蜘蛛多肽毒素JZTX-51和JZTX-26的重組表達(dá)和純化

邵婕，潘嬌，瞿芳，劉子昊，丁易穎，羅莎，張學(xué)文，陳金軍

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128

動(dòng)物毒液是有重要研究?jī)r(jià)值的生物活性物質(zhì)，許多深入研究的毒素多肽、蛋白已成為開展神經(jīng)生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和蛋白質(zhì)化學(xué)基礎(chǔ)理論研究、天然創(chuàng)新藥物開發(fā)以及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用的良好材料[1-3]。然而，天然節(jié)肢動(dòng)物肽類毒素資源有限，生化分離和純化過程繁瑣且得率低，化學(xué)合成成本高，且不易大規(guī)模生產(chǎn)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，生物合成為毒素研究開辟了一條新的途徑。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前最為成熟也是應(yīng)用最廣泛的原核表達(dá)體系，具有遺傳背景清楚、操作簡(jiǎn)便、便于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)[4]。但是，采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白，會(huì)造成一些不溶性包涵體的形成，這些包涵體會(huì)阻礙蛋白的表達(dá)。為提高靶蛋白的可溶性表達(dá)效率，將靶蛋白與一些易于表達(dá)和純化的標(biāo)簽進(jìn)行融合表達(dá)，常用的表達(dá)標(biāo)簽有：MBP(麥芽糖結(jié)合蛋白)，TRX(硫氧還蛋白)，GST(谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)，SUMO(小泛素相關(guān)修飾蛋白) 和HaloTag蛋白，GB1(鏈球菌G蛋白B1結(jié)構(gòu)域)[5-7]。Zhu等提供了在大腸桿菌重組表達(dá)系統(tǒng)中合成 α-芋螺毒素 LvIA的有效方法[8]。Moon等在大腸桿菌表達(dá)體系中成功表達(dá)了筍螺毒素Tgu6.1，并檢測(cè)證明對(duì)沙蠶有麻痹作用[9]。

蜘蛛種類繁多，而且不同蜘蛛的毒液所含成分及其性質(zhì)差別很大，因此，蜘蛛毒液是一個(gè)巨大的發(fā)現(xiàn)新的潛在生物活性分子的重要資源。敬釗纓毛蛛(Chilobrachys jingzhao,Chilobrachys guangxiensis) 是在我國(guó)海南省瓊中縣境內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，屬捕鳥蛛科(Theraphosidae)、棒刺蛛亞科(Selenocosmiinae)、纓毛蛛屬(Chilobrachys)。敬釗纓毛蛛雌、雄個(gè)體都較大，體型與海南捕鳥蛛和虎紋捕鳥蛛相似，背甲紅褐色，密布灰白色細(xì)毛，邊緣具較長(zhǎng)而且粗的硬毛，腹部淺黃褐色，有稀疏的棕色長(zhǎng)毛和濃密的淺黃褐色短細(xì)毛，穴居地下，主要以昆蟲和其他節(jié)肢動(dòng)物、蚯蚓、蝸?；蛐⌒图棺祫?dòng)物為食。該蜘蛛毒腺中的粗毒好比一個(gè)豐富的毒素肽庫(kù)，具有大量的毒素肽物質(zhì)。通過對(duì)敬釗纓毛蛛毒腺轉(zhuǎn)錄組和多肽組的研究，獲得大量毒素的分子遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了104個(gè)新型毒素分子[10-12]。目前，關(guān)于敬釗纓毛蛛毒素的研究主要集中在其作為修飾劑對(duì)離子通道的作用[13-20]。而由于蜘蛛毒液的量非常少，每只蜘蛛每次取毒僅10 μL左右，而其中包含上百種成分，因此，重組表達(dá)獲得活性多肽的技術(shù)成為尤其重要的途徑[21-24]。pMAL-p2x 是一種原核分泌型表達(dá)載體，能在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)高效分泌表達(dá)。pMAL-p2x的 5?端帶有一段信號(hào)肽與麥芽糖結(jié)合蛋白的融合蛋白，將表達(dá)產(chǎn)物分泌到大腸桿菌的胞間質(zhì)，以可溶的形式存在[25-29]。文中以敬釗纓毛蛛毒素中的兩個(gè)多肽為主要目標(biāo)蛋白，MBP為融合伴侶和純化標(biāo)簽，構(gòu)建到原核表達(dá)載體pMAL-p2x上，通過原核表達(dá)途徑實(shí)現(xiàn)了敬釗纓毛蛛毒素的基因工程高表達(dá)，為采用基因工程的手段大量獲得蜘蛛毒素奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：大腸桿菌Escherichia coli菌株DH5α、BL21(DE3)和TB1為本實(shí)驗(yàn)室保存。

