HS/SPME-GC/MS法研究大菱鲆和南美白對蝦冷藏中的典型TVB-N組分變化規(guī)律

晁晴晴,周賀彩,曹立民,林 洪,隋建新

(中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003)

大菱鲆(Scophthalmusmaximus)又稱蝴蝶魚、多寶魚,口感優(yōu)良、營養(yǎng)價(jià)值高,主要產(chǎn)于大西洋東側(cè)沿海,是名貴的低溫經(jīng)濟(jì)魚類,我國山東地區(qū)養(yǎng)殖量較大[1]。南美白對蝦(Penaeusvannamei)又稱白肢蝦、白對蝦,學(xué)名為凡納濱對蝦,肉質(zhì)鮮嫩、富含氨基酸蛋白質(zhì),是目前世界上三大養(yǎng)殖對蝦中單產(chǎn)量最高的蝦種,也是我國最主要的養(yǎng)殖品種[1]。TVB-N是動(dòng)物性蛋白質(zhì)在酶和微生物的作用下產(chǎn)生的氨以及胺類等堿性含氮物質(zhì),與腐敗過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸相結(jié)合,形成的一種具有揮發(fā)性的鹽基態(tài)氮,主要包括NH3、MA、DM和TMA[2]。TVB-N作為評價(jià)水產(chǎn)品鮮度的指標(biāo)已被廣泛使用[2],但是TVB-N在貯藏過程中會(huì)出現(xiàn)下降或出現(xiàn)波動(dòng),用于評價(jià)某些水產(chǎn)品的鮮度并不可靠[2,3-5],有報(bào)道稱TMA[6]、TMA/TVB-N[7]等作為鮮度的評價(jià)指標(biāo)會(huì)比TVB-N更為可靠。不同水產(chǎn)品在腐敗過程中TVB-N的變化不同,其各組分的變化也存在差異,因此準(zhǔn)確、系統(tǒng)地分析表征不同種類水產(chǎn)品腐敗過程中TVB-N各組分的變化規(guī)律,可為更加深入、全面地分析評價(jià)各種水產(chǎn)品的鮮度提供新的依據(jù)和思路。

目前關(guān)于TVB-N主要組分的檢測方法有苦味酸比色法、氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等?？辔端岜壬ㄊ菧y定火腿中TMA的國標(biāo)方法,其實(shí)際檢測的是各種能與苦味酸結(jié)合的有機(jī)胺的總和,結(jié)果偏高,且需要用到高毒試劑甲苯[8];氣相色譜法是揮發(fā)性物質(zhì)的常用檢測方法,但是揮發(fā)性胺類物質(zhì)分子質(zhì)量小且具有高水溶性[9],在大多數(shù)色譜柱上會(huì)很快溜出[10],一般需要有機(jī)溶劑提取,導(dǎo)致靈敏度降低[11];頂空固相微萃取技術(shù)可使取樣和富集同時(shí)進(jìn)行,與氣相色譜、質(zhì)譜聯(lián)用,不僅快速高效，還可以減少樣品流失,目前已用于水產(chǎn)品[12-15]及其它食品中[16-17]多種揮發(fā)性物質(zhì)的分離鑒定,顧強(qiáng)等[18]利用HS/SPME-GC/MS技術(shù)檢測了食用油中6種苯系物殘留量,呂光等[19]利用該技術(shù)同時(shí)檢測了生活飲用水中9種半揮發(fā)性有機(jī)物含量,利用該方法進(jìn)行水產(chǎn)品中TVB-N多種組分的同時(shí)定量檢測分析卻鮮有報(bào)道。

本研究旨在利用HS/SPME-GC/MS技術(shù),優(yōu)化萃取條件,建立同時(shí)檢測NH3、MA、DMA和TMA的方法,然后探究不同種類水產(chǎn)品大菱鲆和南美白對蝦冷藏過程中TVB-N四種主要組分含量的變化,為分析理解不同水產(chǎn)品中揮發(fā)性胺類物質(zhì)在加工流通過程中的變化及其對鮮度評價(jià)的影響提供進(jìn)一步的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活大菱鲆(規(guī)格一致,1.0～1.5 kg/條)、鮮活南美白對蝦(規(guī)格一致,15～20 g/只) 青島市利群超市;氯化銨(NH3)、甲胺鹽酸鹽(MA)、二甲胺鹽酸(DMA)、三甲胺鹽酸鹽(TMA) 上海麥克林生物科技有限公司;三氯乙酸 天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司;無水碳酸鉀 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;其它試劑 均為分析純。

