鹽酸小檗堿和亞胺培南聯(lián)合作用對(duì)耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌體外抗菌活性的影響

吳靈玲 魏敦燦 陳浩浩

1.廣東省汕頭市濠江區(qū)河浦人民醫(yī)院藥械科，廣東汕頭 515098；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科，廣東汕頭 515098

銅綠假單胞菌（P.Aeruginosa）又可稱為綠膿桿菌，為廣泛分布自然界中的一類重要細(xì)菌之一，屬于較為常見的一種條件致病菌，同時(shí)也是導(dǎo)致院內(nèi)感染發(fā)生的一類重要致病菌[1]。該病菌感染可會(huì)引起敗血癥、呼吸道感染、尿路感染、傷口感染等。臨床數(shù)據(jù)顯示，近年來，銅綠假單胞菌的分離及耐藥率均表現(xiàn)出明顯遞增趨勢(shì)，且對(duì)碳青霉稀類耐藥率有明顯升高，有廣泛耐藥菌株出現(xiàn)，這大大增加了疾病臨床治療難度，影響疾病治療效果及預(yù)后[2]。因此，加強(qiáng)對(duì)該類細(xì)菌耐藥情況進(jìn)行深入研究具有重要臨床意義。本研究主要探討同時(shí)使用鹽酸小檗堿、亞胺培南兩種藥物對(duì)CPA體外抗菌活性產(chǎn)生的作用，現(xiàn)做如下報(bào)道。

1 資料與方法

1.1 一般材料

選取2016年2月～2017年5月本院臨床分離的80株CPA，實(shí)施法國(guó)梅里埃 VITEK2-CompactT檢測(cè)，同時(shí)實(shí)施Hodge實(shí)驗(yàn)，根據(jù)檢測(cè)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取50株耐碳?xì)涿赶╊愩~綠假單胞菌。質(zhì)控菌株27853由中國(guó)衛(wèi)生部臨檢中心提供。研究所用抗菌藥物：亞胺培南，純度：98%，批號(hào)：160421，規(guī)格：5g/支；鹽酸小檗堿，純度：98%，批號(hào)：160528，規(guī)格；1g/支。兩種藥物均為上海源葉生物科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 制備菌懸液 實(shí)施菌種均實(shí)施復(fù)融、轉(zhuǎn)種以及分離培養(yǎng)，于相同平板取1～2個(gè)性狀相似的菌落，將其接種至LB液體培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行10～12h的培養(yǎng)。使用RPMI1640液體培養(yǎng)基將LB培養(yǎng)液密度調(diào)節(jié)為2～6×108CFU/L 菌懸液。實(shí)施實(shí)驗(yàn)時(shí)用RP-MI1640培養(yǎng)基將LB培養(yǎng)液稀釋至100倍，獲得接種菌懸液（密度為2～6×108CFU/L）。

1.2.2 配制藥物濃度 使用無菌蒸餾水分別將亞胺培南、鹽酸小檗堿干粉堿配成256μg/mL、2048μg/mL原液，再實(shí)施NCCLS 抗生素藥敏微量稀釋。亞胺培南最終濃度控制為 0.125～128μg/mL。

1.2.3 兩種藥物單獨(dú)藥敏試驗(yàn) 使用NCCLS 微量倍比稀釋實(shí)施亞胺培南、鹽酸小檗堿稀釋后，在孵育箱（溫度：37℃）中放置18～24h后觀察結(jié)果。

1.2.4 鹽酸小檗堿交叉聯(lián)合抗真菌藥物藥敏試驗(yàn) 選用棋盤微量稀釋法檢實(shí)施藥物同時(shí)應(yīng)用作用。采用稀釋度為9個(gè)，最高濃度使其MIC的4倍，實(shí)施依次倍比稀釋，具體倍比濃度為1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256 倍。在 96 孔培養(yǎng)板上按照縱、橫兩列聯(lián)合兩種藥物稀釋。接種菌量選擇為1×105CFU/mL，將銅綠假單胞菌放置于孵育箱（溫度：37℃）中，放置時(shí)間為18～24h，然后仔細(xì)觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。計(jì)算出部分抑菌濃度指數(shù)（FIC），并以該值為根據(jù)對(duì)聯(lián)合藥敏試驗(yàn)效果進(jìn)行評(píng)估。