質(zhì)粒：原核細(xì)胞融合表達(dá)載體質(zhì)粒pMAL-p2x由中山大學(xué)皮燦輝博士惠贈(zèng)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為Sprague-Dawley品系大白鼠，簡(jiǎn)稱 SD大鼠，由湖南師范大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房飼養(yǎng)提供。

培養(yǎng)液：DMEM干粉288 mg+NaCl 43 mg。溶于20 mL雙蒸水后，用1 mol/L NaOH調(diào)pH至7.40。如果DMEM中不含HEPES，則需要按體積比2∶l的比例加入。溶液配好后用99.9%的氧氣飽和10 min，并于34 ℃水浴預(yù)熱備用。

消化液：含膠原酶(Co11agenase IA，3.7–4.3 mg)、胰蛋白酶(Trypsin，1.7-2.0 mg) 和脫氧核糖核酸酶(Dnase IV，0.3 mg)。用上述5 mL充氧飽和的DMEM液體溶解，并于34 ℃水浴預(yù)熱備用。

消化抑制劑：胰蛋白酶抑制劑(Inhibitor)，5.5-7.6 mg。

試劑：限制性內(nèi)切酶、TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、10×緩沖液購(gòu)自深圳晶美公司；QIAGEN DNA膠回收試劑盒購(gòu)自安比奧公司；TIANGEN 的普通 DNA產(chǎn)物純化試劑盒，DNA ladder 購(gòu)自寶生物公司；低分子標(biāo)準(zhǔn)蛋白(14 000-97 000) 購(gòu)自華美生物公司；超低分子標(biāo)準(zhǔn)蛋白(2 060-81 000) 購(gòu)自鼎國(guó)公司；Factor Xa蛋白酶購(gòu)自Novagen或GE公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、丙烯酰胺(Ultra Pure Grade)、N,N-亞甲雙丙烯酰胺(Ultra Pure Grade)、過硫酸銨、N,N,N,N?-四甲基乙烯二胺、考馬斯亮藍(lán) R-250、考馬斯亮藍(lán)G-250、β-巰基乙醇、DTT、SDS、甘氨酸、Tricine和Tris堿等均購(gòu)自AMRESCO公司；三氟乙酸(TFA) 為ALDRICH公司產(chǎn)品，購(gòu)自生工生物工程(上海) 股份有限公司；DMEM干粉、膠原酶、胰蛋白酶、脫氧核糖核酸酶和胰蛋白酶抑制劑購(gòu)自Sigma公司；氨芐青霉素鈉鹽購(gòu)自華北制藥廠；胰蛋白胨和酵母提取物購(gòu)自O(shè)xoid公司；PCR擴(kuò)增jztx-26和jztx-51基因引物由生工生物工程(上海) 股份有限公司合成；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 載體制備

活化E.coliDH5α(pMAL-p2x)，根據(jù)質(zhì)粒小提試劑盒(離心柱型) 說明書的步驟，提取質(zhì)粒pMAL-p2x，置于–20 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

