禿瘡花針劑對小鼠淋巴細胞CD4和CD8的影響

黨 巖,陳德坤,姚 婧,趙燕清,趙麗娟,楊增歧,李引乾,楊鳴琦, 馬志宏, 茍想珍,張莉敏,常攀峰

(1.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所, 甘肅 平?jīng)?744000； 2．西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院)

禿瘡花(Dicranostigma leptopodum (Maxim) Fedde，DLF)，為罌粟科禿瘡花屬二年生或多年野生草本植物, 主要分布在甘肅、陜西等地。多年來我國許多研究者對禿瘡花的成分和禿瘡花制劑的藥理作用進行了研究，暢行若等從禿瘡花中提取出禿瘡花堿、異紫堇堿、紫堇堿、原阿片堿、別隱品堿、青風藤堿等多種化合物。盧賢昭等研究表明，禿瘡花制劑能調(diào)節(jié)動物免疫系統(tǒng)機能、對結核病和腫瘤等有良好的治愈作用、對多種細菌、病毒、真菌性疾病和外科創(chuàng)傷等有治療作用。

為了將藥用植物禿瘡藥應用于臨床實踐中，本課題組在分析禿瘡花全草生物堿成分的同時，進行了禿瘡花制劑的研制和應用。在此基礎上，進一步研究禿瘡花制劑對小鼠淋巴細胞CD4和CD8的影響，為制劑的應用奠定試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 Balb/c小鼠 購于第四軍醫(yī)大學試驗動物中心。

1.1.2 制劑 禿瘡花針劑由甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所制備。

1.1.3 儀器與材料 流式細胞儀 為第四軍醫(yī)大學中心試驗室儀器(BD公司)；離心機等為西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學學院預防獸醫(yī)學試驗平臺儀器； 96孔細胞培養(yǎng)板、細胞計數(shù)板、0.1μL-1μL、1μL-10μL、10μL-100μL、100μL-1 000μL、1mL-10 mL加樣槍及EP管等購于欣博盛生物科技有限公司。

1.1.4 試劑與藥品 小鼠IL-4 ELISA試劑盒和小鼠IFN-γELISA試劑盒等為欣博盛生物科技有限公司；PBMI-1640培養(yǎng)液、HEPES、L-谷氨酰胺、ConA、犢牛血清、NaCl、KCl、Na2HPO4.12H2O、KH2PO4、NaHCO3、葡萄糖、臺盼藍、青鏈霉素、兩性霉素、多聚甲醛等購于欣博盛生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 禿瘡花內(nèi)用針劑對小鼠的腹腔注射(1)禿瘡花內(nèi)用針劑配制 取甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所制備的禿瘡花制劑，按其所含干物質(zhì)量用生理鹽水配制成4 mg/mL、20 mg/mL、100 mg/mL各100 mL, 4℃保存?zhèn)溆谩?2)禿瘡花內(nèi)用針劑對小鼠的腹腔注射 取28日齡Balb/c小鼠40只，觀察2 d，隨機分成4組。3個試驗組每天分別腹腔注射4 mg/mL、20 mg/mL、100 mg/mL的禿瘡花內(nèi)用制劑，0.2 mL/每只;另1對照組每天分別腹腔注射生理鹽水，0.2 mL/每只。各組連續(xù)注射7 d后。

1.2.2 禿瘡花內(nèi)用針劑對小鼠淋巴細胞CD4和CD8的影響(1) 淋巴細胞分離 從1.2.1.2處理的3個試驗組和對照組中隨機各取5只小鼠，斷頸處死，75%乙醇消毒，無菌條件下取小鼠脾臟。合并同組小鼠脾臟，過200目篩網(wǎng)，用淋巴細胞分離液分離淋巴細胞。各組分離的淋巴細胞分別用PBS液(pH 7.4)洗3遍，計數(shù)，將其分別配成1×106個細胞/mL。(2) 小鼠淋巴細胞標記與固定分別取1.2.2.3各組1×106個細胞/mL 200μL 淋巴細胞懸液，各分置兩個EP管中，每管100 μL。

在避光條件下分別加入Alexa Fluor488 anti-mouse CD4 或Alexa Fluor488 anti-mouse CD8抗體1μL，混勻后4℃作用30 min。離心棄上清，加入100 uL 1% 多聚甲醛固定，4℃保存待測。(3)小鼠淋巴細胞的體外培養(yǎng)、標記和固定 分別取1.2.2.1各組1×106個細胞/ml 500μL 淋巴細胞懸液，分別離心棄上清，淋巴細胞用500μL 完全PBMI-1640營養(yǎng)液重懸后，各分置96孔細胞培養(yǎng)板的4個培養(yǎng)孔中，每孔100 μL。各孔分別加入10 μg/mL的ConA 100 μL，5%CO2、37℃培養(yǎng)48 h。各孔培養(yǎng)物分別離心棄上清，分別用PBS液(pH 7.4)洗3遍，用100μLPBS液重懸，淋巴細胞標記與固定同(4)熒光值檢測 分別將兩次?標記與固定的淋巴細胞用流式細胞儀檢測熒光值,每管計數(shù)10 000個細胞。

