PGRN和Rev-erbβ雙基因敲除HEK 293細(xì)胞系的構(gòu)建及應(yīng)用

陳芳，楊沛艷，朱久玲

1 安康學(xué)院 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物科技學(xué)院，陜西 安康 725000

2 陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院基因治療研究室，陜西 西安 710062

對目的基因組特定位點進(jìn)行打靶修飾技術(shù)，也稱靶向基因組編輯技術(shù)，是基因工程研究的重點，也是研究基因功能的主要手段之一。目前，該技術(shù)被廣泛有效地應(yīng)用于構(gòu)建細(xì)胞和動物疾病模型、培育動植物新品種以及治療單基因遺傳性疾病。靶向基因組編輯技術(shù)最早由Mario Capecchi于 20世紀(jì) 80年代提出的[1]，是基于自然狀態(tài)下DNA同源重組(Homologous recombination，HR)方式可以對基因進(jìn)行定點編輯(敲除或敲入) 的作用，由于在自然狀態(tài)下同源重組的效率低、大約只有百萬分之一，因此很大程度上限制了此項技術(shù)的應(yīng)用。自21世紀(jì)以來，科學(xué)家相繼研發(fā)出了多種核酸酶來介導(dǎo)靶向基因組編輯技術(shù)的高效運行。其中較早應(yīng)用的基因組編輯核酸酶有鋅指核酸酶(Zinc finger nuclease，ZFN) 技術(shù)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases，TALEN) 技術(shù)[2-5]。利用這兩種核酸酶在基因組上對靶位點進(jìn)行特異性切割導(dǎo)致雙鏈 DNA的斷裂，進(jìn)而會引發(fā)細(xì)胞的同源重組或非同源末端連接(Non-homologous end joining，NHEJ)的方式修復(fù)受損 DNA，來實現(xiàn)基因定點的缺失(敲除)、插入(敲入) 以及基因修正等多種突變，極大地提高了靶向基因組編輯的效率，并使基因組編輯技術(shù)得到了迅速發(fā)展。2013年初，出現(xiàn)的規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列/Cas核酸酶(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/associated nuclease9，CRISPR/Cas9) 系統(tǒng)，是一種不依賴于FokⅠ核酸酶的新型基因組編輯技術(shù)[6-7]。該技術(shù)是由古菌和細(xì)菌基因組中串聯(lián)重復(fù)序列(CRISPR/Cas) 獲得性免疫系統(tǒng)發(fā)展而來的[8]。經(jīng)科研人員改造后的 CRISPR/Cas9系統(tǒng)只需將 Cas9和單鏈引導(dǎo) RNA(singleguide RNA，sgRNA)兩種成分導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞中就可進(jìn)行基因組的精確編輯，以實現(xiàn)靶基因定點的插入、缺失等突變修飾作用。CRISPR/Cas9技術(shù)具有構(gòu)建容易、操作簡單和周期短等明顯的優(yōu)勢，作為一種新型有效的靶向基因組編輯技術(shù)，近年來有許多關(guān)于CRISPR-Cas9技術(shù)在多種細(xì)胞和生物個體中成功實現(xiàn)了基因組編輯操作[9-15]。目前，CRISPR/Cas9靶向基因組編輯技術(shù)不僅廣泛應(yīng)用于模式生物(如細(xì)菌、酵母、果蠅、斑馬魚、小鼠、大鼠、豬和猴等) 的基因編輯中，而且也應(yīng)用于許多哺乳動物正常和腫瘤細(xì)胞系的基因研究中，具體研究內(nèi)容涉及細(xì)胞或動物模型的構(gòu)建、基因功能研究、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)及基因治療研究等，已成為基因功能研究、尋找藥物作用靶點的重要工具[12,16-22]。