XmnⅠ和Hind Ⅲ酶切質(zhì)粒，根據(jù)普通 DNA產(chǎn)物純化試劑盒(離心柱型) 說明書的步驟進(jìn)行純化。

1.3 jztx-26和jztx-51基因的克隆與測(cè)序

為了簡(jiǎn)便有效地獲得目的基因進(jìn)行蛋白的原核表達(dá)，我們根據(jù)蜘蛛毒素的氨基酸序列和大腸桿菌的密碼子偏好性合成了相應(yīng)的基因。針對(duì)原核表達(dá)載體 pMAL-p2x 設(shè)計(jì)克隆蜘蛛毒素基因jztx-26和jztx-51的引物，5?端將進(jìn)行平末端化，在3?端引入酶切位點(diǎn)Hind Ⅲ。所設(shè)計(jì)的引物序列如表1所示。

采用PCR方法擴(kuò)增jztx-26和jztx-51基因，PCR體系組成如下：無(wú)菌 ddH2O，38.1 μL；10×PCR緩沖液，5.0 μL；25 mmol/L MgCl2，2 μL；cDNA，0.5 μL；Taq酶，0.4 μL；總體積 50.0 μL。PCR 反應(yīng)的條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。T4 DNA 聚合酶形成平末端：PCR 純化產(chǎn)物 44 μL；緩沖液 2.5 μL；BSA 0.5 μL；dNTPs 0.2 μL；T4 DNA 聚合酶，0.5 μL，置于 12 ℃水浴中 15 min。按試劑盒說明純化以上核酸后，Hind Ⅲ酶切，通過1.7%低熔點(diǎn)膠電泳進(jìn)行分離，并進(jìn)行切膠回收目的片段，回收產(chǎn)物與pMAL-p2x載體在16 ℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，隨機(jī)挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR，篩選出陽(yáng)性克隆，由生工生物工程(上海) 股份有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

表1 表達(dá)的毒素基因引物序列Table 1 Primers of toxin genes to be expressed

1.4 目的蛋白JZTX-26和JZTX-51的表達(dá)

表達(dá)流程如圖1所示。將重組表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化DH5α、TB1和BL21(DE3) 三種感受態(tài)細(xì)胞，挑取轉(zhuǎn)化后的單菌落于含葡萄糖的5 mL 富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(含0.1 mg/mL Amp) 的試管中培養(yǎng)過夜，次日按比積以1∶100的比例在500 mL同樣的培養(yǎng)基里放大培養(yǎng)至OD600值0.4-0.6之間時(shí)，加入IPTG至終濃度為 6×10–4mol/L，誘導(dǎo)表達(dá)4-6 h。

利用蔗糖梯度滲透壓改變裂解細(xì)胞壁，由于目的蛋白與MBP融合表達(dá)，因此可與Amylose 樹脂親和吸附，然后用麥芽糖進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰，得到該融合蛋白的初步純化產(chǎn)物，并測(cè)定蛋白濃度。

圖1 蛋白融合表達(dá)流程圖Fig.1 Flow chart for fusion expression.

1.5 Amylose親和層析柱純化、透析及SDS-PAGE分析

將親和純化得到的溶液進(jìn)行透析，除去溶液中的小分子蛋白及鹽類物質(zhì)，SDS-PAGE分析。然后凍干，以備酶切。

1.6 酶切、分子篩純化及反相色譜純化

將凍干得到的融合蛋白用 Factor Xa進(jìn)行酶切，切去前面的MBP，采用分子篩進(jìn)行分離。將濃縮后的樣品，采用C18反向柱(10 mm×250 mm)進(jìn)一步純化。反相得到的洗脫峰經(jīng)質(zhì)譜鑒定后，取其中與目的蛋白理論分子量一致的峰進(jìn)行凍干以備活性鑒定。

