胞鈣黏蛋白（E-cadherin）通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞間的同質(zhì)黏附，使細(xì)胞間黏附降低，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞脫落進(jìn)入淋巴循環(huán)，最終發(fā)生擴(kuò)散[6]。因此探討ICAM-1、MMP-9及E-cadherin在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用，有助于了解結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制，為結(jié)直腸癌患者的診斷、預(yù)后判斷提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

選取2013年1月至2017年10月于北京市石景山醫(yī)院手術(shù)切除的68例經(jīng)病理檢查確診為結(jié)直腸癌患者的結(jié)直腸癌組織，其中男48例，女20例；年齡41～78歲，中位年齡59.5歲，＜55歲21例，≥55歲47例；分化程度：高分化21例，中分化17例，低分化30例；腫瘤大?。海?.0 cm 50例，≥5.0 cm 18例；Dukes分期：A期14例，B期13例，C期25例，D期16例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例。另外選取對(duì)應(yīng)的距離結(jié)直腸癌組織＞5 cm的68例正常組織作為對(duì)照。所有患者在術(shù)前均未接受過(guò)任何化療、放療及生物治療等。

1.2 主要試劑及材料

兔抗人ICAM-1、MMP-9及E-cadherin多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，DAB顯色試劑盒、SP法免疫組化試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組化法檢測(cè)ICAM-1、MMP-9及E-cadherin表達(dá)情況

組織標(biāo)本經(jīng)福爾馬林固定后，石蠟標(biāo)本包埋并連續(xù)切成4 μm厚度的切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水后用枸櫞酸鈉緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，接著根據(jù)免疫組化試劑盒采用SP法對(duì)石蠟標(biāo)本進(jìn)行一抗、二抗孵育，并染色，最后在光鏡下觀察蛋白的染色情況。選取磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判斷

ICAM-1及E-cadherin主要表達(dá)于細(xì)胞膜，當(dāng)細(xì)胞膜上出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒說(shuō)明陽(yáng)性表達(dá)；MMP-9主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒說(shuō)明陽(yáng)性表達(dá)。在高倍鏡下隨機(jī)選取一張切片中的5個(gè)視野進(jìn)行觀察，并采用雙盲法對(duì)染色的細(xì)胞進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)。根據(jù)細(xì)胞的著色程度進(jìn)行評(píng)分：未染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞占視野細(xì)胞總數(shù)的百分比進(jìn)行評(píng)分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分，＜25%為1分，≥25%且＜50%為2分，≥50%且＜75%為3分，≥75%為4分。二者評(píng)分乘積：0分為陰性（－），1～4分為弱陽(yáng)性（+），5～8分為陽(yáng)性（++），≥9分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ICAM-1、MMP-9及E-cadherin在結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)

ICAM-1在結(jié)直腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為75.00%（51/68），明顯高于癌旁正常組織的10.29%（7/68），MMP-9在結(jié)直腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為77.94%（53/68），明顯高于癌旁正常組織的22.06%（15/68），E-cadherin在結(jié)直腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為32.35%（22/68），明顯低于癌旁正常組織的92.65%（63/68），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

表1 ICAM-1、MMP-9及E-cadherin在68例結(jié)直腸癌患者的結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織中的陽(yáng)性表達(dá)情況比較[n（%）]

2.2 ICAM-1、MMP-9及E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床特征的關(guān)系

C+D期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及低分化的結(jié)直腸癌患者ICAM-1、MMP-9陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于A+B期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及高中分化的結(jié)直腸癌患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；C+D期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及低分化的結(jié)直腸癌患者E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率均明顯低于A+B期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及高中分化的結(jié)直腸癌患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。不同年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位結(jié)直腸癌組織中ICAM-1、MMP-9及E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

2.3 結(jié)直腸癌組織中ICAM-1、MMP-9及E-cadherin表達(dá)的相關(guān)性

經(jīng)Spearman相關(guān)性分析，結(jié)直腸癌組織中ICAM-1與MMP-9表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r=0.839，P＜0.01），ICAM-1與E-cadherin表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.597，P＜0.01），MMP-9與E-cadherin表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.896，P＜0.01）。