顆粒蛋白前體(Progranulin，簡稱PGRN)，又被稱為蛋白內(nèi)皮素前體(Granulin-epithelin precursor，GEP)、PC細(xì)胞源的生長因子(PC cell derived growth factor，PCDGF) 和內(nèi)皮素前體(Proepithelin)等，是由593個氨基酸殘基組成的多功能分泌性糖蛋白分子[23-25]。PGRN作為一種多功能細(xì)胞生長因子，廣泛參與機體多種生理、病理調(diào)節(jié)功能，如生長發(fā)育、組織損傷修復(fù)、炎癥反應(yīng)、糖脂代謝以及腫瘤的發(fā)生等過程[26-28]。大量研究結(jié)果表明，PGRN不僅是一個多功能的免疫調(diào)節(jié)因子，在炎性反應(yīng)中參與調(diào)節(jié)多種信號通路發(fā)揮促炎癥或抗炎癥的作用[29]；PGRN還是一種重要的脂肪細(xì)胞因子，在脂肪組織中參與調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素6(IL6) 進(jìn)而介導(dǎo)高脂誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生胰島素抵抗，并促進(jìn)糖尿病、肥胖等疾病發(fā)生[30]；另外，PGRN還是一個腫瘤調(diào)節(jié)因子，在許多腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤以及血管生成等過程。但截至目前PGRN參與機體生理、病理調(diào)節(jié)功能的機制研究還不完善[27,31]。因此，為了深入研究PGRN生物學(xué)功能，前期利用酵母雙雜交系統(tǒng)(Yeast two-hybrid systems) 篩選實驗研究發(fā)現(xiàn)PGRN可能與核受體Rev-erbβ分子存在相互作用。Rev-erbβ是核受體Rev-erbs家族成員之一，它作為機體重要的轉(zhuǎn)錄因子可以直接結(jié)合在靶基因啟動子 RORE(puG/AGGTCA)位點上，對靶基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控。已有研究表明，脂肪代謝有關(guān)因子 Srebp-1c和載脂蛋白 ApoCIII等都是核受體 Rev-erbβ的靶基因[32-33]。為研究PGRN與 Rev-erbβ相互作用可能存在的生理意義，本實驗利用CRISPR/Cas9基因打靶技術(shù)嘗試構(gòu)建PGRN和Rev-erbβ雙基因敲除的HEK293細(xì)胞系，并在該細(xì)胞系中初步研究 PGRN和Rev-erbβ相互作用是否影響Rev-erbβ對靶基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。總之，構(gòu)建的PGRN和Rev-erbβ雙基因敲除HEK293細(xì)胞系為進(jìn)一步深入研究PGRN與Rev-erbβ相互作用的生理意義提供了必要的研究工具。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與細(xì)胞株

大腸桿菌Escherichia coli1-T1感受態(tài)細(xì)胞由陜西師范大學(xué)基因治療研究室制備并保存；克隆載體pGEM-T Easy購自Promega公司；Cas9表達(dá)載體質(zhì)粒購自Addgene公司。慢病毒pLenti/CMVLoxp-Linker-Loxp-EF1α-Puro 、 pLenti/CMV-Cre-Hygromycin的骨架質(zhì)粒載體由本實驗室構(gòu)建保存。HEK 293人胚腎細(xì)胞株購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American type culture collection，ATCC)。Rev-erbβ 基因敲除的 HEK293(Rev-erbβ-/-)C3-6細(xì)胞系由本實驗室構(gòu)建并保存。

1.1.2 試劑與儀器

質(zhì)粒DNA小提中量提取試劑盒、血液/細(xì)胞/組織基因組提取試劑盒均購自天根生化試劑公司；DNA回收試劑盒(AXYPrep DNA GelExtraction Kit) 購自Corning公司；X-treme GENE HP DNA Transfection轉(zhuǎn)染試劑購自Roche公司；Prime ScriptTMRT Reagent Kit(Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Premix EXTaqTMⅡRT-PCR試劑盒以及實驗用到的限制性核酸內(nèi)切酶、T7E1酶、LATaqDNA聚合酶購自 TaKaRa公司；兔抗人PGRN單克隆抗體(mAb)購自Abcam公司；小鼠抗人源 GAPDH單克隆抗體購自Proteintech公司；實驗中所用到的引物合成、核酸序列測序均由杭州金唯智公司完成；Master cycler PCR儀、微量移液器、5415D微型高速離心機購自Eppendorf公司；蛋白、核酸電泳系統(tǒng)、785型半干法轉(zhuǎn)膜儀購自 Bio-Rad公司；超低溫–80 ℃冰箱、CO2培養(yǎng)箱、1285型生物安全柜購自Thermo公司；E-25型細(xì)菌培養(yǎng)搖床購自美國NBS公司；生化培養(yǎng)箱購自上海精宏實驗儀器公司；凝膠成像儀購自上海復(fù)日公司；全自動化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購自上海天能公司；高壓滅菌鍋購自日本SANYO公司；Thermo Scientific Varioskan Flash全波長多功能酶標(biāo)儀購自美國 Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 相關(guān)引物設(shè)計與合成

依據(jù) PGRN蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能域，用(http://crispr.mit.edu) 網(wǎng)站在PGRN基因第5、6個外顯子的區(qū)域中設(shè)計了4個不同的針對PGRN基因的 sgRNA，即 PGRN sgRNA1–4。并在每條PGRN sgRNA 序列中的正義鏈 5?端添加上ACCG，反義鏈的 5?端添加上 AAAC，使其分別能與經(jīng)BsaⅠ酶切的pU6-sgRNA back bone表達(dá)載體(sgRNA表達(dá)載體) 形成互補的黏性末端。所設(shè)計的PGRN sgRNA寡核苷酸序列結(jié)果見表1。這4個PGRN sgRNA主要針對于PGRN基因G、F、B功能域。并根據(jù)PGRN的打靶序列片段(Target sequence fragment，TSF)設(shè)計出了4條打靶鑒定引物，PCR外巢檢測引物 sp1/sp2和內(nèi)巢檢測引物sp3/sp4，具體引物序列見表1。