1.7 JZTX-26和JZTX-51對(duì)DRG鈉離子通道電流的影響

挑選出生4周左右，體重約為140-200 g的SD大鼠，麻醉后斷頸處死，迅速挑出脊椎并將其剪成2-4段，將椎管沿與肋骨垂直的方向剪開，然后在盛有少量培養(yǎng)液的燒杯中浸泡椎管，仔細(xì)撕破附在椎管內(nèi)壁上的無(wú)色黏膜，暴露椎管和肋骨交匯處的背根神經(jīng)纖維。在胸椎和腰椎部分，可挑選10-15個(gè)較好的背根神經(jīng)節(jié)放入裝有2 mL臨時(shí)培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中。分離出神經(jīng)節(jié)以及神經(jīng)纖維后，用維娜斯剪切除神經(jīng)節(jié)外的絮狀物和軸索，放入盛有約0.5 mL臨時(shí)培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中。倒去臨時(shí)培養(yǎng)液，用維娜斯剪將分離的神經(jīng)節(jié)剪碎。然后將剪碎后神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)入含有15 mL消化液的指形管中，在34 ℃、110 r/min的環(huán)境中用消化液酶解20-30 min。酶解期間每隔8-10 min取出指形管吹打細(xì)胞以防細(xì)胞成團(tuán)，酶解終止后向消化液中加入胰蛋白酶抑制劑，終止酶解反應(yīng)。將酶解后的溶液轉(zhuǎn)入離心管中離心(1 000 r/min，2-5 min)，去除上清。用含 10%小牛血清的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，重懸后的細(xì)胞分成3-4皿，每皿加入2 mL培養(yǎng)液，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)(5% CO2，95%空氣) 中，培養(yǎng)3-4 h后可用于記錄電流。

倒置顯微鏡下選擇細(xì)胞膜較為光滑、細(xì)胞質(zhì)均勻的細(xì)胞，在室溫 2 0-25 ℃ 條件下進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)。選用100 μL硼硅酸鹽玻璃毛細(xì)管為玻璃電極材料，待電極與細(xì)胞膜之間形成高阻抗的京歐(GΩ) 封接后，補(bǔ)電極快電容。然后將細(xì)胞鉗制在–60 mV，給予一短而有力的負(fù)壓，將鉗制在電極中的細(xì)胞膜迅速打破，再補(bǔ)償細(xì)胞慢電容。形成全細(xì)胞記錄模式后將細(xì)胞鉗制為–80 mV，細(xì)胞穩(wěn)定4-6 min開始記錄電流。

2 結(jié)果與分析

2.1 JZTX-26和JZTX-51基因序列及分析

目的蛋白基因來源于蜘蛛毒素cDNA文庫(kù)[11]。兩個(gè)毒素的前體都含有信號(hào)肽、中間肽和成熟肽(圖 2、圖 3)。JZTX-26 成熟肽(35 aa) 和 JZTX-51成熟肽(27 aa) 均含3對(duì)二硫鍵，但兩者的序列同源性非常低，分屬于兩個(gè)不同家族。根據(jù)同源性分析，確定兩個(gè)多肽均為ICK分子，二硫鍵的連接方式分別為：JZTX-51：C2-C18，C9-C21，C17-C26；JZTX-26：C3-C18，C10-C23，C17-C30[11]。本實(shí)驗(yàn)是將成熟肽序列分別構(gòu)建到表達(dá)載體pMAL-p2x上。

2.2 重組表達(dá)載體 pMAL-jz26和 pMAL-jz51的構(gòu)建

瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)cDNA文庫(kù)片段jztx-26和jztx-51的PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖4所示，純化與預(yù)測(cè)大小相符PCR產(chǎn)物，用T4 DNA聚合酶補(bǔ)齊末端，純化，用HindⅢ 酶切，再次純化備用。

圖2 JZTX-51的cDNA和氨基酸序列Fig.2 Amino acid and cDNA sequence of JZTX-51.The sequence of signal peptide was marked in italic font.The sequence of mature peptide was underlined by solid line.

載體制備，將純化的pMAL-p2x質(zhì)粒分別用XmnⅠ和Hind Ⅲ 先后酶切，純化備用。

將酶切好的毒素基因片段與線性化載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 TB1和 BL21。氨芐青霉素抗性篩選，菌落 PCR 檢測(cè)陽(yáng)性克隆(圖5)，進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序正確的克隆分別命名為pMAL-jz26和pMAL-jz51。

2.3 目的蛋白JZTX-26和JZTX-51的表達(dá)