2 結果與討論

2.1 結果

禿瘡花內(nèi)用針劑對小鼠淋巴細胞CD4和CD8的影響結果見下圖和表1。從下圖和表1可以看出，小鼠腹腔注射禿瘡花內(nèi)用針劑7d后，與對照組(0 mg/ mL組)相比，小鼠淋巴細胞CD4+數(shù)量明顯下降，但小鼠淋巴細胞CD8+數(shù)量明顯增加;分離禿瘡花針劑處理的小鼠淋巴細胞，用ConA 刺激，5%CO2、37℃培養(yǎng)48 h后，與對照組相比，小鼠淋巴細胞CD4+數(shù)量明顯下降，小鼠淋巴細胞CD8+數(shù)量增減不一;其中4mg/ mL 和20mg/ mL注射組CD8+數(shù)量下降，但100 mg/ mL注射組CD8+數(shù)量增加。

禿瘡花內(nèi)用針劑對小鼠淋巴細胞CD4和CD8的影響結果圖：

圖1 影響結果圖1 圖2 影響結果圖2

注：圖YJ-Y0：未標記的對照；圖YJ-Y 1～圖YJ-Y 4：分別為0mg/mL、4 mg/mL、20 mg/ mL和100 mg/ mL試驗組在小鼠注射禿瘡花7 d后小鼠淋巴細胞中CD4的含量；圖YJ-Y 5～圖YJ-Y 8：分別為0 mg/mL、4 mg/mL、20 mg/ mL和100 mg/ mL試驗組在小鼠注射禿瘡花7d，體外培養(yǎng)48 h后小鼠淋巴細胞中CD4的含量；圖YJ-Y 9～圖-YJ-Y 12：分別為0 mg/mL、4 mg/mL、20 mg/ mL和100 mg/ mL試驗組在小鼠注射禿瘡花7 d后小鼠淋巴細胞中CD8的含量(由于CD8細胞太少，幾乎為0，word文檔圖為作者自己根據(jù)原流式圖做的圖。)；圖YJ-Y 13～圖YJ-Y 16：分別為0 mg/mL、4 mg/mL、20 mg/ mL和100 mg/ mL試驗組在小鼠注射禿瘡花7 d，體外培養(yǎng)48 h后小鼠淋巴細胞中CD8的含量。

表1 禿瘡花內(nèi)用針劑對小鼠淋巴細胞CD4和CD8的影響結果

2.2 討論

從流式細胞儀測定禿瘡花針劑對小鼠淋巴細胞CD4和CD8的影響結果看，小鼠腹腔注射禿瘡花內(nèi)用針劑7d后，與對照組相比，小鼠淋巴細胞CD4+數(shù)量明顯下降，小鼠淋巴細胞CD8+數(shù)量明顯增加;其中100 mg/mL注射組CD4+數(shù)量明顯下降最多，20 mg/mL 注射組CD8+數(shù)量增加最多。這些試驗數(shù)據(jù)說明，小鼠腹腔注射禿瘡花內(nèi)用針劑7 d后，小鼠機體免疫系統(tǒng)體液免疫水平在下降，但細胞免疫水平在明顯提高。

分離禿瘡花針劑處理的小鼠淋巴細胞，用ConA 刺激，5%CO2、37℃培養(yǎng)48 h后，與對照組相比，小鼠淋巴細胞CD4+數(shù)量明顯下降，小鼠淋巴細胞CD8+數(shù)量增減不一;其中100 mg/mL注射組CD4+數(shù)量下降最大；4 mg/ mL 和20 mg/ mL注射組CD8+數(shù)量下降，但100 mg/ mL注射組CD8+數(shù)量增高。試驗結果提示,禿瘡花內(nèi)用針劑處理7天后，小鼠淋巴細胞，用ConA 刺激，5%CO2、37℃培養(yǎng)48 h不是CD8+數(shù)量分泌的峰值期，但從100 mg/ mL注射組的數(shù)據(jù)能看出CD8+數(shù)量是在增加。這進一步說明，瘡花針劑處理的小鼠淋巴細胞，在受到抗原刺激后，小鼠機體免疫系統(tǒng)體液免疫水平在下降，但細胞免疫水平在明顯提高。

試驗結果表明，禿瘡花針劑對小鼠淋巴細胞有明顯的調(diào)節(jié)功能，能提高小鼠的細胞免疫和調(diào)節(jié)體液免疫水平。從三個試驗組數(shù)據(jù)看，100 mg/ mL注射組的效果是比較理想的，這為禿瘡花制劑的臨床應用積累了試驗數(shù)據(jù)。