表1 PGRN sgRNA寡核苷酸及用于打靶檢測PCR引物序列Table1 The oligonucleotide sequences of PGRN sgRNA and PCR amplification primers for knock-out PGRN detection

1.2.2 pU6-PGRN sgRNA1–4載體的構(gòu)建及PGRN sgRNA活性篩選

1) pU6-PGRN sgRNA1–4載體構(gòu)建

將金唯智公司合成的特異的 PGRN sgRNA1–4寡核苷酸序列，各取15 μL兩兩配對、混勻，室溫放置1–2 h變性退火。取退火后的產(chǎn)物 4.5 μL與經(jīng)BsaⅠ酶切的 pU6-sgRNA 骨架載體相連，獲得pU6-PGRN sgRNA1–4表達(dá)載體。將獲得的陽性質(zhì)粒載體送金唯智公司測序、正確后，可用于后續(xù)PGRN sgRNA打靶效率的檢測。

2) pU6-PGRN sgRNA1–4活性檢測

將上述構(gòu)建成功的4.0 μg的PGRN sgRNA表達(dá)載體和對照載體，分別與6.0 μg的Cas9表達(dá)載體用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法共轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞，72 h后收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞，提取細(xì)胞基因組。用提取的基因組為模板，用LATaq酶進(jìn)行PCR擴增PGRN的TSF區(qū)域(PCR外巢擴增引物sp1/sp2，內(nèi)巢擴增引物 sp3/sp4，PCR擴增程序和條件參考文獻(xiàn)[34])，PCR擴增產(chǎn)物再經(jīng)變性退火、凝膠回收獲得PGRN 打靶區(qū)DNA片段。取500 ng上述回收的DNA片段，用0.5 μL的T7E1酶(約5 U活力單位)，37 ℃酶切20 min，酶切產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析sgRNA活性。

1.2.3 攜帶Cas9和PGRN雙sgRNA的慢病毒打靶載體的構(gòu)建

依據(jù)上述PGRN sgRNA活性檢測的結(jié)果，參照文獻(xiàn)[15]將2個有活性的sgRNA串聯(lián)到一起可以顯著提高打靶效率。用文獻(xiàn)[15]的方法，選擇2個具有較高打靶活性的單個PGRN sgRNA，構(gòu)建出攜帶PGRN雙sgRNA的pU6-PGRN-double sgRNA的表達(dá)載體。用SpeⅠ和NotⅠ酶切PGRN雙sgRNA表達(dá)載體(pU6-PGRN-double sgRNA)，獲得PGRN-double sgRNA酶切片段，用ClaⅠ和SpeⅠ酶切 Cas9 表達(dá)載體質(zhì)粒獲得 Cas9基因片段。將上述片段先后與NheⅠ和NotⅠ酶切以及SfuⅠ和XbaⅠ酶切的慢病毒 pLenti/CMV-Loxp-Linker-Loxp-Puro骨架載體相連，獲得含重組hCas9和PGRN double sgRNA的慢病毒載體(具體載體中的主要元件為 pLenti/CMV-Loxp-Cas9-sgRNA2-U6-sgRNA3-U6-Loxp-EF1α-Puro，圖 1)。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

HEK293細(xì)胞、HEK293 C3-6細(xì)胞均用DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，另外添加10%的胎牛血清、10 g/LL-谷氨酸、丙酮酸鈉、100 μg/mL鏈霉素和100 IU/mL青霉素。37 ℃、5.0% CO2的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。將HEK293細(xì)胞或HEK293 C3-6細(xì)胞接種至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到 70%-80%時，用 X-treme GENE HP DNA Transfection轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒DNA到細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染具體的操作方法參照產(chǎn)品說明書。

1.2.5 PGRN穩(wěn)定敲除的HEK293細(xì)胞系的建立

在文獻(xiàn)[34]Rev-erbβ基因敲除的 HEK293(Rev-erbβ-/-)C3-6細(xì)胞系的基礎(chǔ)上，利用攜帶Cas9和PGRN double sgRNA的慢病毒對PGRN基因進(jìn)行打靶敲除。首先，將構(gòu)建成功的含重組Cas9和PGRN double sgRNA的慢病毒載體(pLenti/CMV-Loxp-Cas9-sgRNA2-U6-sgRNA3-U6-Loxp-EF1α-Puro)(圖 1)，轉(zhuǎn)染到 HEK293T 細(xì)胞中進(jìn)行慢病毒包裝。再取包裝后 48 h的細(xì)胞培養(yǎng)液上清，感染 Rev-erbβ基因敲除的 HEK293(Rev-erbβ-/-)細(xì)胞。感染 48 h后，用 1.2 μg/mL 嘌呤霉素篩選，待篩選穩(wěn)定后(7-14 d)，收細(xì)胞基因組進(jìn)行打靶檢測。然后，用pLenti/CMV-Cre-Hyg慢病毒感染有打靶效果的細(xì)胞(以除去整合到打靶細(xì)胞基因組中Loxp-Cas9-sgRNA2-U6-sgRNA3-U6-Loxp)。再用(0.2 μg/mL潮霉素B) 篩選，待細(xì)胞篩選穩(wěn)定后，收集打靶細(xì)胞的基因組。采用PCR擴增重組到基因組中的Cas9基因，檢測打靶細(xì)胞中Cas9基因的清除情況，并對清除完全的打靶細(xì)胞進(jìn)行克隆化操作。提取陽性單克隆細(xì)胞的基因組，用外、內(nèi)巢PCR檢測引物P1/P2和P3/P4，PCR擴增TSF區(qū)基因片段，將獲得擴增目的片段與野生型TSF區(qū)序列相比較，并分析打靶細(xì)胞的PGRN基因突變類型。將PCR擴增的產(chǎn)物含有突變型的(PGRN TSF) 序列進(jìn)行測序，由測序結(jié)果確定陽性克隆細(xì)胞是否是基因敲除(插入、缺失)的單克隆(PGRN-/-) 細(xì)胞株。