宿主菌TB1是該表達(dá)系統(tǒng)中配套的表達(dá)宿主菌株。而宿主菌BL21(DE3) 因所含的內(nèi)源蛋白酶較少，是用于E.coli重組表達(dá)的通用菌株。比較兩種宿主菌BL21(DE3) 和TB1在相同條件下重組蛋白的表達(dá)量及可溶性，結(jié)果表明，兩種轉(zhuǎn)化菌都能表達(dá)重組可溶性較好的融合蛋白，宿主菌BL21(DE3) 菌株的表達(dá)量高，但是出現(xiàn)3條重組蛋白帶；TB1菌株表達(dá)的產(chǎn)物都可得到特異的重組蛋白帶，最終我們選擇TB1 作為重組表達(dá)用工程菌株。由于表達(dá)的小肽富含二硫鍵，選用較低濃度的IPTG，低溫并長(zhǎng)時(shí)間誘導(dǎo)。當(dāng)工程菌生長(zhǎng)至OD600=0.8時(shí)，添加終濃度為1×10–4mol/L的IPTG，在24 ℃誘導(dǎo)3 h左右，離心收取菌體，冷凍滲透處理。SDS-PAGE檢測(cè)外源蛋白的表達(dá)量及可溶性(圖6)。

圖3 JZTX-26的cDNA和氨基酸序列Fig.3 Amino acid and cDNA sequence of JZTX-26.The sequence of signal peptide was marked in italic font.The sequence of mature peptide was underlined by solid line.

圖4 jztx-26和jztx-51基因的PCR電泳圖Fig.4 2.0% agarose gel electrophoresis of PCR products of jztx-26 and jztx-#ne M: 100 bp DNA ladder; lane 1: JZTX-26; lane 2: JZTX-51; lane 3:negative control.

圖5 陽(yáng)性克隆子菌落PCR電泳圖Fig.5 Colong PCR analysis of recombinants.(A)JZTX-#ne M: 100 bp DNA ladder; lanes 1–6:recombinants; lane 7: negative control.(B) JZTX-26.lane M: 100 bp DNA ladder; lanes 1–3: recombinants;lane 4: negative control.

2.4 融合蛋白的親和純化

由于重組敬釗毒素融合蛋白在氨基端有MBP標(biāo)簽，因此可與Amylose樹脂親和吸附，然后用麥芽糖進(jìn)行洗脫。含MBP-JZTX的上清液流過Amylose親和柱，然后用濃度為0.01 mol/L的麥芽糖(緩沖體系為0.02 mol/L Tris-HCl，pH 8.0)溶液洗脫，收集洗脫峰，得到該融合蛋白的初步純化產(chǎn)物，并采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。初步純化產(chǎn)物過夜透析，凍干。

圖6 SDS-PAGE檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)Fig.6 SDS-PAGE analysis of recombinants expression.lane M: protein marker; lane 1: JZTX-26 expressed by BL21(DE3); lane 2: JZTX-26 expressed by TB1; lane 3:JZTX-51 expressed by BL21(DE3); lane 4: JZTX-51 expressed by TB1.

2.5 融合蛋白的酶切與目的蛋白的純化

重組敬釗毒素和融合伴侶 MBP之間有蛋白酶 Factor Xa的酶切位點(diǎn)。純化的融合蛋白通過Factor Xa蛋白酶切使目的蛋白與融合伴侶分離。經(jīng)過對(duì)酶切實(shí)驗(yàn)條件的摸索，我們最終選擇20 ℃作為最適酶切溫度。

酶切后的蛋白采用凝膠過濾和超濾手段進(jìn)行分離純化和濃縮。由于目的小肽與未切割融合蛋白和融合伴侶體的分子量差別較大，因此利用分子篩效應(yīng)，根據(jù)蛋白分子量的大小將蛋白分開。采用Sepharose G50分子篩凝膠層析來進(jìn)行分離，并檢測(cè)洗脫液在280 nm和215 nm處波長(zhǎng)的紫外吸收值。經(jīng)過Sepharose G50凝膠過濾層析，我們檢測(cè)到4個(gè)紫外吸收峰，將這 4個(gè)峰進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，確定第3個(gè)峰中有與目的多肽一致的分子量。按照出峰時(shí)間的先后，大分子量的成分較先洗脫，因此，推測(cè)這4個(gè)峰主要成分依次是Factor Xa酶、MBP、目的蛋白和酶切體系中的小分子化合物(圖7)。