GCMS-QP2010SE 日本SHIMADZU;50/30 μm二乙烯苯/碳分子篩/聚二甲基硅烷(Divinylbenzene/Carboxen/Polydimethylsiloxan,50/30 μm DVB/CAR/PDMS)、65 μm PDMS/DVB、65 μm PDMS/DVB+OC、75 μm CAR/PDMS、85 μm CAR/PDMS萃取纖維 美國SUPELCO;SPME手動(dòng)進(jìn)樣手柄 美國SUPELCO;CP-Volamine色譜柱 美國Agilent Technologies;DF101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 河南省予華儀器有限公司;西貝樂2119F食品加工機(jī) 上海帥佳電子科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同水產(chǎn)品在冷藏過程中TVB-N主要組分的變化規(guī)律

1.2.1.1 樣品處理 鮮活大菱鲆和南美白對蝦運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室,大菱鲆敲頭致死,去頭去尾去皮去內(nèi)臟,取魚肉;南美白對蝦碎冰休克致死,去頭剝殼去腸線,取蝦肉。將大菱鲆肌肉和蝦肌肉瀝干,每20 g分裝用于TVB-N組分的測定。所有樣品均置于4 ℃冰箱中冷藏。每隔兩天取大菱鲆樣品進(jìn)行測定,每天取蝦肉樣品進(jìn)行測定。

1.2.1.2 樣品TVB-N主要組分的測定 取分裝好的試樣,攪碎至糜狀,精確稱取10 g置于具塞錐形瓶中,準(zhǔn)確加入100 mL 5%三氯乙酸,不時(shí)振搖,使試樣在樣液中分散均勻,浸漬30 min后過濾。準(zhǔn)確吸取1 mL濾液于8 mL樣品瓶中,按照1.2.3.1的方法進(jìn)行測定,計(jì)算樣品NH3、MA、DMA和TMA的質(zhì)量濃度。

1.2.2 TVB-N各組分檢測條件的確定

1.2.2.1 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用條件 色譜條件:CP-Volamine色譜柱(30 m×0.32 mm×5 μm),載氣He,分流進(jìn)樣,分流比5∶1,流速1.5 mL/min,進(jìn)樣口溫度200 ℃,柱溫程序?yàn)?5 ℃,保持4 min,以15 ℃/min升高至100 ℃,保持3 min。質(zhì)譜條件:接口溫度250 ℃,離子源溫度230 ℃,檢測電壓0.88 kV,溶劑延遲0.5 min。選擇全掃描(SCAN)模式定性,離子掃描(SIM)模式定量,在SIM模式下,四種揮發(fā)性胺類物質(zhì)的保留時(shí)間、目標(biāo)離子、參考離子見表1。

表1 SIM模式下NH3、MA、DMA和TMA的保留時(shí)間及特征離子Table 1 The scanned ions and retention times of NH3,MA,DMA and TMA under SIM mode

1.2.2.2 萃取纖維的確定 分別配制100、300、500、700、900 mg/100 mL的NH3、MA、DMA和TMA標(biāo)準(zhǔn)溶液,40 ℃條件下,使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS,65 μm PDMS/DVB,65μm PDMS/DVB+OC,75 μm CAR/PDMS,85 μm CAR/PDMS五種萃取纖維分別進(jìn)行萃取,比較各萃取纖維的吸附萃取能力,確定是否達(dá)到各個(gè)纖維的飽和吸附量,選擇出同時(shí)萃取NH3、MA、DMA和TMA的最佳萃取纖維。

1.2.2.3 萃取溫度的確定 用NH3、MA、DMA和TMA配制濃度為30 mg/100 mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,固定萃取轉(zhuǎn)速200 r/min,萃取時(shí)間5 min,分別考察20、30、40、50、60、70 ℃時(shí)85 μm CAR/PDMS萃取纖維對NH3、MA、DMA和TMA的萃取能力,選擇出合適的萃取溫度。

1.2.2.4 萃取時(shí)間的確定 固定萃取溫度40 ℃,轉(zhuǎn)速200 r/min,分別考察萃取時(shí)間為1、3、5、7、10、15、20 min時(shí),NH3、MA、DMA和TMA的萃取量,選擇出合適的萃取時(shí)間。