圖1 PGRN慢病毒打靶載體結(jié)構(gòu)示意圖[35]Fig.1 Schematic illustration of the targeting vector for knock-out of human PGRN[35].

1.2.6 PGRN基因敲除的HEK293細(xì)胞系的鑒定

1) PCR對PGRN基因敲除細(xì)胞系的鑒定

取對照HEK293 C3-6細(xì)胞和PGRN基因敲除的HEK293細(xì)胞，用基因組提取試劑盒分別提取上述細(xì)胞的基因組。以提取的基因組為PCR擴增模板和特異的外、內(nèi)巢引物P1/P2、P3/P4為打靶鑒定的PCR引物，采用巢式PCR對PGRN基因打靶區(qū)(TSF區(qū)) 基因片段進(jìn)行擴增，PCR反應(yīng)及擴增條件參見文獻(xiàn)[34]略有改動。取少量 PCR擴增產(chǎn)物，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳初步檢測分析打靶敲除后PGRN基因TSF區(qū)基因突變型類型。并將PGRN基因敲除的HEK293細(xì)胞不同的PCR擴增產(chǎn)物分別進(jìn)行凝膠回收、純化，連接pGEM-T載體，提取陽性克隆質(zhì)粒送測序。再將PGRN TSF序列片段的測序結(jié)果與對照細(xì)胞PGRN TSF序列進(jìn)行比對，來對PGRN基因敲除細(xì)胞系的PGRN基因的突變類型進(jìn)行鑒定分析。進(jìn)一步確定PGRN基因敲除單克隆陽性細(xì)胞系PGRN基因的突變類型。

2) qRT-PCR檢測PGRN mRNA水平

取一定量對照和PGRN基因敲除的HEK293細(xì)胞，用 TRIzol處理分別提取細(xì)胞的總 RNA。取500 ng細(xì)胞總RNA作模板，用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。再用 SYBR?Premix ExTaq試劑和特異的PGRN RT-PCR引物sp5/sp6擴增不同細(xì)胞的PGRN基因，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH) 為內(nèi)參，每個反應(yīng)設(shè)3次重復(fù)。根據(jù)qRT-PCR檢測結(jié)果，通過比較基因敲除細(xì)胞與對照細(xì)胞的PGRN mRNA表達(dá)水平的變化，確定PGRN基因敲除細(xì)胞系的PGRN mRNA表達(dá)水平的變化。

3) Western blotting檢測PGRN蛋白質(zhì)水平

取對照、PGRN基因敲除HEK293細(xì)胞60 mm平皿各一盤，用200 μL RIPA(含蛋白酶抑制劑)的細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)。用二辛可寧酸(Bicinchonininc acid，BCA) 定量試劑盒測定細(xì)胞總蛋白質(zhì)濃度。分別取50 μg總蛋白量的對照和PGRN敲除細(xì)胞蛋白質(zhì)提取液上樣，經(jīng) 10%SDS-PAGE分離。再經(jīng)轉(zhuǎn)移電泳將電泳分離的蛋白條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，PVDF膜用5% BSA(W/V) 的PBST溶液室溫封閉1.0–1.5 h；用兔抗人源 PGRN單克隆抗體(1∶1 000) 和小鼠抗人源 GAPDH 單抗(1∶500) 分別與印跡膜室溫共孵育1-1.5 h；1×PBST洗滌孵育后的PVDF膜3次(5 min/次)；然后用HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶10 000稀釋) 和山羊抗小鼠IgG(1∶10 000稀釋)的二抗孵育液與 PVDF膜室溫孵育 1 h；分別用1×PBST和1×PBS徹底洗滌印跡膜3次(5 min/次)；最后用化學(xué)發(fā)光法檢測目的蛋白質(zhì)的印跡條帶，確定PGRN基因敲除細(xì)胞系中PGRN蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。