3 討論

ICAM-1是一種與細(xì)胞黏附、遷移及抗原呈遞密切相關(guān)的介導(dǎo)分子，在正常情況下，僅少量的ICAM-1表達(dá)于淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞表面，而在腫瘤環(huán)境下，ICAM-1被大量分泌，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4]。研究顯示，ICAM-1基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7]。李艷等[8]采用免疫組化法比較了結(jié)直腸癌原發(fā)病灶、非癌正常組織、結(jié)直腸腺瘤組織中ICAM-1的表達(dá)，結(jié)果表明ICAM-1在非癌正常組織、腺瘤組織及癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率依次升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)結(jié)直腸癌中ICAM-1的表達(dá)與Dukes分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而不與年齡、性別、腫瘤部位等相關(guān)。本研究也采用免疫組化SP法檢測(cè)了68例結(jié)直腸癌組織及相應(yīng)的癌旁正常組織中ICAM-1的表達(dá)，結(jié)果與李艷等[8]研究結(jié)果一致，結(jié)直腸癌組織中ICAM-1陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織，同時(shí)C+D期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及低分化的結(jié)直腸癌患者ICAM-1陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于A+B期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及高中分化的結(jié)直腸癌患者，提示惡性程度高的結(jié)直腸癌細(xì)胞分泌大量的ICAM-1，通過(guò)其配體分子促使結(jié)直腸癌細(xì)胞與淋巴細(xì)胞黏附，并局部附著，進(jìn)而隨著淋巴細(xì)胞循環(huán)進(jìn)入血液形成轉(zhuǎn)移灶。

表2 ICAM-1、MMP-9及E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床特征的關(guān)系（n=68）

MMP-9是MMP中分子量最大的一種水解酶，主要是由細(xì)胞與細(xì)胞間質(zhì)間的淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等分泌形成。MMP-9能夠水解細(xì)胞的基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞穿過(guò)基底膜向鄰近組織擴(kuò)散侵襲，同時(shí)還能夠促使內(nèi)皮細(xì)胞穿過(guò)基底膜并向遠(yuǎn)處遷移，形成血管，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)侵襲提供足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與空間[5]。本研究采用免疫組化法測(cè)定了68例結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織中的MMP-9表達(dá)，結(jié)果表明結(jié)直腸癌組織中MMP-9陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織，同時(shí)C+D期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及低分化的結(jié)直腸癌患者M(jìn)MP-9陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于A+B期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及高中分化的結(jié)直腸癌患者，與多數(shù)學(xué)者研究結(jié)果一致[5,9-10]。而Nikolaeva等[11]研究表明結(jié)直腸癌組織中MMP-9陽(yáng)性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度及TNM分期無(wú)關(guān)，與本研究結(jié)果不一致，可能源于實(shí)驗(yàn)條件的差異、樣本量的大小不同等。本研究結(jié)果說(shuō)明高表達(dá)的MMP-9為結(jié)直腸癌細(xì)胞的惡性生長(zhǎng)、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移提供了更加充足的空間與營(yíng)養(yǎng)基礎(chǔ)。

E-cadherin是一種介導(dǎo)上皮細(xì)胞間黏附，維持細(xì)胞極性與分化形態(tài)的跨膜蛋白，在腫瘤細(xì)胞中，E-cadherin大部分呈現(xiàn)表達(dá)量下調(diào)或者缺失，致使細(xì)胞間黏附減弱，細(xì)胞上皮形態(tài)發(fā)生變化，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[6]。本研究免疫組化結(jié)果表明，結(jié)直腸癌組織中E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率均明顯低于癌旁正常組織，同時(shí)C+D期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及低分化的結(jié)直腸癌患者E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率均明顯低于A+B期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及高中分化的結(jié)直腸癌患者，與E-cadherin在大多數(shù)腫瘤組織中的表達(dá)趨勢(shì)一致[6]。另外秦樂(lè)和曾妍[12]研究還證實(shí)了E-cadherin的表達(dá)缺失與結(jié)直腸癌患者的預(yù)后不良密切相關(guān)。提示E-cadherin的低表達(dá)甚至缺失使結(jié)腸癌細(xì)胞間的黏附發(fā)生了障礙，減弱了結(jié)直腸癌細(xì)胞間的相互作用，促進(jìn)了結(jié)直腸癌細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。

同時(shí)本研究經(jīng)Spearman相關(guān)性分析得出結(jié)直腸癌組織中ICAM-1與MMP-9表達(dá)呈顯著正相關(guān)，ICAM-1與E-cadherin表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，MMP-9與E-cadherin表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。另外研究表明胃癌組織中ICAM-1與MMP-9表達(dá)呈正相關(guān)[13]，食管癌血清中E-cadherin與ICAM-1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[14]，腎上腺皮質(zhì)腫瘤組織中MMP-9與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[15]。進(jìn)而提示高表達(dá)的ICAM-1、MMP-9，低表達(dá)的E-cadherin共同促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織中ICAM-1、MMP-9高表達(dá)，E-cadherin低表達(dá)，三者與結(jié)直腸癌的分化程度、Dukes分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，說(shuō)明三者的聯(lián)合檢測(cè)對(duì)結(jié)直腸癌惡性程度及侵襲轉(zhuǎn)移能力的判斷具有一定的指導(dǎo)意義。