1.2.5 單藥最低抑制濃度（MIC）值測(cè)定 MIC值通過微量肉湯倍比稀釋法檢測(cè)。制備單藥孔板：去96孔微型平板，在1～12各孔加入100μL肉湯，首列各孔加入100μL鹽酸小檗堿藥液（128μg/mL），實(shí)施倍比稀釋，使第1～11孔鹽酸小檗堿濃度稀釋至0.065～64μg/mL。在1～12各孔加入100μL已配置好菌懸液，使第1～11孔鹽酸小檗堿濃度稀釋為0.03～32μg/mL，將12孔作為陰性對(duì)照。按照如上方法實(shí)施亞胺培南單藥孔板制備，亞胺培南最終濃度控制為0.25～256μg/mL。放置于溫度為（35±2）℃溫箱中進(jìn)行18～24h培養(yǎng)，然后觀察結(jié)果，并記錄MIC。

1.2.6 計(jì)算FIC及效果評(píng)估 MIC甲藥聯(lián)合/MIC甲藥單用+MIC乙藥聯(lián)合/MIC=FIC。乙藥單用抗菌效果判定：（1）兩藥協(xié)同作用：FIC指數(shù)≤0.5；（2）兩藥相加作用：FIC指數(shù)≤1；（3）兩藥無關(guān)作用：1＜FIC指數(shù)≤2；（4）兩藥為拮抗作用：FIC指數(shù)＞2 。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)研究數(shù)據(jù)資料均通過SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 MIC值等計(jì)量數(shù)據(jù)對(duì)比實(shí)施t檢驗(yàn)處理，選用（±s）表示。以P＜0.05表示相互比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩藥單用作用

鹽酸小檗堿、亞胺培南單獨(dú)使用時(shí)，對(duì)CPA的MIC分別為258～519μg/mL、7～35μg/mL，均值分別為 261.00μg/mL、 8.75μg/mL，見表 1。

表1 兩藥單用時(shí)對(duì)CPA的MIC情況（± s ，μg/mL）

表1 兩藥單用時(shí)對(duì)CPA的MIC情況（± s ，μg/mL）

抗菌藥物 MIC范圍 MIC均值鹽酸小檗堿 258～519 261.00亞胺培南 7～35 8.75

2.2 兩藥聯(lián)合應(yīng)用作用

同時(shí)使用兩種藥物時(shí)，鹽酸小檗堿、亞胺培南對(duì)CPA的MIC均有明顯減少，分別為2～33、2～ 17μg/mL，均值分別下降為 8.11、4.48μg/mL。同時(shí)使用兩種藥物時(shí)，表現(xiàn)為對(duì)5.02%的50株CPA呈無拮抗作用，88.42%的CPA呈相加抗菌作用，對(duì)6.56% CPA呈協(xié)同抗菌作用。兩種藥物聯(lián)用對(duì) CPA表現(xiàn)出效果見表2。

2.3 兩藥單用、聯(lián)用時(shí)MIC比較

單用亞胺培南時(shí)，MIC值顯著大于與鹽酸小檗堿聯(lián)用（P＜0.05）；單用鹽酸小檗堿時(shí)，MIC值顯著大于與亞胺培南聯(lián)用（P＜0.05），見表3。

3 討論

銅綠假單胞菌屬于一種廣泛存在的革蘭陰性非發(fā)酵菌。目前，抗生素在臨床治療中得到廣泛應(yīng)用，不合理用藥發(fā)生率也隨之不斷上升，銅綠假單胞菌對(duì)臨床常用抗菌藥物的耐藥率也有明顯升高，甚至對(duì)部分抗生素完全耐藥[3-4]。因此，近年來，銅綠假單胞菌感染引發(fā)疾病的治療難度不斷增加。本研究選擇從中西醫(yī)結(jié)合角度，對(duì)亞胺培南、鹽酸小檗堿兩種藥物同時(shí)使用對(duì)CPA體外抗菌活性產(chǎn)生的影響進(jìn)行深入研究，旨在探索耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌更加有效理想的治療方法。

