XIAP、cyclin D1及survivin在宮頸癌組織中的表達(dá)及意義

賈利剛，褚兆蘋，田菲，韓華，代聰偉，王蓓，張媛

河北省人民醫(yī)院婦科，石家莊 050051

宮頸癌是女性常見的一種惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于乳腺癌。近些年來雖然宮頸癌篩查技術(shù)不斷普及推廣，但其發(fā)病率仍呈上升趨勢并趨于年輕化[1-3]。目前宮頸癌發(fā)生的分子機(jī)制尚不明確，但腫瘤細(xì)胞的惡性增殖、細(xì)胞凋亡受限制、細(xì)胞周期紊亂是宮頸癌等惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因之一[4]。X連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）是Rajcan-Separovic等[5]發(fā)現(xiàn)的一種凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP），能夠選擇性地通過調(diào)控天冬氨酸蛋白水解酶的活性，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，IAP可以參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6]。細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）是與G1期密切相關(guān)的細(xì)胞周期蛋白，通過正向調(diào)控G1期向S期轉(zhuǎn)換，促使細(xì)胞惡性增殖，因此與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7]。存活蛋白（survivin）是目前發(fā)現(xiàn)的IAP家族中抗凋亡活性最強(qiáng)的抑制因子之一，在眾多腫瘤組織中高表達(dá)，是眾多學(xué)者認(rèn)為的最有希望成為腫瘤治療的靶點(diǎn)之一[8-9]。本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測XIAP、cyclin D1及survivin在宮頸癌組織中的表達(dá)，并分析其與宮頸癌患者臨床特征的關(guān)系，旨在為宮頸癌的治療提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年1月至2018年1月于河北省人民醫(yī)院行手術(shù)切除并經(jīng)病理確診的68例宮頸癌患者的宮頸癌組織標(biāo)本。68例患者中，≤50歲36例，＞50歲32例；年齡43～70歲，平均（55.8±3.5）歲；分化程度：高分化22例，中分化15例，低分化31例；腫瘤直徑≥4 cm 28例，＜4 cm 40例；國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟分期：IA期37例，IB～ⅡA期31例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例。另選取68例因子宮肌瘤而行子宮切除術(shù)患者的正常宮頸組織作為對照。所有患者術(shù)前均未接受過任何化療、放療及生物治療等。

1.2 主要試劑及材料

兔抗人XIAP、cyclin D1及survivin多克隆抗體均購自美國Abcam公司，DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組化法檢測XIAP、cyclin D1及survivin的表達(dá)情況

將石蠟切片于二甲苯及100%、95%、90%、85%、75%乙醇中分別浸泡5 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌2次。1%過氧化氫室溫孵育10 min后，PBS洗滌3次。將切片置于枸櫞酸鈉緩沖液中，并于微波爐中加熱15 min，PBS洗滌3次。加入山羊抗血清，室溫封閉10 min，一抗過夜孵育，次日PBS洗滌3次后，二抗室溫孵育30 min，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵蛋白工作液孵育30 min，PBS洗滌3次。DAB顯色后，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，中性樹脂封片觀察。以PBS代替一抗進(jìn)行染色作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判斷

XIAP及survivin蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，cyclin D1蛋白主要定位于細(xì)胞核，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒時提示為陽性表達(dá)。高倍顯微鏡下隨機(jī)觀察每張切片中的5個視野，采用雙盲法對染色的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。細(xì)胞染色強(qiáng)度評分：未著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細(xì)胞所占百分比評分：根據(jù)陽性細(xì)胞占視野細(xì)胞總數(shù)的百分比進(jìn)行評分，≤25%為0分，26%～50%為1分，51%～75%為2分，≥76%為3分。根據(jù)細(xì)胞染色程度評分與陽性細(xì)胞所占百分比評分的乘積判斷免疫組化結(jié)果[9]，0～1分為陰性（－），2～3分為弱陽性（+），4～6分為中等陽性（++），6分以上為強(qiáng)陽性（+++），其中2分及以上為陽性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織和正常宮頸組織中XIAP、cyclin D1、survivin陽性表達(dá)率的比較

宮頸癌組織中XIAP、cyclin D1、survivin的陽性表達(dá)率均明顯高于正常宮頸組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

表1 宮頸癌組織和正常宮頸組織中XIAP、cyclin D1及survivin陽性表達(dá)率的比較[n（%）]

2.2 XIAP、cyclin D1及survivin陽性表達(dá)與宮頸癌患者臨床特征的關(guān)系

臨床分期為IB～ⅡA期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、低分化宮頸癌患者的XIAP和survivin陽性表達(dá)率均明顯高于臨床分期為IA期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、中高分化的患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；不同年齡、腫瘤直徑宮頸癌患者的XIAP和survivin陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。不同年齡、腫瘤直徑、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和分化程度宮頸癌患者的cyclin D1陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