我們收集其中的第3個(gè)峰進(jìn)一步純化。經(jīng)過凍干濃縮，然后利用融合伴侶和目的小肽它們?cè)谑杷陨系牟町?，進(jìn)行反相高效液相色譜的分離，從而達(dá)到制備高純度目的小肽的目的。

圖7 凝膠過濾層析檢測(cè)融合蛋白MBP-JZTX-26酶切Fig.7 Gel filtration chromatography of cleaved proteins.The chromatography was performed on Sephadex G50 column(1.6 cm×85 cm) with flow rate 0.3 mL/min.Fraction 1: protease Factor Xa and anonymous proteins; Fraction 2: MBP with a little uncleaved fusion protein; Fraction 3: purified recombinant protein JZTX-26; Fraction 4: DTT and others from cleavage buffer.

高效液相色譜層析采用了水和乙腈流動(dòng)相體系，并在體系中加入了0.1% TFA作為修飾性離子對(duì)物質(zhì)以增加樣品的疏水性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著流動(dòng)相中乙腈濃度的遞增，通過檢測(cè)215 nm處的紫外吸收值，可以得到一個(gè)明顯的洗脫峰和前后一些小的雜峰(圖8)。

2.6 質(zhì)譜鑒定

取高效液相色譜分離后的目的蛋白峰通過質(zhì)譜鑒定其分子量。結(jié)果顯示，保留時(shí)間為13.4 min的洗脫峰中組分(JZTX-51) 的分子量與目的小肽的分子量(預(yù)測(cè)MW=2 902) 相吻合(圖9)，保留時(shí)間為 21.6 min的洗脫峰中組分(JZTX-26)的分子量與目的小肽的分子量(預(yù)測(cè)MW=4 144)相吻合(圖10)。通過進(jìn)一步純化，多肽和融合伴侶得到了較好的分離。

2.7 ZJTX-51和ZJTX-26的活性鑒定

在全細(xì)胞模式下，檢測(cè)毒素對(duì) DRG細(xì)胞上TTX-S鈉離子通道和TTX-R鈉離子通道電流-電壓(I-U) 曲線影響，以研究毒素對(duì)鈉離子通道開放的影響。細(xì)胞鉗制電位–80 mV，測(cè)試電壓變化范圍–80 - +50 mV，測(cè)試電壓持續(xù)時(shí)間50 ms，躍遷步幅+10 mV。在空白對(duì)照條件下，TTX-S鈉離子通道的初始激活電壓為–40 mV，電流最大峰值時(shí)電壓為–20 mV左右，逆轉(zhuǎn)電位約為+20 mV左右。在細(xì)胞外液中分別加入10 μmol/L重組表達(dá)的JZTX-51、從粗毒中分離純化的JZTX-51[13]或重組表達(dá)的JZTX-26，讓毒素與細(xì)胞作用2 min，再以相同的去極化脈沖誘導(dǎo)產(chǎn)生電流–電壓(I-U) 曲線。結(jié)果如圖11所示，加入10 μmol/L重組表達(dá)的JZTX-26后，有10%的TTX-S鈉通道電流被抑制，但是對(duì)TTX-R鈉通道電流基本上無(wú)抑制作用；加入10 μmol/L重組表達(dá)的JZTX-51和粗毒中分離純化的 JZTX-51對(duì) TTX-S鈉通道和TTX-R鈉通道的電流均無(wú)抑制作用。

圖8 HPLC分離純化重組JZTX-51(A) 和JZTX-26(B)Fig.8 Reverse Phase HPLC separation of recombinant JZTX-51(A) and JZTX-26(B).

圖9 JZTX-51質(zhì)譜鑒定Fig.9 MALDI-TOF-TOF analysis of JZTX-51.

圖10 JZTX-26質(zhì)譜鑒定Fig.10 MALDI-TOF-TOF analysis of JZTX-26.

