CAR-NK的構(gòu)建及其在抗腫瘤聯(lián)合治療中的研究進(jìn)展△

劉沙，梁皓，肖向茜，盛望

北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院藥物所，北京 100124

盡管腫瘤療法迭代更新，但如何根治腫瘤依舊是世界性難題。除了傳統(tǒng)的手術(shù)治療、放療和化療外，免疫療法由于可以實現(xiàn)精準(zhǔn)的靶向治療而受到廣泛關(guān)注。嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）的概念最早由Gross等[1]于1989年提出，之后逐漸應(yīng)用于腫瘤治療。嵌合抗原受體T細(xì)胞（chimeric antigen receptor engineered T cell，CAR-T）在臨床試驗中取得了良好的腫瘤治療效果[2]，尤其是在血液腫瘤方面，Porter等[3]報道了經(jīng)CAR-T治療難治性慢性淋巴細(xì)胞白血?。╟hronic lymphocytic leukemia，CLL）患者的病情完全緩解（complete response，CR）。迄今為止，ClinicalTrials.gov網(wǎng)站上已有200余項有關(guān)CAR-T的臨床研究的注冊信息。美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）分別于2017年8月、10月批準(zhǔn)兩項CAR-T療法用于腫瘤治療，分別是tisagenlecleucel[4]和axicabtagene ciloleucel[5]，這兩項成果的成功商業(yè)化，使2017年在CAR-T的發(fā)展進(jìn)程中具有里程碑式的意義。然而，由于異源T細(xì)胞易引發(fā)移植物抗宿主?。╣raft-versus-host disease，GVHD），所以患者一般只能采用自體T細(xì)胞進(jìn)行CAR修飾后再進(jìn)行回輸，這使臨床CAR-T應(yīng)用步驟繁瑣且價格高昂；此外，CAR-T療法在實體瘤治療方面效果不佳。由于固有免疫系統(tǒng)中的自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞是一種天然抗腫瘤細(xì)胞，因此，一些研究人員開始嘗試?yán)肅AR結(jié)構(gòu)修飾NK細(xì)胞（簡稱CAR-NK）。本綜述將梳理近幾年CAR-NK研究的相關(guān)進(jìn)展，以及其與其他腫瘤療法聯(lián)合應(yīng)用的效果，展望CAR-NK療法的未來。

1 CAR-NK的構(gòu)建

CAR的結(jié)構(gòu)一般由3個區(qū)域組成：①細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，衍生于單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）的單鏈可變區(qū)片段（single chain variable fragment，scFv），可將免疫細(xì)胞（T細(xì)胞或NK細(xì)胞）定向到腫瘤相關(guān)抗原（tumor-associated antigen，TAA），不需要進(jìn)行抗原提呈；②跨膜結(jié)構(gòu)域；③細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，衍生于T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）/CD3[6]。

1.1 細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的設(shè)計

傳統(tǒng)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域是可以與TAA進(jìn)行特異性結(jié)合的scFv。由于鼠源scFv在人體內(nèi)可能會引起細(xì)胞介導(dǎo)的排斥和致敏，或者引起人抗小鼠抗體（human anti-mouse antibody，HAMA）效應(yīng)[7]，因此，許多研究人員采用人源scFv，如抗CD19的FMC63抗體[8]、抗CD20的Leu-16抗體[9]、抗人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）的FRP5抗體[10]以及抗上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，Ep-CAM）的MOC31抗體[11]等。

為了提高CAR-NK對腫瘤細(xì)胞的特異性識別效果，可以將細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域設(shè)計為NK細(xì)胞表面活化性受體的配體，如NK細(xì)胞2族成員D（natural killer group 2 member，NKG2D）[7]。在腫瘤的免疫監(jiān)視中，NKG2D和NKG2D的配體（NKG2D ligand，NKG2DL）發(fā)揮關(guān)鍵的作用[12]。NKG2DL包括MHCI類鏈相關(guān)蛋白A（MHC classIchain-related A，MICA）、MICB等，在許多腫瘤細(xì)胞和被病毒感染的細(xì)胞表面被上調(diào)[13]。死亡相關(guān)蛋白10（death-associated protein 10，DAP10）是 NKG2D 的接頭蛋白[14]，為了產(chǎn)生更好的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)效果，Chang等[15]利用IRES序列，在CAR結(jié)構(gòu)中將DAP10與NKG2D進(jìn)行共表達(dá)，并測試了CAR-NK細(xì)胞對多種不同惡性腫瘤細(xì)胞系的活性，結(jié)果表明CAR-NK細(xì)胞殺傷急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphocytic leukemia，ALL）和前列腺癌的效果更佳。

