脂多糖通過NF-κb促CDX2表達(dá)在Barrett食管形成中的作用

張 園 彭伯堅(jiān) 張擁軍 駱鳳嬌

廣州市花都區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東廣州 510800

Barrett食管（BE）是指食管遠(yuǎn)端鱗狀上皮被化生的柱狀上皮取代，是食管腺癌(EA)的癌前病變[1-2]。近年來菌群失調(diào)在消化系統(tǒng)疾病中的作用得到廣泛重視，研究[3]發(fā)現(xiàn)與正常食管相比，BE食管末端的微生物類型中革蘭氏陰性細(xì)菌（G-）占53.4%，而在正常食管黏膜中多為革蘭氏陽性菌為代表的厚壁菌門，G-菌只占14.9%。由此我們推測除胃酸和膽汁刺激外，菌群變化導(dǎo)致G-細(xì)菌外膜LPS(脂多糖）增高是BE發(fā)生的重要致病因素之一。CDX2 是BE形成過程中的關(guān)鍵基因，但其上調(diào)機(jī)制尚不清楚[4]。本實(shí)驗(yàn)擬探討LPS激活NF-κb對CDX2表達(dá)的影響，以期深入了解BE的發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Het-1A細(xì)胞株購自上海序潤生命科技有限公司。DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司，脂多糖購自sigam公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用的互補(bǔ)DNA第一鏈合成試劑盒購自天根生物科技有限公司，快速SYBR Green Master Mix試劑盒購自美國ABI公司，引物由公司設(shè)計(jì)合成上海英駿生物技術(shù)有限公司，一抗NF-κb、CDX2單克隆抗體均購自武漢博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 組織 選取2016年3～8月花都區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)鏡中心行胃鏡檢測的患者52例，其中男29例，女23例，年齡35～65歲，平均（52.9±9.6）歲。分正常對照組和BE組，其中正常對照組32例，BE組20例（所有BE患者均符合中華醫(yī)學(xué)會消化病學(xué)分會Barrett食管診治共識修訂的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)）[6]。所有患者均有完整的病歷資料，并且經(jīng)病理科醫(yī)生證實(shí)。擬采用免疫組化S-P法檢測兩組標(biāo)本中NF-κB和CDX2的表達(dá)，并行χ2檢驗(yàn)分析兩組間參數(shù)表達(dá)的差異。

1.2.2 免疫組化 取材后立即固定，石蠟包埋、切片、染色、封片，采用免疫組化S-P法檢測正常食管鱗狀上皮組和BE組樣本各基因的表達(dá)。PBS做為陰性對照，用光鏡觀察結(jié)果。陽性標(biāo)準(zhǔn)：NF-κb以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜上呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性；CDX2陽性顆粒定位于細(xì)胞核，核內(nèi)出現(xiàn)棕褐色顆粒為免疫組化陽性。根據(jù)每張切片染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞數(shù)確定表達(dá)程度，由2名病理醫(yī)師雙盲獨(dú)立閱片。具體標(biāo)準(zhǔn)：高倍視野（×400）下隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞百分率，＜5%為陰性，5%～25%為弱陽性(+)，25%～50%為陽性(++)，＞50%為強(qiáng)陽性 (+++)，陽性表達(dá)包括 (+)、(++)、(+++)。

1.2.3 Het-1A食管上皮細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞經(jīng)消化傳代后，于5%CO2的37℃溫箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為DMEM加15%的胎牛血清，每周換液2～3次，待細(xì)胞密度達(dá)80%以上進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.4 LPS處理細(xì)胞 無血清及添加物的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24h。應(yīng)用無血清及添加物的培養(yǎng)基調(diào)制LPS濃度分別為10、100、500ng/mL。應(yīng)用不同PLS濃度的培養(yǎng)基處理24h，結(jié)束后繼續(xù)應(yīng)用無血清及添加物的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞至24h，然后抽提RNA或蛋白進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 處理后的細(xì)胞提取RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR。GAPDH為內(nèi)參照物，NF-κB基因上游引物序列為5’-CTGAACCAGGGCATACCTGT-3’，下游引物序列為5’-GAGAAGTCCATGTCCGCAAT-3’CDX2上游引物為 5’-GATGATACTGCTGGGTACTG-3′，下游引物 5’-TCTCCTTTGCTCTGCGGTTC-3’；GAPDH 上游引物為 5’-CCCTTCA TTGACCTCAACTACATGG-3’，下游引物為5’-CATGGTGGTGAAGACGCCAG-3′。用2-ΔΔCt值分析各組細(xì)胞中NF-κb、CDX2相對表達(dá)量。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次