表2 XIAP、cyclin D1及survivin陽性表達(dá)與68例宮頸癌患者臨床特征的關(guān)系

2.3 宮頸癌組織中XIAP、cyclin D1及survivin表達(dá)情況的相關(guān)性

經(jīng)Spearman相關(guān)性分析，宮頸癌組織中XIAP與cyclin D1的表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r=0.656，P＜0.01），XIAP與survivin的表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r=0.745，P＜0.01），cyclin D1與survivin的表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r=0.672，P＜0.01）。

3 討論

XIAP是IAP家族中唯一能夠同時抑制起始階段和效應(yīng)階段的IAP[10]。XIAP通過選擇性調(diào)控caspase 3、caspase 7、caspase 9蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡。XIAP在正常組織中幾乎不表達(dá)，而在乳腺癌、宮頸癌、肺癌、肝癌等腫瘤組織中高表達(dá)[6]。本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測68例宮頸癌組織及68例正常宮頸組織中XIAP的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，宮頸癌組織中XIAP的陽性表達(dá)率明顯高于正常宮頸組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），說明XIAP在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮促進(jìn)作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，臨床分期為IB～ⅡA期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、低分化宮頸癌患者的XIAP陽性表達(dá)率明顯高于臨床分期為IA期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、中高分化的患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），提示宮頸癌組織中XIAP的表達(dá)可能與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及分化程度有關(guān)。已有研究表明，XIAP抑制劑蒽貝素能夠通過上調(diào)caspase 3和caspase 9的表達(dá)，誘導(dǎo)宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡[11]。說明XIAP抑制劑目前已逐漸被應(yīng)用于宮頸癌的治療中。

cyclin D1是與G1期密切相關(guān)的細(xì)胞周期蛋白。cyclin D1先在G1期表達(dá)，與細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶4（cyclin-dependent protein kinases 4，CDK4）/細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶6（cyclin-dependent protein kinases 6，CDK6）結(jié)合形成復(fù)合物，促使Rb蛋白磷酸化及核轉(zhuǎn)錄因子E2F進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)與細(xì)胞增殖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[7]。楊琳等[12]研究表明，p27kip1和p57kip2表達(dá)下降及cyclin D1表達(dá)升高可用于評估宮頸癌的惡性程度。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組織中cyclin D1的陽性表達(dá)率明顯高于正常宮頸組織（P＜0.01）。這一結(jié)果與楊琳等[12]的研究結(jié)果基本一致，即cyclin D1高表達(dá)預(yù)示著宮頸惡性病變。本研究還發(fā)現(xiàn)，不同年齡、腫瘤直徑、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和分化程度宮頸癌患者的cyclin D1陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），可能與樣本量較少有關(guān)。survivin是1997年Ambrosini等[8]通過基因庫篩選分離出來的IAP，是目前發(fā)現(xiàn)的分子量最小而凋亡抑制活性最強(qiáng)的凋亡抑制因子。目前的研究顯示，survivin能夠通過抑制caspase 3和caspase 9的活性進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡，或者通過調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[8]。survivin在除了胚胎組織外的所有正常組織中幾乎不表達(dá)，而在膠質(zhì)瘤、肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌中高表達(dá)[8]。Zhou等[13]研究顯示，survivin在正常宮頸、宮頸炎、宮頸尖銳濕疣、宮頸上皮內(nèi)瘤變、宮頸鱗癌組織中的陽性表達(dá)率依次呈上升趨勢。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組織中survivin的陽性表達(dá)率明顯高于正常宮頸組織（P＜0.01）。本研究還發(fā)現(xiàn)，臨床分期為IB～ⅡA期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、低分化宮頸癌患者的survivin陽性表達(dá)率明顯高于臨床分期為IA期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、中高分化的患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），提示宮頸癌組織中survivin的陽性表達(dá)率與腫瘤分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)。本研究中Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，宮頸癌組織中XIAP、cyclin D1及survivin的表達(dá)兩兩呈顯著正相關(guān)。楊德華等[14]研究表明，原發(fā)性肝癌組織中XIAP和survivin的表達(dá)呈正相關(guān)。凌春等[15]研究表明，沉默白血病K562細(xì)胞中survivin的表達(dá)能夠下調(diào)XIAP的表達(dá)，進(jìn)而使細(xì)胞凋亡，并造成細(xì)胞周期阻滯。崔宏[16]的研究表明，結(jié)直腸腺瘤中cyclin D1和survivin的表達(dá)呈正相關(guān)。Xie等[17]研究表明，RNA干擾survivin的表達(dá)后能夠提高順鉑誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞凋亡，與下調(diào)cyclin D1表達(dá)有關(guān)。提示通過下調(diào)survivin的表達(dá)，進(jìn)而抑制XIAP及cyclin D1的表達(dá)，可能成為宮頸癌基因治療的靶點(diǎn)之一。綜上所述，XIAP、cyclin D1及survivin在宮頸癌中高表達(dá)，且其表達(dá)兩兩呈顯著正相關(guān)，XIAP和survivin的表達(dá)與宮頸癌的臨床分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)。XIAP、cyclin D1及survivin在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。