1.2.7 PGRN介導(dǎo) Rev-erbβ對靶基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控的檢測

在 PGRN和 Rev-erbβ雙基因敲除 HEK293 C3-6/C23細(xì)胞系中，通過回補PGRN和Rev-erbβ來研究 PGRN介導(dǎo) Rev-erbβ對靶基因啟動子ApoCIII和 Srebp-1c轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控的具體作用。操作方法如下：將實驗室前期構(gòu)建的Rev-erbβ靶基因啟動子熒光素酶報告基因載體pGL3-hApoCIII promoter-Luci和pGL3-hSrebp-1c promoter-Luci 150 ng分別與100 ng pAd5 E1-CMV-hPGRN質(zhì)粒(人源PGRN真核表達(dá)載體)或/和100 ng pAd5 E1-CMV-hRev-erbβ質(zhì)粒(人源 Rev-erbβ真核表達(dá)載體) 以及20 ng pRL-CMV-Renilla Luci質(zhì)粒(內(nèi)參載體) 共轉(zhuǎn)染到24孔PGRN和Rev-erbβ雙基因敲除細(xì)胞系中，用空載體pAd5-E1質(zhì)粒補充使每組實驗轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒總量為370 ng，轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞總蛋白。另外以轉(zhuǎn)染同樣量的pAd5-E1空載體作為對照組。用雙熒光素酶(Dual-luciferase)試劑和全波長多功能酶標(biāo)儀檢測各實驗組的熒光素酶相對活性，反映出PGRN與Rev-erbβ相互作用介導(dǎo)Rev-erbβ對hApoCIII和hSrebp-1c啟動子啟動熒光素酶轉(zhuǎn)錄活性的影響情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 PGRN sgRNA活性檢測與篩選

將 pU6-PGRN sgRNA1、pU6-PGRN sgRNA2、pU6-PGRN sgRNA3和pU6-PGRN sgRNA4的表達(dá)載體和對照載體，分別同重組hCas9表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中，72 h后收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞，提取其基因組。用 PCR擴增 PGRN打靶區(qū) TSF片段，瓊脂糖凝膠純化、并回收目的DNA片段，再用T7E1酶切回收的DNA片段，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析得出PGRN 4個sgRNA的打靶活性(圖 2)。與對照質(zhì)粒相比較，pU6-PGRN sgRNA2和pU6-PGRN sgRNA3有明顯的切開條帶，條帶大小與預(yù)期的結(jié)果相一致，表明pU6-PGRN sgRNA2和pU6- PGRN sgRNA3有較高的打靶活性。將有活性的PGRN sgRNA 2和sgRNA 3串聯(lián)，構(gòu)建攜帶雙PGRN sgRNA和Cas9的pLenti/CMVLoxp-Cas9-sgRNA2-U6-sgRNA3-U6-Loxp-EF1α-Puro慢病毒載體，對 HEK293 C3-6細(xì)胞進(jìn)行PGRN基因打靶操作。

2.2 PGRN基因敲除的HEK293細(xì)胞系的建立與鑒定

用包裝好的攜帶Cas9和PGRN sgRNA2+ sgRNA3的慢病毒感染 HEK293(Rev-erbβ-/-) 細(xì)胞對 PGRN基因進(jìn)行打靶敲除。病毒感染后48 h，向培養(yǎng)基中添加1.2 μg/mL嘌呤霉素進(jìn)行篩選，篩選10 d細(xì)胞穩(wěn)定后，收細(xì)胞基因組進(jìn)行打靶檢測，檢測結(jié)果見圖3。由圖3可知，與對照細(xì)胞相比較，PGRN基因敲除細(xì)胞打靶區(qū) TSF的 PCR擴增產(chǎn)物除了有660 bp與野生型大小一致的野生型條帶以外，還含有一條較強的470 bp左右的PGRN基因敲除條帶。上述結(jié)果說明攜帶 Cas9和 PGRN sgRNA2+sgRNA3的慢病毒已對HEK293 C3-6細(xì)胞PGRN基因進(jìn)行有效的基因打靶敲除。

圖2 PGRN sgRNA 1–4的生物活性檢測Fig.2 Detection the activity of PGRN sgRNA1–4.Lane 1: DNA marker; lane 2: negative control(the product of T7E1 cut the TSF fragment from HEK293 transfected with control vector); lane 3–6: the product of T7E1 cut the TSF fragment from HEK293 transfected with PGRN TSF fragment from HEK293 transfected.

圖3 PGRN基因敲除打靶檢測Fig.3 Detection the knockout of targeting PGRN gene.Lane M: DNA marker; lane 1: the PCR product of PGRN gene knockout TSF in HEK293 C3-6 cell; lane 2: the PCR product of TSF in control cell.

