survivin和caspase 3蛋白在胰腺癌組織中的表達(dá)及與胰腺癌患者臨床特征的關(guān)系

趙甦，崔衛(wèi)東，宋偉華

鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院肝膽胰腺外科，鄭州 450052

胰腺癌的總體生存預(yù)后較差，流行病學(xué)研究顯示，胰腺癌的病死率可達(dá)25%以上[1]?，F(xiàn)階段臨床上胰腺癌的診斷水平較低，其早期篩查的靈敏度及特異度均不理想。腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特征的改變是促進胰腺癌早期發(fā)生的重要因素。存活蛋白（survivin）能夠通過影響腫瘤細(xì)胞的增殖速度和浸潤能力，促進胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞早期核異型性的發(fā)生，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的風(fēng)險增加[2-3]。胱天蛋白酶3（caspase 3）是凋亡相關(guān)因子家族成員，可以抑制腫瘤細(xì)胞程序性凋亡，促進腫瘤細(xì)胞增殖，提高G1/S期細(xì)胞比例[4-5]。有研究揭示了caspase 3和survivin在泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)生中的作用，認(rèn)為高表達(dá)的caspase 3和survivin是促進腫瘤進展的重要因素[6]，但在胰腺癌中的研究不足。本研究采用免疫組織化學(xué)法分析caspase 3和survivin在胰腺癌組織中的表達(dá)情況，并分析其與胰腺癌患者臨床特征的關(guān)系，旨在為胰腺癌的血清學(xué)診斷提供新的參考指標(biāo)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2012年3月至2017年3月于鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院行手術(shù)切除的胰腺癌患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前未合并其他部位惡性腫瘤；②術(shù)后病理證實為胰腺癌；③手術(shù)根治性切除腫瘤，術(shù)后生存期大于1個月，未發(fā)生圍術(shù)期并發(fā)癥；④有完整規(guī)范的術(shù)后病理報告及隨訪資料；⑤術(shù)前未接受放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他系統(tǒng)嚴(yán)重疾病者；②未能完成隨訪者；③合并貧血及凝血功能障礙者；④合并風(fēng)濕及免疫系統(tǒng)疾病者；⑤合并嚴(yán)重的肝腎疾病者；⑥合并甲狀腺功能障礙者；⑦因其他部位腫瘤進行過放化療者。根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入180例胰腺癌患者，收集患者的胰腺癌組織標(biāo)本180例及對應(yīng)的癌旁組織（距離病灶邊緣3～5 cm）標(biāo)本90例。180例胰腺癌患者中，男95例，女85例；年齡32～79歲，平均（60.1±13.2）歲；分化程度：高分化73例，中低分化107例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移86例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移94例；TNM分期：I期53例，Ⅱ期41例，Ⅲ期46例，Ⅳ期40例。

1.2 免疫組織化學(xué)染色法

所有組織標(biāo)本均經(jīng)石蠟包埋后作連續(xù)切片，厚度約為4 mm，采用鏈霉卵白素-生物素法染色，二氨基聯(lián)苯胺（diamionben zidene，DAB）顯色。survivin和caspase 3蛋白抗體、PV6000通用型二抗以及SP試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)開發(fā)公司。以陽性片和磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）代替一抗分別作為陽性和陰性對照，高倍顯微鏡下觀察survivin和caspase 3的表達(dá)情況，具體染色步驟嚴(yán)格按照SP試劑盒說明書進行操作。

1.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定

每例標(biāo)本在400倍光鏡下隨意選取10個視野，計數(shù)每個視野中100個腫瘤細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，取其平均數(shù)計算陽性細(xì)胞所占百分比。根據(jù)染色強度評分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比評分：陽性細(xì)胞所占百分比≤25%為0分，26%～50%為1分，51%～75%為2分，＞75%為3分。根據(jù)染色強度評分與陽性細(xì)胞所占百分比評分之和判斷免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，0分為陰性（－），1～2分為弱陽性（+），3～4分為中等陽性（++），5～6分為強陽性（+++）。所有病理切片均由兩位高年資病理醫(yī)師進行單盲法評估。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件-對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌組織和癌旁組織中survivin、caspase 3蛋白陽性表達(dá)率的比較

survivin陽性顆粒呈棕色，主要位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核；caspase 3陽性顆粒呈淡黃色或棕黃色，主要位于細(xì)胞質(zhì)（圖1）。胰腺癌組織的survivin蛋白陽性表達(dá)率為86.67%（156/180），明顯高于癌旁組織的 34.44%（31/90），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=76.855，P＜0.01）（表 1）。胰腺癌組織的 caspase 3蛋白陽性表達(dá)率為88.33%（159/180），明顯高于癌旁組織的36.67%（33/90），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=77.966，P＜0.01）（表2）。

