禿瘡花針劑對小鼠淋巴細(xì)胞CD4和CD8的影響

黨 巖,陳德坤,姚 婧,趙燕清,趙麗娟,楊增歧,李引乾,楊鳴琦, 馬志宏, 茍想珍,張莉敏,常攀峰

(1.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所, 甘肅 平?jīng)?744000； 2．西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院)

禿瘡花(Dicranostigma leptopodum (Maxim) Fedde，DLF)，為罌粟科禿瘡花屬二年生或多年野生草本植物, 主要分布在甘肅、陜西等地。多年來我國許多研究者對禿瘡花的成分和禿瘡花制劑的藥理作用進(jìn)行了研究，暢行若等從禿瘡花中提取出禿瘡花堿、異紫堇堿、紫堇堿、原阿片堿、別隱品堿、青風(fēng)藤堿等多種化合物。盧賢昭等研究表明，禿瘡花制劑能調(diào)節(jié)動物免疫系統(tǒng)機(jī)能、對結(jié)核病和腫瘤等有良好的治愈作用、對多種細(xì)菌、病毒、真菌性疾病和外科創(chuàng)傷等有治療作用。

為了將藥用植物禿瘡藥應(yīng)用于臨床實踐中，本課題組在分析禿瘡花全草生物堿成分的同時，進(jìn)行了禿瘡花制劑的研制和應(yīng)用。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究禿瘡花制劑對小鼠淋巴細(xì)胞CD4和CD8的影響，為制劑的應(yīng)用奠定試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 Balb/c小鼠 購于第四軍醫(yī)大學(xué)試驗動物中心。

1.1.2 制劑 禿瘡花針劑由甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所制備。

1.1.3 儀器與材料 流式細(xì)胞儀 為第四軍醫(yī)大學(xué)中心試驗室儀器(BD公司)；離心機(jī)等為西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)試驗平臺儀器； 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞計數(shù)板、0.1μL-1μL、1μL-10μL、10μL-100μL、100μL-1 000μL、1mL-10 mL加樣槍及EP管等購于欣博盛生物科技有限公司。

1.1.4 試劑與藥品 小鼠IL-4 ELISA試劑盒和小鼠IFN-γELISA試劑盒等為欣博盛生物科技有限公司；PBMI-1640培養(yǎng)液、HEPES、L-谷氨酰胺、ConA、犢牛血清、NaCl、KCl、Na2HPO4.12H2O、KH2PO4、NaHCO3、葡萄糖、臺盼藍(lán)、青鏈霉素、兩性霉素、多聚甲醛等購于欣博盛生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 禿瘡花內(nèi)用針劑對小鼠的腹腔注射(1)禿瘡花內(nèi)用針劑配制 取甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所制備的禿瘡花制劑，按其所含干物質(zhì)量用生理鹽水配制成4 mg/mL、20 mg/mL、100 mg/mL各100 mL, 4℃保存?zhèn)溆谩?2)禿瘡花內(nèi)用針劑對小鼠的腹腔注射 取28日齡Balb/c小鼠40只，觀察2 d，隨機(jī)分成4組。3個試驗組每天分別腹腔注射4 mg/mL、20 mg/mL、100 mg/mL的禿瘡花內(nèi)用制劑，0.2 mL/每只;另1對照組每天分別腹腔注射生理鹽水，0.2 mL/每只。各組連續(xù)注射7 d后。

1.2.2 禿瘡花內(nèi)用針劑對小鼠淋巴細(xì)胞CD4和CD8的影響(1) 淋巴細(xì)胞分離 從1.2.1.2處理的3個試驗組和對照組中隨機(jī)各取5只小鼠，斷頸處死，75%乙醇消毒，無菌條件下取小鼠脾臟。合并同組小鼠脾臟，過200目篩網(wǎng)，用淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞。各組分離的淋巴細(xì)胞分別用PBS液(pH 7.4)洗3遍，計數(shù)，將其分別配成1×106個細(xì)胞/mL。(2) 小鼠淋巴細(xì)胞標(biāo)記與固定分別取1.2.2.3各組1×106個細(xì)胞/mL 200μL 淋巴細(xì)胞懸液，各分置兩個EP管中，每管100 μL。

在避光條件下分別加入Alexa Fluor488 anti-mouse CD4 或Alexa Fluor488 anti-mouse CD8抗體1μL，混勻后4℃作用30 min。離心棄上清，加入100 uL 1% 多聚甲醛固定，4℃保存待測。(3)小鼠淋巴細(xì)胞的體外培養(yǎng)、標(biāo)記和固定 分別取1.2.2.1各組1×106個細(xì)胞/ml 500μL 淋巴細(xì)胞懸液，分別離心棄上清，淋巴細(xì)胞用500μL 完全PBMI-1640營養(yǎng)液重懸后，各分置96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的4個培養(yǎng)孔中，每孔100 μL。各孔分別加入10 μg/mL的ConA 100 μL，5%CO2、37℃培養(yǎng)48 h。各孔培養(yǎng)物分別離心棄上清，分別用PBS液(pH 7.4)洗3遍，用100μLPBS液重懸，淋巴細(xì)胞標(biāo)記與固定同(4)熒光值檢測 分別將兩次?標(biāo)記與固定的淋巴細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測熒光值,每管計數(shù)10 000個細(xì)胞。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)果