1.2 細(xì)胞內(nèi)信號區(qū)

CD3ζ是最經(jīng)典的細(xì)胞內(nèi)信號區(qū)，含有3個免疫受體酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosinebased activation motif，ITAM）[16]。T?pfer等[17]對比了DAP12和CD28-CD3ζ作為細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)域的抗腫瘤效果。在體外實驗和小鼠模型中，DAP12和CD28-CD3ζ除可以特異性裂解前列腺癌細(xì)胞之外，與傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)的CAR-NK細(xì)胞相比，加入DAP12信號結(jié)構(gòu)域的CAR結(jié)構(gòu)，增強了CAR-NK細(xì)胞對前列腺癌細(xì)胞特異性的細(xì)胞毒性。這項工作首次證明了含單一ITAM的DAP12-CAR與含3個ITAM的基于CD3ζ的CAR結(jié)構(gòu)，具有相同的起始下游信號的能力。

2 CAR-NK在實體腫瘤中的探索研究

在實體瘤中，目前已發(fā)表了針對乳腺癌[18-19]、卵巢癌[19]、膠質(zhì)瘤[20-21]、乳腺癌腦轉(zhuǎn)移[22]、神經(jīng)母細(xì)胞瘤[23]等的CAR-NK臨床前研究（表1）。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）及表皮生長因子受體Ⅲ型突變體（epidermal growth factor receptor variant typeⅢ，EGFRvⅢ）在大部分的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）中過表達(dá)。Gen?ler等[21]利用NK-92細(xì)胞系構(gòu)建可以特異性識別EGFR、EGFRvⅢ或共同表位的3種CAR-NK細(xì)胞。在攜帶表達(dá)EGFR、EGFRvⅢ或兩種受體的顱內(nèi)GBM異種移植物的免疫缺陷小鼠模型中，用雙特異性CAR-NK細(xì)胞進(jìn)行治療優(yōu)于用相應(yīng)的單特異性細(xì)胞治療，小鼠的生存期明顯延長，并可減少免疫逃逸。

3 CAR-NK在腫瘤聯(lián)合治療中的應(yīng)用

3.1 CAR-NK與化療藥物的聯(lián)合應(yīng)用

3.1.1 CAR-NK與普通化療藥物的聯(lián)合應(yīng)用 目前晚期卵巢癌患者的治療策略通常是手術(shù)之后施行化療[24]。順鉑是卵巢癌化療的一線藥物，然而順鉑不能殺死腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cell，CSC），CSC的快速分化增殖導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)[25]。CD133是CSC上的TAA之一，其高表達(dá)與卵巢癌的化療耐藥性相關(guān)，可縮短患者的無進(jìn)展生存期和總生存期[26]。Klapdor等[27]將CD133作為靶點，構(gòu)建第3代CAR-NK92細(xì)胞。這些CAR-NK細(xì)胞顯示出特異性殺傷CD133+卵巢癌細(xì)胞和原代卵巢癌細(xì)胞的能力。實驗結(jié)果表明，先使用順鉑進(jìn)行化療，再注射NK細(xì)胞進(jìn)行抗腫瘤聯(lián)合治療，可以獲得最強的殺傷效果，而且順鉑不影響CAR-NK的細(xì)胞毒性和細(xì)胞活力[27]。

3.1.2 CAR-NK作為納米化療藥物的活載體 傳統(tǒng)的靜脈注射一般需要輸注全身毒性的劑量以保證對腫瘤細(xì)胞的殺傷效果[28]。為了降低全身毒性，使用免疫細(xì)胞作為載體將抗腫瘤藥物直接輸送到腫瘤部位的概念受到了關(guān)注[29]。紫杉醇（paclitaxel，PTX）是一種傳統(tǒng)的化療藥物，與游離態(tài)相比，其納米粒子制劑增強了向腫瘤部位的運輸，并且降低了全身毒性[30]。有文獻(xiàn)報道，NK細(xì)胞表面可以檢測到高水平的游離巰基[31]。Siegler等[19]將PTX包載于人工合成的交聯(lián)多層脂質(zhì)體囊泡（crosslinked multilamellar liposomal vesicle，cMLV）納米顆粒內(nèi)，cMLV通過存在于其表面脂質(zhì)雙層上的功能基團(tuán)——馬來酰亞胺，與NK細(xì)胞表面上巰基發(fā)生穩(wěn)定綴合，從而利用CAR-NK細(xì)胞的靶向性，將包載著PTX的cMLV運輸?shù)侥[瘤細(xì)胞附近，發(fā)揮細(xì)胞免疫和化療的聯(lián)用效應(yīng)。結(jié)果證明，將CAR-NK當(dāng)作“活載體”靶向運輸PTX，可以特異性增強在HER2+、CD19+過表達(dá)的卵巢癌、乳腺癌兩種腫瘤模型中的抗腫瘤效力，而且cMLV（PTX）的綴合不影響CAR-NK細(xì)胞的遷移[19]。