圖11 重組表達(dá)的JZTX-26、分離純化的JZTX51和重組表達(dá)的JZTX-51對(duì)大鼠DRG細(xì)胞上鈉通道的作用Fig.11 Effects of expressed JZTX-26(JZTX-26(R)),JZTX-51 purified from venom(JZTX-51(N)) and expressed JZTX-51(JZTX-51(R)) on the sodium channels in rat DRG neurons.(A) Effects of JZTX-26(R) on tetrodotoxin-sensitive(TTX-S) sodium channels in rat DRG neurons.(B) Effects of JZTX-26(R) on tetrodotoxin-resistant sodium(TTX-R)channels in rat DRG neurons.(C) Effects of JZTX-51(N) and JZTX-51(R) on tetrodotoxin-sensitive(TTX-S) sodium channels in rat DRG neurons.(D) Effects of JZTX-51(N) and JZTX-51(R) on tetrodotoxin-resistant(TTX-R) sodium channels in rat DRG neurons.

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用了以MBP為融合伴侶的pMAL-p2x融合表達(dá)系統(tǒng)，它具有以下特點(diǎn)：1) 采用優(yōu)化的TIR(Translation-initiation region) 和Ptac強(qiáng)啟動(dòng)子，可進(jìn)行穩(wěn)定高效表達(dá)。2) 含大腸桿菌的分子伴侶 MBP，其構(gòu)象嚴(yán)緊，熱穩(wěn)定性好，當(dāng) MBP在細(xì)胞內(nèi)被過量表達(dá)時(shí)仍不被細(xì)菌蛋白酶降解，在細(xì)胞內(nèi)能協(xié)助蛋白的正確折疊，大大提高產(chǎn)量。3) 加入了柔韌區(qū)，這樣在融合伴侶和外源蛋白之間提供一個(gè)過渡，減少兩者在空間結(jié)構(gòu)上的相互干擾以及可能出現(xiàn)的剛性結(jié)構(gòu)，另外還有利于蛋白酶對(duì)融合蛋白的切割。4) 具有信號(hào)肽，可分泌到細(xì)菌周質(zhì)空間，有利于二硫鍵的形成，另外通過冷凍滲透提取蛋白可去掉絕大部分雜蛋白。5)最大的缺點(diǎn)是融合蛋白必須經(jīng)過酶切才能得到目的蛋白，而酶切條件非常敏感。

針對(duì)不同的多肽，IPTG濃度對(duì)重組表達(dá)產(chǎn)物會(huì)有一定的影響，一方面更高的濃度可以誘導(dǎo)高效的融合蛋白表達(dá)，而有時(shí)候表達(dá)量過高容易形成包涵體，不利于正確構(gòu)型的形成；另一方面，IPTG對(duì)宿主菌也有一定的毒性。再者，由于目的蛋白要形成3對(duì)二硫鍵，因此選擇較低濃度。

融合蛋白MBP-JZTX經(jīng)酶切后，需要將酶、融合伴侶和未切割的融合蛋白與毒素蛋白分離，根據(jù)這些分子量和電荷性質(zhì)的差異，我們嘗試了分子篩凝膠過濾層析和離子交換層析等進(jìn)行純化。但是對(duì)于小量的樣品，實(shí)驗(yàn)中嘗試采用了超濾的方法，取得了比較理想的結(jié)果。通過對(duì)酶切后的蛋白進(jìn)行反相HPLC分析，出峰單一，表明體系中在5 kDa分子量以下的雜蛋白較少，因此，也可以通過10 kDa超濾膜的分離，得到主要組分為目的小肽，除去絕大部分的大分子雜蛋白。利用Factor Xa因子對(duì)融合蛋白進(jìn)行酶切時(shí)，在溫度的優(yōu)化中設(shè)置了10 ℃、20 ℃、37 ℃ 3個(gè)不同的溫度梯度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MBP-JZTX在20 ℃切割16 h，目的蛋白可以完全切開；在10 ℃下切割16 h，融合蛋白不能完全切開；而在37 ℃下切割16 h，容易出現(xiàn)非特異性切割。從而確定了酶切溫度為20 ℃。