將上述PGRN基因打靶檢測TSF區(qū)PCR擴增產(chǎn)物660 bp 和470 bp DNA片段，凝膠回收后送測序，測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生型660 bp條帶和基因敲除470 bp條帶的DNA片段均存在套峰。這說明通過慢病毒打靶敲除后PGRN基因TSF區(qū)DNA序列存在有多種基因型(打靶敲除后篩選的HEK293 C3-6細(xì)胞不純)，因此對該不純的HEK293 C3-6細(xì)胞進(jìn)行克隆化篩選。通過克隆化處理，篩選到了 35株陽性單克隆細(xì)胞株。提取35株陽性單克隆細(xì)胞的基因組，用外、內(nèi)巢打靶檢測引物P1/P2、P3/P4，PCR擴增陽性單克隆細(xì)胞 PGRN TSF區(qū)基因片段，與野生型 TSF序列相比較，發(fā)現(xiàn) 35株陽性克隆細(xì)胞均有打靶效果。

選取陽性克隆細(xì)胞中狀態(tài)較好的 13株細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)，這13株陽性克隆細(xì)胞既存在與野生型TSF區(qū)大小一致660 bp的DNA條帶，又存在400 bp左右的基因敲除DNA條帶(圖4)。并將13株陽性單克隆細(xì)胞的PGRN基因打靶區(qū)TSF PCR擴增產(chǎn)物660 bp DNA片段和400 bp左右的DNA片段凝膠回收、連接pGEM-T載體，提取陽性質(zhì)粒送測序。測序分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HEK293 C3-6/C23號陽性細(xì)胞為單克隆細(xì)胞系，且該細(xì)胞的PGRN基因一條鏈在PGRN基因打靶區(qū) TSF中的 PGRN sgRNA2與sgRNA3之間缺失187 bp；另一條鏈在PGRN基因打靶區(qū)TSF中的PGRN sgRNA2處缺失7 bp(具體見圖5)。其他12株陽性單克隆細(xì)胞均為一條鏈為野生型，另一條鏈在PGRN基因sgRNA2處或sgRNA2和sgRNA3處缺失8-190 bp堿基不等的單倍體基因缺失突變型(具體分析略)。由上述鑒定結(jié)果可知，經(jīng)攜帶Cas9和PGRN sgRNA2+sgRNA3的慢病毒感染 HEK293 C3-6(Rev-erbβ-/-)細(xì)胞進(jìn)行PGRN基因打靶敲除，再經(jīng)克隆化篩選成功獲得一株P(guān)GRN和Rev-erbβ兩個基因都完全敲除的 HEK293 C3-6/C23細(xì)胞系。

圖4 PCR鑒定PGRN基因打靶后篩選的陽性克隆Fig.4 PCR identification genotype of positive clone with PGRN gene knockout.Lane C0: PCR amplification the TSF of control HEK293 C3-6 cells; lane M：DNA marker; lane C1–C27: PCR amplification the TSF of the positive clones of the HEK293 C3-6/C1,C2,C5,C8,C11,C12,C13,C14,C17,C19,C20,C23,C27 cell lines with PGRN gene knockout.

圖5 HEK293 C3-6/C23基因敲除細(xì)胞系PGRN基因突變型分析Fig.5 Analysis of knockout PGRN gene mutants of HEK293 C3-6/C23.(A) The PGRN target sequence fragment(from PGRN sgRNA2 to sgRNA3) of wild-type.(B) The deletion mutant of PGRN target sequence fragment.One deletion mutant chain lacks of 187 bp locating between sgRNA2 and sgRNA3 gene targeting area(the 187 bp specific deletion base sequences are highlighted on the underlines of wild-type).And the other deletion mutation chain lacks of 7 bp in PGRN sgRNA2 gene targeting area(the 7 bp specific deletion base sequence are showed in green rectangle of wild-type).

2.3 PGRN mRNA和蛋白質(zhì)在 HEK293 C3-6/C23細(xì)胞系中的表達(dá)水平

為了驗證PGRN基因敲除后是否對HEK293 C3-6/C23細(xì)胞系的PGRN mRNA、蛋白質(zhì)表達(dá)水平有影響，采用qRT-PCR和Western blotting法分別檢測在 HEK293 C3-6/C23細(xì)胞系和對照HEK293 C3-6細(xì)胞系中的PGRN mRNA、蛋白質(zhì)表達(dá)水平。qRT-PCR檢測結(jié)果表明，與對照細(xì)胞系相比，PGRN敲除細(xì)胞中的PGRN mRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)極顯著的降低(圖 6A)；同樣 Western blotting檢測結(jié)果顯示，對照細(xì)胞系中有明顯的PGRN蛋白質(zhì)印跡條帶，而在PGRN敲除細(xì)胞系HEK293 C3-6/C23中未檢測到PGRN蛋白質(zhì)的印跡條帶(圖6B)。上述結(jié)果一致表明PGRN mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平在PGRN敲除細(xì)胞系中呈極顯著的下降趨勢。因此進(jìn)一步證實，成功構(gòu)建并獲得PGRN和Rev-erbβ雙基因敲除的 HEK293 C3-6/C23細(xì)胞系。