表2 兩種藥物單用、聯(lián)用對(duì)50株CPA的FIC指數(shù)及MIC情況

表3 兩藥單用與聯(lián)用時(shí)MIC值比較（± s）

表3 兩藥單用與聯(lián)用時(shí)MIC值比較（± s）

亞胺培南（株數(shù)=50） 鹽酸小檗堿（株數(shù)=50）單用時(shí)MIC 8.88±0.64 266.45±5.75聯(lián)用時(shí)MIC 4.48±0.14 8.19±1.11 t 47.490 311.838 P 0.000 0.000

鹽酸小渠堿為從中藥黃連中提取的一種生物堿[5-6]。藥量作用研究已證實(shí)，鹽酸小檗堿、黃連均有良好消炎、抗菌等作用[7-8]。同時(shí)，既往研究也表明，鹽酸小檗堿的應(yīng)用對(duì)CPA也表現(xiàn)出有效抗菌作用。本研究結(jié)果顯示，鹽酸小檗堿單獨(dú)使用時(shí)，其MIC值為261.00μg/mL。CPA耐藥機(jī)制主要如下：（1）產(chǎn)金屬酶，能夠水解β-內(nèi)酰胺類及碳?xì)涿赶╊惪股?，且不受碳?xì)涿赶╊愐种?；?）細(xì)菌細(xì)胞膜上特定靶位、β-內(nèi)胺類抗菌藥物二者相互結(jié)合后，會(huì)對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖分子產(chǎn)生有效抑制，促進(jìn)細(xì)菌凋亡；（3）外排系統(tǒng)耐藥導(dǎo)致外膜蛋白形成一個(gè)主動(dòng)外排系統(tǒng)，該系統(tǒng)導(dǎo)致藥物能夠直接泵出進(jìn)入細(xì)菌體外；（4）細(xì)胞膜通透性不斷降低。該種細(xì)菌的細(xì)胞膜自身存在分子篩作用，能夠產(chǎn)生阻攔作用，使抗菌藥物無法進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[9]。OprD為現(xiàn)階段研究中發(fā)現(xiàn)的有一種能夠引起碳青霉烯類抗生素耐藥的膜孔蛋白，其表達(dá)下降或缺失均是使銅綠假單胞菌產(chǎn)生耐藥的一個(gè)重要機(jī)制之一[10-11]。

本次研究結(jié)果顯示，亞胺培南、鹽酸小檗堿兩種藥物聯(lián)合使用時(shí)，兩者的藥物濃度均影響減低，鹽酸小檗堿均值從261.00μg/mL降至8.75μg/mL，亞胺培南均值從8.75μg/mL降至4.48μg/mL。兩種藥物同時(shí)使用時(shí)，MIC值均顯著低于單獨(dú)用藥。景春娥等[12]研究表明，中藥鹽酸小檗堿、西藥亞胺培南同時(shí)使用時(shí)，二者的抗菌能力均有明顯提高，對(duì)95%耐藥菌株均表現(xiàn)出良好抑菌作用。Bardbari AM等[13]研究結(jié)果顯示，頭孢他啶、氨芐西林與黃連提取物同時(shí)使用應(yīng)用于臨床治療，可使患者血液培養(yǎng)陽性率明顯降低。既往研究證實(shí)，加用黃連提取物可促進(jìn)頭孢菌素、氨芐青霉素應(yīng)用于銅綠假單胞菌感染大鼠治療的效果得到明顯提高。本研究結(jié)果均與這些研究結(jié)果保持良好一致性，均表明鹽酸小檗堿與抗菌西藥聯(lián)合使用能夠產(chǎn)生協(xié)同作用，促進(jìn)藥物療效得到明顯提高[14-15]。

綜上所述，與單獨(dú)用藥相比，聯(lián)合使用亞胺培南、鹽酸小檗堿兩種藥物能夠獲得更理想抗菌效能，提高對(duì)銅綠假單胞菌的抑制作用，該方案應(yīng)用于耐碳青霉烯銅綠假單胞菌臨床治療有望獲得更理想效果。