禿瘡花內(nèi)用針劑對小鼠淋巴細(xì)胞CD4和CD8的影響結(jié)果見下圖和表1。從下圖和表1可以看出，小鼠腹腔注射禿瘡花內(nèi)用針劑7d后，與對照組(0 mg/ mL組)相比，小鼠淋巴細(xì)胞CD4+數(shù)量明顯下降，但小鼠淋巴細(xì)胞CD8+數(shù)量明顯增加;分離禿瘡花針劑處理的小鼠淋巴細(xì)胞，用ConA 刺激，5%CO2、37℃培養(yǎng)48 h后，與對照組相比，小鼠淋巴細(xì)胞CD4+數(shù)量明顯下降，小鼠淋巴細(xì)胞CD8+數(shù)量增減不一;其中4mg/ mL 和20mg/ mL注射組CD8+數(shù)量下降，但100 mg/ mL注射組CD8+數(shù)量增加。

禿瘡花內(nèi)用針劑對小鼠淋巴細(xì)胞CD4和CD8的影響結(jié)果圖：

圖1 影響結(jié)果圖1 圖2 影響結(jié)果圖2

注：圖YJ-Y0：未標(biāo)記的對照；圖YJ-Y 1～圖YJ-Y 4：分別為0mg/mL、4 mg/mL、20 mg/ mL和100 mg/ mL試驗組在小鼠注射禿瘡花7 d后小鼠淋巴細(xì)胞中CD4的含量；圖YJ-Y 5～圖YJ-Y 8：分別為0 mg/mL、4 mg/mL、20 mg/ mL和100 mg/ mL試驗組在小鼠注射禿瘡花7d，體外培養(yǎng)48 h后小鼠淋巴細(xì)胞中CD4的含量；圖YJ-Y 9～圖-YJ-Y 12：分別為0 mg/mL、4 mg/mL、20 mg/ mL和100 mg/ mL試驗組在小鼠注射禿瘡花7 d后小鼠淋巴細(xì)胞中CD8的含量(由于CD8細(xì)胞太少，幾乎為0，word文檔圖為作者自己根據(jù)原流式圖做的圖。)；圖YJ-Y 13～圖YJ-Y 16：分別為0 mg/mL、4 mg/mL、20 mg/ mL和100 mg/ mL試驗組在小鼠注射禿瘡花7 d，體外培養(yǎng)48 h后小鼠淋巴細(xì)胞中CD8的含量。

表1 禿瘡花內(nèi)用針劑對小鼠淋巴細(xì)胞CD4和CD8的影響結(jié)果

2.2 討論

從流式細(xì)胞儀測定禿瘡花針劑對小鼠淋巴細(xì)胞CD4和CD8的影響結(jié)果看，小鼠腹腔注射禿瘡花內(nèi)用針劑7d后，與對照組相比，小鼠淋巴細(xì)胞CD4+數(shù)量明顯下降，小鼠淋巴細(xì)胞CD8+數(shù)量明顯增加;其中100 mg/mL注射組CD4+數(shù)量明顯下降最多，20 mg/mL 注射組CD8+數(shù)量增加最多。這些試驗數(shù)據(jù)說明，小鼠腹腔注射禿瘡花內(nèi)用針劑7 d后，小鼠機(jī)體免疫系統(tǒng)體液免疫水平在下降，但細(xì)胞免疫水平在明顯提高。

分離禿瘡花針劑處理的小鼠淋巴細(xì)胞，用ConA 刺激，5%CO2、37℃培養(yǎng)48 h后，與對照組相比，小鼠淋巴細(xì)胞CD4+數(shù)量明顯下降，小鼠淋巴細(xì)胞CD8+數(shù)量增減不一;其中100 mg/mL注射組CD4+數(shù)量下降最大；4 mg/ mL 和20 mg/ mL注射組CD8+數(shù)量下降，但100 mg/ mL注射組CD8+數(shù)量增高。試驗結(jié)果提示,禿瘡花內(nèi)用針劑處理7天后，小鼠淋巴細(xì)胞，用ConA 刺激，5%CO2、37℃培養(yǎng)48 h不是CD8+數(shù)量分泌的峰值期，但從100 mg/ mL注射組的數(shù)據(jù)能看出CD8+數(shù)量是在增加。這進(jìn)一步說明，瘡花針劑處理的小鼠淋巴細(xì)胞，在受到抗原刺激后，小鼠機(jī)體免疫系統(tǒng)體液免疫水平在下降，但細(xì)胞免疫水平在明顯提高。

試驗結(jié)果表明，禿瘡花針劑對小鼠淋巴細(xì)胞有明顯的調(diào)節(jié)功能，能提高小鼠的細(xì)胞免疫和調(diào)節(jié)體液免疫水平。從三個試驗組數(shù)據(jù)看，100 mg/ mL注射組的效果是比較理想的，這為禿瘡花制劑的臨床應(yīng)用積累了試驗數(shù)據(jù)。