最后的純化是采用反相高效液相色譜。在反相色譜分離中，小肽的疏水性會(huì)大于大分子量的蛋白質(zhì)，由于差異流動(dòng)相的 pH對(duì)樣品溶質(zhì)的電離狀態(tài)影響很大，進(jìn)而影響其疏水性，所以在分離肽類和蛋白質(zhì)等生物大分子的過程中，通常要加入修飾性的離子對(duì)物質(zhì)，最常用的離子對(duì)試劑是TFA(三氟乙酸)，使用濃度為0.1%，使流動(dòng)相的pH值為2-3，這樣可以有效地抑制氨基酸上α-羧基的解離，使其疏水性增加，延長(zhǎng)洗脫時(shí)間，提高分辨率和分離效果。對(duì)于檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇，由于215 nm波長(zhǎng)主要反映蛋白質(zhì)肽鍵的情況，蛋白質(zhì)肽鍵含量豐富，因此靈敏度高，較適用于小肽檢測(cè)。280 nm的光吸收主要反映蛋白質(zhì)中含苯環(huán)的氨基酸，相對(duì)于肽鍵來說，其含量較低，靈敏度也相對(duì)較低。于是，實(shí)驗(yàn)中采用了水和乙腈流動(dòng)相體系，體系中加入了0.1% TFA進(jìn)行反相高效液相色譜的分離，洗脫液分別通過 215 nm和280 nm兩種波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，取得了較理想的分離效果。

蜘蛛活性多肽毒素只有在具有正確二硫鍵時(shí)才具有生物活性，我們采用的是細(xì)菌分泌表達(dá)的方式，這種方式表達(dá)的蛋白帶有一段信號(hào)肽，信號(hào)肽引導(dǎo)著蛋白穿過細(xì)胞膜進(jìn)入大腸桿菌的周質(zhì)空間，信號(hào)肽隨后被切除。在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，蛋白一般要變成線性分子以穿過細(xì)胞膜，而到了周質(zhì)空間后，蛋白在一些分子伴侶的幫助下重新再折疊形成具有空間結(jié)構(gòu)的分子，因此，理論上可以得到有正確結(jié)構(gòu)的目標(biāo)蛋白。從反相HPLC結(jié)果可知，表達(dá)的融合蛋白酶切后獲得的目的蛋白出峰單一，表明目的表達(dá)產(chǎn)物的構(gòu)象基本一致。我們采用真核系統(tǒng)表達(dá)JZTX-III時(shí)，將表達(dá)產(chǎn)物與天然分離的產(chǎn)物進(jìn)行反相HPLC共洗脫，其洗脫峰能重疊，表明構(gòu)象一致[30]。由于天然分離的這兩種毒素成分都非常少，我們未能進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)確認(rèn)其構(gòu)象。

大部分蜘蛛毒素作用于細(xì)胞膜上的各種離子通道或配體門控通道。DRG細(xì)胞是脊椎動(dòng)物脊髓背根內(nèi)的一種假單極感覺神經(jīng)元。到目前為止所發(fā)現(xiàn)的離子通道類型在 DRG上幾乎都有表達(dá)，DRG上發(fā)現(xiàn)的通道數(shù)目不下于20種。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，分離純化的 JZTX-51和重組表達(dá)的JZTX-51對(duì)DRG細(xì)胞的TTX-S鈉通道和TTX-R鈉通道的阻斷均沒有明顯作用，重組表達(dá)的JZTX-26能抑制小部分TTX-S鈉通道的電流，對(duì)于TTX-R鈉通道的電流沒有抑制作用。這兩種多肽毒素的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

在海洋生物毒素中，芋螺毒素與蜘蛛毒素有很多相似之處，如分子量小、二硫鍵豐富等，并且兩者都是多肽類神經(jīng)毒素[31-32]，另外，還有河豚毒素也具有同樣的特性，并且它還具有耐高溫的優(yōu)點(diǎn)[33]。這為蜘蛛等昆蟲毒素后期的研究提供了方向。