1.2.3 HS/SPME-GC/MS萃取方法對TVB-N組分檢測效果的鑒定

1.2.3.1 TVB-N各組分標(biāo)準(zhǔn)曲線測定 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:使用5%三氯乙酸分別配制濃度為1 g/100 mL的NH3、MA、DMA和TMA標(biāo)準(zhǔn)儲備液,4 ℃條件下保存。標(biāo)準(zhǔn)使用溶液:分別吸取一定體積的NH3、MA、DMA和TMA標(biāo)準(zhǔn)儲備液,使用5%三氯乙酸將標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液梯度稀釋至0.1、0.5、1.0、3.0、5.0、7.5、10、15、20、30、50、100 mg/100 mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取1 mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于8 mL樣品瓶中,密封,使用2 mL無菌注射器加入2 mL飽和碳酸鉀,選擇85 μm CAR/PDMS 萃取纖維,設(shè)定萃取溫度40 ℃,轉(zhuǎn)速200 r/min,萃取5 min。萃取完成后,將萃取纖維迅速從頂空瓶中抽出,插入進(jìn)樣口進(jìn)行解吸,解吸時(shí)間1 min。每個(gè)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度做三次平行。

1.2.3.2 精密度實(shí)驗(yàn) 配制濃度為5 mg/100 mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按上述方法進(jìn)行六次平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.3 回收率實(shí)驗(yàn) 向大菱鲆和南美白對蝦提取液中分別加標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別計(jì)算NH3、MA、DMA和TMA的加標(biāo)回收率,每種揮發(fā)性胺類物質(zhì)分別添加三個(gè)濃度,每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.3.4 方法檢測限 配制低濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,以該實(shí)驗(yàn)條件下儀器能檢出的最低樣品濃度為方法檢出限,以儀器顯示的信噪比S/N=3計(jì)算儀器檢出限。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Origin 8.5軟件進(jìn)行繪圖,采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,同時(shí)采用LSD法進(jìn)行兩兩比較,p<0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 TVB-N各組分萃取條件的確定

2.1.1 萃取纖維的確定 使用不同的萃取纖維進(jìn)行萃取,探究不同萃取纖維對NH3、MA、DMA和TMA萃取能力,結(jié)果如圖1所示,85 μm CAR/PDMS萃取纖維對NH3、MA和DMA吸附能力最強(qiáng),尤其在濃度低于300 mg/100 mL時(shí),85 μm CAR/PDMS萃取纖維吸附優(yōu)勢明顯;而五種萃取纖維對TMA的吸附效果沒有顯著差異(p>0.05)。綜合考慮食品中TVB-N要遠(yuǎn)低于300 mg/100 g,本研究確定采用85 μm CAR/PDMS萃取纖維測定TVB-N組分及含量。

圖1 不同萃取纖維對NH3、MA、DMA和TMA的萃取能力Fig.1 Extraction ability of different extraction fibers to NH3，MA，DMA and TMA

2.1.2 萃取溫度的確定 固定萃取轉(zhuǎn)速和萃取時(shí)間,探究萃取溫度對NH3、MA、DMA和TMA萃取能力的影響。萃取溫度對富集過程的影響具有雙重性[20-21],對于HS-SPME來說,加熱有助于分析物脫離復(fù)雜的基體進(jìn)入頂空氣相,但吸附是放熱過程,平衡條件下,溫度的升高會(huì)使分析物在涂層和樣品中的分配系數(shù)減小,靈敏度降低[20]。由圖2可知,四種物質(zhì)的萃取效果均隨溫度的升高先上升后下降,超過50 ℃四種物質(zhì)的吸附能力均下降,說明高溫下低沸點(diǎn)成分在萃取纖維上更容易被解吸[22]。NH3、MA、DMA和TMA分別在40、30、50、30 ℃萃取效果最好。30 ℃時(shí)MA和TMA的萃取精密度低,重復(fù)性較差;50 ℃時(shí)除DMA外其余三種物質(zhì)的萃取效果明顯下降;40 ℃時(shí),四種物質(zhì)的精密度均較高,且萃取效果良好,綜合精密度及萃取效果,確定萃取溫度為40 ℃。

圖2 萃取溫度對NH3、MA、DMA和TMA萃取量的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction of NH3,MA,DMA and TMA

2.1.3 萃取時(shí)間的確定 固定萃取溫度和轉(zhuǎn)速,探究萃取時(shí)間對NH3、MA、DMA和TMA萃取能力的影響,85 μm CAR/PDMS為多孔固相涂層,萃取纖維對樣品的吸附屬于競爭吸附,為避免樣品中的組分的競爭吸附影響定量,應(yīng)在非平衡態(tài)下較短時(shí)間內(nèi)萃取[18]。由圖3可知,當(dāng)萃取時(shí)間為3 min時(shí),NH3的萃取量最大,但此時(shí)重復(fù)性差;MA在15 min時(shí)萃取效果最好,但其它三種物質(zhì)在15 min時(shí)萃取效果均有所降低,DMA和TMA在萃取時(shí)間為5 min時(shí)萃取量最大,且重復(fù)性好。綜合考慮重復(fù)性與萃取量,選擇萃取時(shí)間5 min。