圖1 survivin和caspase 3蛋白在胰腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況（免疫組化染色，×400）

表1 胰腺癌組織和癌旁組織中survivin蛋白的表達(dá)情況

表2 胰腺癌組織和癌旁組織中caspase 3蛋白的表達(dá)情況

2.2 胰腺癌組織中survivin和caspase 3蛋白表達(dá)與胰腺癌患者臨床特征的關(guān)系

有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、中低分化胰腺癌患者胰腺癌組織的survivin蛋白陽性表達(dá)率均高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、高分化患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.758，P=0.016；χ2=5.532，P=0.019）；不同年齡、性別、TNM分期胰腺癌患者胰腺癌組織的survivin蛋白陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。高分化胰腺癌患者胰腺癌組織的caspase 3蛋白陽性表達(dá)率明顯高于中低分化患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.805，P=0.009）；不同年齡、性別、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況胰腺癌患者胰腺癌組織的caspase 3蛋白陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（表 3）

表3 不同臨床特征胰腺癌患者胰腺癌組織中survivin和caspase 3蛋白的表達(dá)情況（n=180）

3 討論

胰腺癌的發(fā)病原因較為復(fù)雜，一般認(rèn)為基因水平或者消化酶的波動可能是促進胰腺癌發(fā)生的主要原因。近年來越來越多的研究顯示，基因調(diào)控或者分子生物學(xué)水平的改變是促進胰腺癌發(fā)生的又一重要因素。腫瘤相關(guān)蛋白能夠影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特征，增強對腫瘤細(xì)胞細(xì)胞周期的調(diào)控，促進免疫逃逸，抑制機體的T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)，進而協(xié)助腫瘤浸潤或轉(zhuǎn)移[7]。血清學(xué)指標(biāo)在惡性腫瘤特別是消化系統(tǒng)惡性腫瘤的早期篩查及臨床預(yù)后評估中具有重要的參考價值，本研究的目的是為臨床上胰腺癌的篩查提供新的研究靶點，并為胰腺癌患者的預(yù)后預(yù)測提供參考。

survivin蛋白作為核轉(zhuǎn)錄因子家族成員，包含了多個巰基蛋白結(jié)構(gòu)，能夠通過結(jié)合胰腺癌干細(xì)胞，促進干細(xì)胞對于鄰近正常組織的浸潤能力；同時survivin蛋白對Notch或AKT信號通路具有激活作用，導(dǎo)致移行上皮細(xì)胞核分裂象的異常，腫瘤細(xì)胞對基底膜層的突破作用明顯增加[8-9]。caspase 3蛋白不僅可以影響胰腺癌細(xì)胞的凋亡水平，同時還能夠促進腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，影響腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)控，或者在促進惡性腫瘤的免疫逃逸等方面發(fā)揮一定的作用[10-11]。

本研究結(jié)果顯示，在胰腺癌患者的胰腺癌組織及癌旁組織中，均可以發(fā)現(xiàn)survivin和caspase 3蛋白的陽性表達(dá)，提示二者均可能參與胰腺癌的疾病進展，二者的陽性表達(dá)能夠促進腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的改變和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，影響基底膜的完整性，進而影響胰腺癌的發(fā)生過程。本研究結(jié)果顯示，胰腺癌組織中survivin和caspase 3蛋白的陽性表達(dá)率均明顯高于癌旁組織（P＜0.01），提示survivin和caspase 3蛋白可能在促進腫瘤細(xì)胞浸潤的過程中發(fā)揮了重要作用。此外，本研究結(jié)果還顯示，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、中低分化胰腺癌患者胰腺癌組織的survivin蛋白陽性表達(dá)率均高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、高分化患者（P＜0.05），這主要考慮與survivin蛋白對于淋巴結(jié)內(nèi)皮黏附分子adherin的表達(dá)調(diào)控作用有關(guān)，但具體機制仍需要后續(xù)研究的進一步探討；高分化胰腺癌患者胰腺癌組織的caspase 3蛋白陽性表達(dá)率明顯高于中低分化患者（P＜0.01），不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況胰腺癌患者胰腺癌組織的caspase 3蛋白陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示caspase 3蛋白不會影響腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。同時還可以發(fā)現(xiàn)，不同TNM分期胰腺癌患者胰腺癌組織的survivin和caspase 3蛋白陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。分析原因可能是caspase 3和survivin蛋白主要影響胰腺癌的早期發(fā)生過程，而對于后續(xù)臨床分期的進展可能影響不大。

綜上所述，survivin和caspase 3蛋白在胰腺癌組織中高表達(dá)，并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。