圖6 RT-qPCR和Western blotting檢測不同細(xì)胞系PGRN mRNA、蛋白質(zhì)的表達(dá)水平Fig.6 RT-qPCR and Western blotting detection the PGRN mRNA and protein expression in different HEK293 cell lines.(A) The PGRN mRNA expression in PGRN knockout cell lines and control cells.1: HEK293 C3-6 control cell lines; 2: the PGRN knockout cell lines of HEK293 C3-6/C23,bP＜0.01vs control.(B) The PGRN protein expression level in PGRN knockout cell lines and control cells.1: the cells lysate of HEK293 C3-6 control cell lines; 2: the cells lysate of HEK293 C3-6/C23 cell lines.The anti-PGRN antibody(1:1 000) was used to detect PGRN protein expression in different cell lines,and the anti-GAPDH is internal control.

2.4 PGRN介導(dǎo) Rev-erbβ對靶基因啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響

將Rev-erbβ靶基因啟動子熒光素酶報告基因表達(dá)載體pGL3-hApoCIII promoter-Luci和pGL3-hSrebp-1c promoter-Luci分別同PGRN、Rev-erbβ表達(dá)載體等共轉(zhuǎn)染到PGRN和Rev- erbβ雙基因敲除HEK293 C3-6/C23細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染后48 h收細(xì)胞總蛋白，用全波長多功能酶標(biāo)儀檢測各實驗組熒光素酶的相對活性見圖 7。由檢測結(jié)果可知，在HEK293 C3-6/C23細(xì)胞中回補PGRN不僅可以增強Rev-erbβ對靶基因ApoCIII啟動子轉(zhuǎn)錄的抑制作用(圖 7A)，還可以增強 Rev-erbβ對靶基因Srebp-1c啟動子轉(zhuǎn)錄的激活作用(圖7B)。這些結(jié)果說明，在HEK293 C3-6/C23細(xì)胞內(nèi)，PGRN與Rev-erbβ相互作用可以激活Rev-erbβ對靶基因啟動子轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。

3 討論

基因組編輯技術(shù)已被廣泛有效地應(yīng)用于構(gòu)建細(xì)胞和動物疾病模型、培育生物新品種以及遺傳性疾病的治療研究上。人工核酸酶的出現(xiàn)極大地提高了基因組編輯的效率，徹底改變了該項技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀，其中CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)操作簡單、省時省力、成本廉價等優(yōu)點使它一出現(xiàn)就很快成為人們熱捧的基因編輯技術(shù)。

截止目前，已有很多研究團(tuán)隊使用CRISPR/Cas系統(tǒng)成功開展細(xì)胞或動物基因編輯及疾病治療相關(guān)研究。雖然與 ZFN和 TALEN技術(shù)相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)只需將設(shè)計好的20 bp左右的sgRNA和重組的 Cas9蛋白通過一定的方法導(dǎo)入細(xì)胞中就可以對細(xì)胞特定的基因進(jìn)行靶向編輯修飾了，但是該技術(shù)自最初提出以來一直處于不斷改進(jìn)和發(fā)展過程中的[36-39]。自2013年以來，本實驗室一直致力于利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)開展基因組編輯相關(guān)的工作(人源基因敲除細(xì)胞系、小鼠疾病模型構(gòu)建等)[15,34,40]。前期基因打靶工作主要借鑒Cho等[41]提出的提高sgRNA與Cas9系統(tǒng)特異性和減少脫靶效應(yīng)的策略，通過脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染打靶載體(含特異的有活性的 sgRNA和重組Cas9) 和供體載體(攜帶靶基因上、下游同源臂)到靶細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行基因的敲除或敲入等編輯修飾操作。通過這種基因打靶操作方式，一方面比較容易將正?；蚧蛲庠礃?biāo)記基因如 eGFP導(dǎo)入靶細(xì)胞進(jìn)行基因糾正或篩選基因敲除細(xì)胞系；另一方面，當(dāng)sgRNA引導(dǎo)Cas9對靶基因DNA 進(jìn)行特異切割時，導(dǎo)入的同源 DNA模板將會大大提高基因打靶同源重組修復(fù)的效率，使切割的DNA發(fā)生同源重組，并將外源DNA片段整合到靶基因組特定位點上，從而實現(xiàn)基因的敲入、敲除突變。但是后來研究發(fā)現(xiàn)，上述基因打靶操作方式存在許多問題，首先是脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞，特別是一些腫瘤細(xì)胞系效率很低，使得最終的打靶效率不高；其次是這種基因打靶方式容易獲得一條鏈為整合型突變，另一條鏈可能為野生型、缺失突變或整合型突變，三者各占 1/3的幾率。因此，要想獲得兩條 DNA鏈都發(fā)生突變的細(xì)胞系概率非常小，往往需要通過增加基因打靶、篩選及克隆化等操作的工作量來實現(xiàn)。鑒于實驗室前期基因打靶方式存在諸多問題以及構(gòu)建PGRN和 Rev-erbβ雙基因敲除細(xì)胞系的實驗?zāi)康?，本實驗重新設(shè)計構(gòu)建了同時攜帶 Cas9和PGRN雙sgRNA的慢病毒打靶載體。利用慢病毒打靶載體對HEK293 C3-6細(xì)胞系的PGRN基因進(jìn)行打靶敲除，藥物篩選細(xì)胞穩(wěn)定后，再用含 Cre的慢病毒 pLenti/CMV-Cre-Hygromycin感染有打靶效果的細(xì)胞(以除去整合到細(xì)胞基因組中的Loxp-Cas9-sgRNA2-U6-sgRNA3-U6-Loxp)，通過克隆化、基因測序鑒定等操作最終獲得了PGRN和Rev-erbβ雙基因敲除 HEK293 C3-6/C23細(xì)胞系。利用改進(jìn)的慢病毒打靶載體進(jìn)行基因打靶操作方式，直接用攜帶Cas9和PGRN雙sgRNA的慢病毒感染細(xì)胞進(jìn)行基因打靶，在打靶的同時由于沒有引入同源DNA片段，故切割的DNA主要通過非同源末端連接方式進(jìn)行 DNA修復(fù)，會在切割位點上引起插入或缺失突變，從而引發(fā)目的基因編碼蛋白質(zhì)發(fā)生移碼突變以達(dá)到目的基因敲除的目的。這種利用改良的慢病毒打靶載體進(jìn)行基因打靶操作方式，不僅通過提高打靶載體導(dǎo)入靶細(xì)胞的效率來提高打靶效率；而且可以縮短和簡化基因打靶、篩選及克隆化等操作的周期和過程。