3.2 CAR-NK與酶抑制藥的聯(lián)合應(yīng)用

表1 CAR-NK在治療實體腫瘤方面的臨床前研究

3.2.1 CAR-NK與酪氨酸激酶抑制藥的聯(lián)合應(yīng)用研究表明，一些酪氨酸激酶抑制藥（tyrosine kinase inhibitor，TKI）可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，增強CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤免疫應(yīng)答效果?？ú┨婺幔╟abozantinib）是一種于2016年4月被美國FDA批準(zhǔn)用于治療晚期腎細(xì)胞癌（renal cell carcinoma，RCC）的TKI[32]。Kwilas等[33]報道卡博替尼可以抑制髓源性抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）和調(diào)節(jié)性 T（regulatory T，Tr）細(xì)胞的功能，并與抗腫瘤免疫療法產(chǎn)生協(xié)同作用。Zhang等[34]的研究表明，靶向EGFR的CAR-NK92細(xì)胞具有很高的特異性殺傷RCC細(xì)胞的能力，而用卡博替尼處理則可以增加RCC細(xì)胞膜表面EGFR的表達(dá)，減少程序性死亡受體配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱PD-L1）的表達(dá)，從而增強CAR-NK細(xì)胞的抗腫瘤作用。

3.2.2 CAR-NK與組蛋白去乙?；敢种扑幍穆?lián)合應(yīng)用 組蛋白去乙酰化酶抑制藥（histone deacetylase inhibitor，HDACI）可以修正與腫瘤相關(guān)的表觀遺傳的異常改變[35]，羅米地辛（romidepsin）是其中一種，可以抑制人胃癌、肺癌和乳腺癌的移植瘤細(xì)胞。Chu等[36]研究了抗CD20-CAR修飾的NK細(xì)胞單獨或與羅米地辛聯(lián)合應(yīng)用抗伯基特（Burkitt）淋巴瘤的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)羅米地辛在Burkitt淋巴瘤細(xì)胞中，顯著誘導(dǎo)MICA、MICB的表達(dá)，可以增強CAR-NK的特異性細(xì)胞毒性，兩者聯(lián)合應(yīng)用產(chǎn)生了比單獨療法更佳的抗腫瘤效果。

3.3 CAR-NK與溶瘤病毒的聯(lián)合應(yīng)用

溶瘤病毒（oncolytic virus，OV）是一類對腫瘤細(xì)胞具有選擇性殺傷作用的病毒，腫瘤細(xì)胞被OV感染后，會發(fā)生免疫原性細(xì)胞死亡（immunogenic cell death，ICD），釋放免疫原性物質(zhì)，激發(fā)機體的免疫應(yīng)答[37]。溶瘤性單純皰疹病毒-1（oncolytic herpes simplex virus-1，OHSV-1）是第1種基因工程OV，基因組結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，已經(jīng)被用于多種腫瘤治療[38]，但是Han等[39]報道OHSV作為單一藥物治療腫瘤，效果并不好，原因可能在于OHSV的治療激活了患者NK細(xì)胞對感染細(xì)胞的免疫應(yīng)答，最終抑制了病毒的復(fù)制。乳腺癌腦轉(zhuǎn)移在轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中很常見，且預(yù)后不良。Chen等[22]對NK-92細(xì)胞進(jìn)行了靶向EGFR的CAR修飾，在體外和小鼠顱內(nèi)乳腺癌模型中分別測試EGFR-CAR改造的NK-92細(xì)胞、OHSV-1及其聯(lián)合的抗乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的效果。在體外，與乳腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)時，EGFRCAR改造的NK-92細(xì)胞顯示出增強細(xì)胞毒性和提高γ干擾素（γ-interferon，IFN-γ）表達(dá)水平的效果，而在與OHSV-1聯(lián)合應(yīng)用后則可以檢測到更強烈的細(xì)胞殺傷效果；在小鼠模型中，與單一療法相比，CAR-NK細(xì)胞與OHSV-1聯(lián)合治療可以更有效地殺傷MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞，顯著延長荷瘤小鼠的壽命。出于安全的考慮，NK-92細(xì)胞在臨床使用前需要經(jīng)過1000 cGy（1 cGy=0.01 Gy）的照射[40]是被公認(rèn)的，CAR-NK的效應(yīng)雖強烈但有限，通常2天內(nèi)都是細(xì)胞毒性的峰值；而OHSV-1由于需要復(fù)制，4天后逐漸起效，抗腫瘤反應(yīng)緩慢但裂解效應(yīng)時間長，因此，Chen等[22]認(rèn)為腫瘤內(nèi)注射CAR-NK后的3天內(nèi)輸注OHSV-1才能達(dá)到最佳的抗腫瘤效果。