圖3 萃取時(shí)間對NH3、MA、DMA和TMA萃取量的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction of NH3,MA,DMA and TMA

2.2 HS/SPME-GC/MS對于TVB-N組分的檢測效果

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 由于競爭性吸附效應(yīng)的存在,不同濃度的物質(zhì)在萃取纖維上的吸附程度不一致會(huì)導(dǎo)致線性范圍較窄[23]。由表2可知,建立的HS/SPME-GC/MS方法測得的NH3、MA、DMA、TMA線性范圍良好,相關(guān)系數(shù)均在0.999以上,可用于樣品檢測。

表2 NH3、MA、DMA和TMA的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)Table 2 Linear range,regression equation and correlation coefficient of NH3,MA,DMA and TMA

2.2.2 精密度的測定 由表3可知,該方法條件下四種物質(zhì)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在2.21%～5.64%,精密度較好,穩(wěn)定性較高,楊宇川等[23]指出由于競爭吸附效應(yīng)使得低沸點(diǎn)物質(zhì)精密度低于高沸點(diǎn)物質(zhì)。

表3 NH3、MA、DMA和TMA的精密度Table 3 The RSD levels of NH3,MA,DMA and TMA

2.2.3 回收率的測定 由表4可知,大菱鲆NH3、MA、DMA和TMA的加標(biāo)回收率分別為97.10～98.60%、88.72%～93.50%、91.80%～96.00%、86.23%～91.13%;由表5可知,南美白對蝦NH3、MA、DMA和TMA的加標(biāo)回收率分別為81.00%～108.78%、78.27%～94.27%、88.67%～94.33%和99.7%～103%,回收率較高,符合一般檢測的回收率要求。

表4 大菱鲆NH3、MA、DMA和TMA的回收率Table 4 The recoveries of NH3,MA,DMA and TMA of Scophthalmus maximus

表5 南美白對蝦NH3、MA、DMA和TMA的回收率Table 5 The recoveries of NH3,MA,DMA and TMA of Penaeus vannamei

2.2.4 檢測限的測定 在本實(shí)驗(yàn)條件下,NH3、MA、DMA和TMA的方法檢出限分別為0.5、1、1、0.1 mg/100 mg;儀器檢出限分別為0.021、0.029、0.025和0.003 mg/100 mg,符合一般檢測要求,可進(jìn)行樣品測定。

整體來看,本研究所建立的HS/SPME-GC/MS檢測技術(shù),具有較高的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度,充分滿足實(shí)際檢測要求;利用5%三氯乙酸進(jìn)行樣本提取,有效避免了甲苯等有機(jī)溶劑的使用,充分體現(xiàn)出綠色安全的特點(diǎn)。與傳統(tǒng)的TVB-N檢測技術(shù)相比,該方法首次實(shí)現(xiàn)了水產(chǎn)品中四種TVB-N主要組分的同時(shí)定量檢測;樣本提取過程集采集、萃取、濃縮、富集于一體,簡便快速,從而為水產(chǎn)品中TVB-N組分的精準(zhǔn)表征和分析提供了一種更加有效的技術(shù)手段。

2.3 冷藏過程中不同水產(chǎn)品TVB-N主要組分的變化規(guī)律

2.3.1 大菱鲆4 ℃冷藏期間NH3和TMA的變化 利用HS/SPME-GC/MS方法測定的大菱鲆冷藏過程中TVB-N主要組分的變化情況,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示,大菱鲆在腐敗過程中未檢測到MA與DMA的存在;NH3含量在第1 d為2.26 mg/100 g,第13 d為5.94 mg/100 g。TMA在冷藏第1 d時(shí)未檢測出,第4 d為1.44 mg/100 g,隨后顯著增加(p<0.05),第7 d時(shí)已達(dá)到20.03 mg/100 g,此時(shí)大菱鲆已到達(dá)腐敗期,之后TMA含量無顯著性差異(p>0.05),冷藏至第13 d TMA為23.94 mg/100 g。一般而言,深海魚類TMAO含量較高,鰈魚體內(nèi)大約含有300 mg/100 g TMAO[24],在冷凍條件下,TMAO由內(nèi)源酶還原成DMA,在冷藏條件下,TMAO由微生物作用分解成TMA[25],在本實(shí)驗(yàn)中大菱鲆在冷藏條件下貯藏,DMA的產(chǎn)生量可能低于其檢出限,結(jié)果顯示未檢測出。大菱鲆冷藏后期,TMA急劇增加可能由于腐敗加劇TMAO被微生物大量還原。另外,有報(bào)道稱冷水魚類產(chǎn)生的TMA遠(yuǎn)大于NH3,且貯藏期間TVB-N的增加主要是因?yàn)門MA的增加[26-27],與本文結(jié)果相一致。據(jù)Connell等報(bào)道,TMA指示魚類新鮮度的最高接受范圍為10～15 mg/100 g[28]。

