痰結(jié)核分枝桿菌噬菌體生物擴(kuò)增法與痰結(jié)核菌脫氧核糖核酸聯(lián)合檢測對痰菌陰性肺結(jié)核診斷價(jià)值分析

陸偉桃

廣州市黃埔區(qū)紅十字會(huì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州 510760

肺結(jié)核是臨床常見、多發(fā)的傳染性疾病，以往臨床主要依據(jù)痰涂片檢測結(jié)果判斷病情，但由于此法易受到外界因素干擾，因此高達(dá)50% ～ 70%活動(dòng)性肺結(jié)核患者經(jīng)其檢測結(jié)果為陰性[1]。近年來隨著臨床醫(yī)學(xué)水平不斷提高，痰結(jié)核分支桿菌噬菌體生物擴(kuò)增法（tubercle bacillus-phage amplified biologically assay， TB-PhaB）、痰結(jié)核菌脫氧核糖核 酸（tubercle bacillus-deoxyribonucleic acid，TBDNA）檢測法已廣泛應(yīng)用于肺結(jié)核診斷、治療過程中并取得顯著效果，但二者聯(lián)合診斷痰菌陰性肺結(jié)核研究資料尚少[2]。本文將選取我院于2015年2月～ 2017年9月期間收治的93例痰菌陰性肺結(jié)核患者作為本次研究對象，探討痰結(jié)核分枝桿菌噬菌體生物擴(kuò)增法（TB-PhaB）、痰結(jié)核菌脫氧核糖核酸（TB-DNA）聯(lián)合檢測對診斷痰菌陰性肺結(jié)核的臨床應(yīng)用價(jià)值，為提高此病臨床檢出率提供可靠依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院于2015年2月～2017年9月期間收治的93例肺結(jié)核患者均經(jīng)痰結(jié)核菌檢查結(jié)果為陰性，其中男59例，女34例，年齡18～81歲，平均（43.2±1.7）歲，病程2～12年，平均（5.02±0.34）年，臨床類型：初治失敗40例、初治成功后復(fù)發(fā)53例。納入與排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合《肺結(jié)核診斷和指南》（由中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病學(xué)會(huì)制定）中關(guān)于“菌陰性肺結(jié)核診斷”相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[3]；（2）經(jīng)痰涂片（3次）、痰培養(yǎng)（1次）檢查結(jié)果為陰性；（3）影像學(xué)檢查可見活動(dòng)性肺結(jié)核征象（X線、CT等）；（4）表現(xiàn)為乏力、咳嗽等肺結(jié)核相關(guān)癥狀；（5）排除合并其他呼吸系統(tǒng)疾病者；（6）排除妊娠、產(chǎn)褥、哺乳等特殊生理時(shí)期女性菌陰性肺結(jié)核患者；（7）排除合并惡性腫瘤以及精神、免疫、血液等系統(tǒng)疾病者；（8）排除合并其他感染性疾病者；（9）對本次研究所需痰結(jié)核分支桿菌噬菌體生物擴(kuò)增法、痰結(jié)核菌脫氧核糖核酸檢測法均具有良好耐受性、無相關(guān)禁忌癥；（10）于本次研究前未接受任何抗結(jié)核治療；（11）患者對本次研究內(nèi)容具有知情權(quán)，于研究前指導(dǎo)其獨(dú)立簽署知情同意書（該協(xié)議由本院倫理研究會(huì)制定），本文研究內(nèi)容通過本院倫理研究會(huì)審核。

1.2 方法

1.2.1 研究方法 93例痰菌陰性肺結(jié)核患者均接受痰結(jié)核分支桿菌噬菌體生物擴(kuò)增法、痰結(jié)核菌脫氧核糖核酸檢測法實(shí)驗(yàn)室檢查，指定高年資、?？茖?shí)驗(yàn)室工作人員完成相關(guān)操作。記錄93例痰菌陰性肺結(jié)核患者上述二者聯(lián)合檢查診斷結(jié)果，以兩種方法均符合陽性即判斷為該患者陽性，反之則為陰性，將聯(lián)合檢查結(jié)果、病理診斷結(jié)果行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（SPSS軟件）后得出結(jié)論。

1.2.2 檢查方法

1.2.2.1 痰結(jié)核分支桿菌噬菌體生物擴(kuò)增法 痰液經(jīng)N-乙酰半胱氨酸-氫氧化鈉液化后利用液體培養(yǎng)基離心洗滌（2次），取沉淀加入液體培養(yǎng)基（1mL）經(jīng)37℃條件下行24h溫育，之后加入分枝桿菌噬菌體100μL混勻并繼續(xù)行1h溫育（條件同上）。溫育結(jié)束后加入殺菌劑（100μL）并充分混勻，于室溫下放置5min后加入液體培養(yǎng)基（5mL）并混勻，加入指示細(xì)胞1mL混勻，將上述操作完成后所得溶液澆注平皿（55℃、5mL瓊脂）并旋轉(zhuǎn)混勻，待靜置成型后培養(yǎng)18～24h（37℃條件下）。待培養(yǎng)結(jié)束后根據(jù)培養(yǎng)皿中菌斑情況判斷病情，即0～1個(gè)菌斑為陰性、2個(gè)及以上菌斑為陽性。