圖7 PGRN介導(dǎo)Rev-erbβ對靶基因啟動子活性調(diào)控的影響Fig.7 Effect of PGRN mediating Rev-erbβ on the target gene promoter activity.(A) Effect of PGRN mediating Rev-erbβ on the hApoCIII promoter activity in HEK293 C3-6/C23 cells.B: Effect of PGRN mediating Rev-erbβ on the hSrebp-1c promoter activity in HEK293 C3-6/C23 cells.pAD5-E1 as control(150 ng pGL3-hApoCIII/hSrebp-1c promoter-Luci plasmid,200 ng pAD5-E1 plasmid and 20 ng pRL-CMV-Renilla-Luci plasmid); pAD5-E1+pAD5-E1-PGRN(150 ng pGL3-hApoCIII/hSrebp-1c promoter-Luci plasmid,100 ng pAD5-E1 plasmid,100 ng pAD5-E1-PGRN plasmid and 20 ng pRL-CMV-Renilla-Luci plasmid); pAD5-E1+pAD5-E1-Rev-erbβ(150 ng pGL3-hApoCIII/hSrebp-1c promoter-Luci plasmid,100 ng pAD5-E1 plasmid,100 ng pAD5-E1-Rev-erbβ plasmid and 20 ng pRL-CMV-Renilla-Luci plasmid); pAD5-E1-PGRN+pAD5-E1-Rev-erbβ(150 ng pGL3-hApoCIII/hSrebp-1c promoter-Luci plasmid,100 ng pAD5-PGRN plasmid,100 ng pAD5-E1-Rev-erbβ plasmid and 20 ng pRL-CMV-Renilla-Luci plasmid).** P＜0.01,*** P＜0.005,****P＜0.001 vs control.

本研究在前期構(gòu)建攜帶外源基因 eGFP的Rev-erbβ基因敲除細(xì)胞系(HEK293 C3-6) 的基礎(chǔ)上，利用攜帶重組 Cas9和串聯(lián)較高活性的PGRN sgRNA2和sgRNA3的慢病毒感染HEK293 C3-6細(xì)胞對PGRN基因進(jìn)行打靶敲除，再經(jīng)藥物篩選、克隆化和基因測序等操作，成功獲得一株P(guān)GRN和Rev-erbβ雙基因敲除的 HEK293 C3-6/C23細(xì)胞系。所構(gòu)建的PGRN和Rev-erbβ雙基因敲除HEK293 C3-6/C23細(xì)胞系，徹底解決了傳統(tǒng) RNAi技術(shù)的不徹底性和瞬時性對基因功能研究的不足。隨后，利用所構(gòu)建的 HEK293 C3-6/C23細(xì)胞系進(jìn)行研究表明PGRN與Rev-erbβ相互作用，前者可以影響Rev-erbβ對靶基因啟動子轉(zhuǎn)錄的調(diào)控?？傊?，這些研究為闡明PGRN介導(dǎo) Rev-erbβ對靶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機制和生理意義奠定了堅實的基礎(chǔ)和提供了有效的研究工具。

致 謝特別感謝陜西師范大學(xué)基因治療室李雅博士提供的慢病毒打靶載體，張偉鋒博士對基因打靶提供的技術(shù)支持。