4 CAR-NK的臨床研究現(xiàn)狀

盡管ClinicalTrials.gov網(wǎng)站上已有200余項有關(guān)CAR-T的臨床研究被注冊，但是截止至2018年2月，采用CAR-NK的臨床試驗僅有8項（表2），涉及血液腫瘤及實體瘤的治療，NK細(xì)胞的來源包括原代NK細(xì)胞及NK-92細(xì)胞系等。

M.D.安德森癌癥中心資助的臨床試驗（NCT03056339）中的CAR結(jié)構(gòu)是其中最復(fù)雜的，采用了包含表達(dá)誘導(dǎo)型胱天蛋白酶9（inducible caspase 9，iC9）基因以及細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-15（interleukin-15，IL-15）基因的CAR結(jié)構(gòu)——iC9/CAR 19/IL15。構(gòu)建的CAR-NK細(xì)胞可以自行產(chǎn)生IL-15，支持細(xì)胞的存活和增殖[41]，而且可以在需要的時候通過藥理學(xué)活化來表達(dá)自殺基因，清除CAR-NK細(xì)胞。

這8項臨床實驗中，4項由來自中國的博生吉醫(yī)藥科技（蘇州）有限公司資助，且這4項CAR-NK臨床研究均采用NK-92細(xì)胞系，該細(xì)胞系于1994年被建立[42]，是一種均質(zhì)細(xì)胞系[7]，與傳統(tǒng)的CART療法中采用的獲取患者自體T細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增的方法相比，該細(xì)胞系的使用，可以極大地減少工作量并降低成本。

表2 目前ClinicalTrials.gov網(wǎng)站上已注冊的CAR-NK臨床試驗

NCT03415100是2018年1月新注冊的一項CAR-NK臨床試驗，運行機構(gòu)是同樣來自中國的廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院，依舊采用NK-92細(xì)胞系，靶向NKG2DL。

5 展望

腫瘤免疫療法為腫瘤患者帶來了新的希望，隨著各個課題組研究的深入，CAR-NK作為后起之秀將為腫瘤治療帶來新的發(fā)展。

開發(fā)更高效、更安全的非病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，可能是一個改進(jìn)方向。與慢病毒轉(zhuǎn)染相比，逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染具有更高的轉(zhuǎn)染率，但潛在的插入突變的風(fēng)險也更高[43]，可能會引發(fā)X連鎖重度聯(lián)合免疫缺陷?。╔-linked severe combined immunodeficiency disease，X-SCID）等；而電穿孔在技術(shù)上更簡單，可以避免病毒載體的使用以及腫瘤基因激活和插入突變的相關(guān)風(fēng)險[44]，但是利用這種方法表達(dá)的CAR分子是暫時性的。因此，對于CAR-NK的進(jìn)一步應(yīng)用，亟待開發(fā)更高效的轉(zhuǎn)染方法。

文獻(xiàn)報道，CAR-T和免疫檢查點封鎖（immune checkpoint blockade，ICB）聯(lián)合應(yīng)用產(chǎn)生了良好的效果，如Cherkassky等[45]的實驗表明：阻斷程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱PD-1）/PD-L1，可以使接種了胸膜間皮瘤的原位小鼠模型中的CAR-T細(xì)胞恢復(fù)效應(yīng)功能。除此以外，靶向GD2的CAR-T細(xì)胞與貝伐珠單抗（bevacizumab，BEV）對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療效果顯著[46]。隨著CAR-T技術(shù)的更新和臨床經(jīng)驗的積累，將CAR-NK細(xì)胞與其他抗腫瘤療法聯(lián)合應(yīng)用，是未來腫瘤治療的另一個研究方向。

CAR-NK細(xì)胞作為一種治療難治性惡性腫瘤的免疫治療方法，雖然存在諸多不足，但其具有巨大的潛力，當(dāng)前的臨床研究將有助于CAR-NK技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展和完善。