1.2.2.2 痰結(jié)核菌脫氧核糖核酸檢測法 利用廣州達(dá)安臨床檢驗(yàn)中心有限公司提供的檢測系統(tǒng)（型號(hào)：DA-7600）及配套結(jié)核分支桿菌核酸檢驗(yàn)試劑盒經(jīng)實(shí)時(shí)免疫熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（fluorescent quantitative polymerase chain reaction，F(xiàn)Q-PCR）完成痰結(jié)核菌脫氧核糖核酸檢測。取1.0～1.5mL氫氧化鈉加入試管中搖勻，于室溫下放置液化痰液（15～30min），待液化完成后給予5min離心（每分鐘12000轉(zhuǎn)）。取沉淀加入1mL無菌生理鹽水后混勻（振蕩）并再次離心5min（轉(zhuǎn)速與前次相同），所得沉渣加入50μmDNA提取液并混勻，于100℃條件下恒溫處理10min，之后將其放置于4℃環(huán)境下冷卻至室溫并離心5min（轉(zhuǎn)速與前次相同）。取2μm上清液加入PCR反應(yīng)管中給予數(shù)秒離心（每分鐘轉(zhuǎn)速8000轉(zhuǎn)），離心完成后將PCR反應(yīng)管放入PCR儀中擴(kuò)增處理，預(yù)變性參數(shù)設(shè)置為2min、93℃，完成后于93℃、45s至55℃、60s行10個(gè)循環(huán)，93℃、45s至55℃、120s行30個(gè)循環(huán)。待上述操作完成后經(jīng)熒光檢測并記錄讀數(shù)，以50拷貝作為敏感度下限。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS19.0版對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，研究所得兩組痰菌陰性肺結(jié)核患者痰結(jié)核分支桿菌噬菌體生物擴(kuò)增法聯(lián)合痰結(jié)核菌脫氧核糖核酸檢測法檢測結(jié)果、病理診斷結(jié)果均屬于計(jì)數(shù)資料，以百分?jǐn)?shù)（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 檢測結(jié)果分析

93例痰菌陰性肺結(jié)核患者均順利完成痰結(jié)核分支桿菌噬菌體生物擴(kuò)增法、痰結(jié)核菌脫氧核糖核酸檢測法檢測（檢查完成率均為100.00%），經(jīng)分析可知，痰結(jié)核分支桿菌噬菌體生物擴(kuò)增法聯(lián)合痰結(jié)核菌脫氧核糖核酸檢測對疾病確診率高達(dá)94.62%，此數(shù)據(jù)與病理診斷（100.00%）結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.29，P ＞0.05）。見表1。

表1 93例痰菌陰性肺結(jié)核患者痰結(jié)核分支桿菌噬菌體生物擴(kuò)增法聯(lián)合痰結(jié)核菌脫氧核糖核酸檢測、病理診斷結(jié)果比較分析[n（%）]

2.2 敏感性

經(jīng)分析可知，痰結(jié)核分支桿菌噬菌體生物擴(kuò)增法聯(lián)合痰結(jié)核菌脫氧核糖核酸檢測對肺結(jié)核的診斷敏感性為94.62%。注：敏感度=[88/（88+5）]×100.00%。

3 討論

結(jié)核分枝桿菌（M.tuberculosis）感染是引起結(jié)核病的主要原因，由于其傳播途徑多為呼吸道，因此目前臨床多見為肺結(jié)核患者。但有研究顯示[4]，肺結(jié)核發(fā)病后可累及機(jī)體多個(gè)重要器官甚至危及患者生命安全，因此及時(shí)確診、正確治療是保障患者療效、預(yù)后的關(guān)鍵。雖然在各級(jí)黨政機(jī)關(guān)大力支持下我國肺結(jié)核發(fā)病率較之前有所降低，但由于近年來人們生活習(xí)慣、節(jié)奏、環(huán)境等因素不斷變化，部分地區(qū)肺結(jié)核發(fā)病率呈小幅提高，因此如何采取有效措施盡快確診病情、使患者及時(shí)獲得臨床對癥干預(yù)控制病情，仍是廣大臨床醫(yī)護(hù)人員共同關(guān)注的熱點(diǎn)。

研究表明[5]，相較于其他呼吸系統(tǒng)疾病而言，肺結(jié)核發(fā)病后并無典型臨床表現(xiàn)，因此將對臨床診治工作造成一定困難，雖然目前影像學(xué)技術(shù)已獲得快速發(fā)展，CT、X線片等手段對肺結(jié)核的診斷均具有重要價(jià)值，但肺結(jié)核病灶復(fù)雜多樣，因此僅依靠影像學(xué)檢查結(jié)果并無法明確病情，提示此法僅可作為輔助檢查手段[6]。研究表明，由于結(jié)核桿菌是此病傳染源，因此臨床仍需依靠實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果確診病情[6]。痰培養(yǎng)是以往臨床用于確診肺結(jié)核病情的主要方法，但此法所需時(shí)間長，且并不適用所有類型肺結(jié)核疾病，因此其仍具有一定漏診率。目前有相關(guān)資料統(tǒng)計(jì)可知[7]，60% ～ 70%肺結(jié)核患者經(jīng)痰培養(yǎng)呈陰性，而隨訪（1～3年）后痰菌陰性肺結(jié)核患者中40%～60%將逐漸轉(zhuǎn)陽，應(yīng)引起相關(guān)醫(yī)護(hù)人員高度重視。