圖4 大菱鲆4 ℃冷藏期間TVB-N主要組分的變化Fig.4 Changes of TVB-N main components in Scophthalmus maximus during 4 ℃ storage

2.3.2 南美白對蝦4 ℃冷藏期間NH3和TMA的變化 利用HS/SPME-GC/MS方法測定的南美白對蝦冷藏過程中TVB-N主要組分的變化情況,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示,蝦肉在腐敗過程中沒有檢測到MA與DMA的存在;NH3的含量較高,TMA含量較低。冷藏第1 d未檢測到TMA,隨著冷藏時(shí)間的延長,TMA含量呈增加趨勢,第4 d達(dá)到3.21 mg/100 g,冷藏至第6 d為4.46 mg/100 g。蝦肉冷藏第1 d NH3含量達(dá)到15.03 mg/100 g,隨著冷藏時(shí)間的延長NH3含量不斷增加,第4 d顯著增長(p<0.05)達(dá)到22.64 mg/100 g,此時(shí)南美白對蝦出現(xiàn)腐敗特征,第6 d為39.59 mg/100 g。同樣,冷藏條件的南美白對蝦未檢測出DMA。南美白對蝦屬于溫水帶水產(chǎn)動(dòng)物,體內(nèi)的TMAO含量低,其優(yōu)勢腐敗菌主要產(chǎn)生NH3而不是TMA[29],隨著鮮度降低,蛋白質(zhì)逐漸被分解成氨基酸,氨基酸發(fā)生脫酰胺作用生成NH3。

圖5 南美白對蝦4 ℃冷藏期間TVB-N主要組分的變化Fig.5 Changes of TVB-N main components in Penaeus vannamei during 4 ℃ storage

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí):不同水產(chǎn)品在腐敗過程中,TVB-N組分的動(dòng)態(tài)變化存在顯著的差異,單純以TVB-N總量或者其中某一種特定組分作為通用指標(biāo),難以準(zhǔn)確反映不同品種的品質(zhì)變化規(guī)律;而依據(jù)其各自TVB-N組分的變化規(guī)律,分別從中選擇最具代表性的指示物,則具有更好的合理性和準(zhǔn)確性。尤其在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),南美白對蝦在冷藏過程中NH3的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律,與大菱鲆等魚類截然不同,不僅含量達(dá)到大菱鲆的6倍左右,而且在貯藏時(shí)間的中后期呈現(xiàn)出快速增長的趨勢,而這一點(diǎn)在以往的研究中,并未見有相關(guān)報(bào)道。這一現(xiàn)象背后的具體機(jī)理是怎樣的,與水產(chǎn)品中蛋白質(zhì)及氨基酸的代謝存在怎樣的關(guān)聯(lián),以及能否利用NH3的這一特殊變化特征、為研究南美白對蝦等甲殼類水產(chǎn)品的品質(zhì)變化及控制技術(shù)開拓新的思路,值得在今后的研究中予以重點(diǎn)關(guān)注。

3 結(jié)論

本文利用HS/SPME-GC/MS技術(shù),首次建立了同時(shí)檢測水產(chǎn)品中NH3、MA、DMA和TMA等TVB-N組分的方法,該方法簡便快捷,對四種目標(biāo)物質(zhì)的檢測線性范圍良好,準(zhǔn)確度和精密度較高,可實(shí)現(xiàn)魚蝦等水產(chǎn)品貯藏過程中TVB-N各組分的同時(shí)分析。利用該技術(shù)研究分析了大菱鲆和南美白對蝦兩種水產(chǎn)品在冷藏過程中TVB-N主要組分的動(dòng)態(tài)變化,發(fā)現(xiàn)其TVB-N組分的變化規(guī)律存在顯著差異,尤其是南美白對蝦中NH3變化規(guī)律,呈現(xiàn)出與魚類截然不同的特征,從而為今后更加準(zhǔn)確、合理地研究評價(jià)該類水產(chǎn)品的腐敗機(jī)理及調(diào)控手段,提供了新的線索。這些變化規(guī)律的差異可能與其自身的貯藏條件、生長環(huán)境以及微生物構(gòu)成有關(guān),需要在今后的研究中進(jìn)一步明確。