痰結(jié)核分支桿菌噬菌體生物擴(kuò)增法是近年來于臨床推廣的肺結(jié)核診斷方法，因其操作過程中對設(shè)備要求低、學(xué)習(xí)曲線短等特點(diǎn)，尤其適用于各級(jí)基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)行相關(guān)檢查[8]。痰結(jié)核分枝桿菌噬菌體生物擴(kuò)增法檢查機(jī)理：分支桿菌噬菌體可對活的分支桿菌產(chǎn)生感染，因此提示未進(jìn)入感染菌體的噬菌體將被相應(yīng)殺毒劑滅活，而已經(jīng)進(jìn)入菌體內(nèi)的噬菌體則無法受到影響，感染菌體內(nèi)噬菌體將表現(xiàn)出大量增殖狀態(tài)并裂解感染菌體，此過程中將有子代噬菌體釋放并對隨后加入的指示細(xì)胞產(chǎn)生感染、裂解等作用，因此可見透亮噬菌斑存在于瓊脂平板上，根據(jù)其有無、數(shù)量等情況即可對所檢標(biāo)本中結(jié)核分支桿菌、非結(jié)核分枝桿菌給予準(zhǔn)確判斷。但有研究顯示[9]，痰結(jié)核分支桿菌噬菌體生物擴(kuò)增法對肺結(jié)核診斷所需時(shí)間長（24～48h），且檢測過程中噬菌濃度、痰標(biāo)本預(yù)處理、殺毒及滅火條件指示細(xì)胞、感染時(shí)間等外界因素均將對結(jié)果造成一定影響，因此易貽誤病情治療時(shí)機(jī)、假陽性及假陰性率均較高，應(yīng)引起相關(guān)醫(yī)護(hù)人員注意。

痰結(jié)核菌脫氧核糖核酸檢測法將核酸擴(kuò)增、光譜、雜交等技術(shù)有效結(jié)合，于封閉條件下完成相關(guān)操作，從而有效避免因擴(kuò)增產(chǎn)物污染所致假陽性情況，此外該方法通過結(jié)合自動(dòng)分析技術(shù)使臨床實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)方法具有特異、精準(zhǔn)、快速、簡便等特點(diǎn)[10]。但有研究顯示[11]，由于痰結(jié)核菌脫氧核糖核酸檢測法操作步驟多，檢測結(jié)果多依賴于質(zhì)控品、試劑及儀器情況，因此仍將存在少數(shù)假陽性、假陰性幾率。基于此，有學(xué)者[12]認(rèn)為若將痰結(jié)核分支桿菌噬菌體生物擴(kuò)增法聯(lián)合痰結(jié)核菌脫氧核糖核酸檢測用于診斷肺結(jié)核病情，將使二者特點(diǎn)結(jié)合起到相輔相成作用，從而有利于臨床獲得更為準(zhǔn)確的痰菌陰性肺結(jié)核檢出率。本文對93例痰菌陰性肺結(jié)核患者臨床資料分析可知，其接受痰結(jié)核分支桿菌噬菌體生物擴(kuò)增法、痰結(jié)核菌脫氧核糖核酸檢測完成率為100.00%，二者聯(lián)合診斷疾病陽性率高達(dá)94.62%，痰結(jié)核分支桿菌噬菌體生物擴(kuò)增法聯(lián)合痰結(jié)核菌脫氧核糖核酸檢測對肺結(jié)核的診斷敏感性為94.62%，此結(jié)論與國內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果相符[13-15]。但有研究顯示[16]，痰結(jié)核菌脫氧核糖核酸檢測法需經(jīng)專業(yè)機(jī)構(gòu)認(rèn)證的檢驗(yàn)人員及相關(guān)環(huán)境（實(shí)驗(yàn)室）方可完成肺結(jié)核檢驗(yàn)，因此對醫(yī)療機(jī)構(gòu)資質(zhì)、設(shè)備、人員等條件均具有較高要求，提示此法并不適用于基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)推廣，此問題需在今后實(shí)際工作中加以深入研究并提出解決方案。

綜上，應(yīng)用痰結(jié)核分支桿菌噬菌體生物擴(kuò)增法、痰結(jié)核菌脫氧核糖核酸檢測法聯(lián)合診斷肺結(jié)核具有較為理想的臨床檢出率，有利于盡快確診患者病情并提供對癥救治，對保障其生活質(zhì)量、生命安全均具有積極意義，值得今后推廣。