1.2.6 蛋白印跡分析(Westernblot) Western blot檢測細(xì)胞NF-κb和CDX2蛋白表達(dá)：收集各組細(xì)胞，GAPDH為內(nèi)參物，加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白，按2∶1比例混合蛋白溶液和上樣緩沖液，于沸水浴反應(yīng)5min。上樣至SDS.PAGE系統(tǒng)中，進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)印至PADF膜上，經(jīng)過封閉、一抗和二抗孵育后，將化學(xué)熒光發(fā)光底物均勻加至膜表面，持續(xù)反應(yīng)5min。用試劑盒提供的濾紙除去膜表面多余的底物溶液，放至暗盒曝光并顯影定影。用NF-κb、CDX2與內(nèi)參GAPDH吸光度比值表示各樣本NF-κb、CDX2的相對含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白印跡分析結(jié)果為計(jì)量資料用（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，免疫組化法測定結(jié)果為計(jì)數(shù)資料，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 在正常食管和 BE 組織中NF-κb、CDX2的表達(dá)

32例正常食管組織中，NF-κb陰性表達(dá)28例，陽性4例，陽性率12.50%，陽性染色主要集中在胞漿；CDX2陰性表達(dá)29例，陽性3例，陽性率9.37%，陽性染色主要集中在胞核。20例BE組織中，NF-κb陰性表達(dá)7例，陽性15例，陽性率75.0%；CDX2陰性表達(dá)4例，陽性16例，陽性率80.0%，BE 組織中NF-κb和CDX2的陽性表達(dá)率均高于正常食管組織。（χ2=20.734，P ＜ 0.05；χ2=26.475，P ＜ 0.05）。見圖 1。

圖1 免疫組化結(jié)果 A、B.NF-κB(×200)；C、D. CDX2(×200)；A、C 示正常黏膜；B、D 示BE黏膜

2.2 脂多糖對Het-1A中NF-κb表達(dá)的影響

2.2.1 NF-κbmRNA表達(dá) 見表1，不同濃度LPS作用結(jié)果顯示在培養(yǎng)基濃度100ng/mL LPS和500ng/mL LPS中，食管鱗狀上皮細(xì)胞的NF-κb mRNA水平分別是正常對照組的2.7倍和5.0倍，效應(yīng)存在差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨LPS濃度增高，NF-κb2表達(dá)增強(qiáng)，10ng/ml LPS實(shí)驗(yàn)組與對照組相比NF-κb2 mRNA水平升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2.2 NF-κb2蛋白表達(dá) 見表1、圖1,正常食管鱗狀上皮細(xì)胞無不表達(dá)NF-κb2，10ng/mL LPS組有輕度表達(dá)，但與對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，實(shí)驗(yàn)組100ng/mL LPS組可促進(jìn)NF-κb2的表達(dá)，且隨濃度增強(qiáng)效應(yīng)增強(qiáng)。

表1 不同濃度LPS對NF-κb2 mRNA和蛋白表達(dá)的影響（± s）

表1 不同濃度LPS對NF-κb2 mRNA和蛋白表達(dá)的影響（± s）

注：a為對照組，b為10ng/ml LPS組，c為100ng/ml LPS組，d為 500ng/ml LPS組。（1）mRNA 表 達(dá)：ta-b=2.564，P ＜ 0.05；ta-c=23.058，P ＜ 0.05；ta-d=27.694，P ＜ 0.05；tb-c=17.871，P ＜ 0.05；tb-d=21.631，P＜ 0.05；tc-d=11.123，P＜ 0.05。(2)蛋 白 表 達(dá)：ta-b=6.640，P ＜ 0.05；ta-c=60.665，P ＜ 0.05；ta-d=279.769，P ＜ 0.05；tb-c=46.627，P ＜0.05；tb-d=210.727，P ＜ 0.05；tc-d=50.026，P ＜ 0.05

組別 NF-κb2 mRNA表達(dá) 蛋白表達(dá)對照組 1.011±0.034 0 10ng/mL LPS組 1.037±0.038 0.014±0.012 100ng/mL LPS組 2.758±0.429 1.002±0.094 500ng/mL LPS組 5.104±0.840 2.163±0.044

2.3 脂多糖對Het-1A中CDX2表達(dá)的影響

2.3.1 CDX2 mRNA 表達(dá) 見表2，各實(shí)驗(yàn)組與正常對照組比較CDX2基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng), 分別是正常對照組的1.98、4.72和8.77倍，效應(yīng)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且隨濃度增強(qiáng)效應(yīng)增強(qiáng)。

2.3.2 CDX2蛋白表達(dá) 見表2、圖1，正常鱗狀上皮細(xì)胞無CDX2蛋白表達(dá)，10ng/mL LPS組有輕度表達(dá)，與對照組比較(P=0.043)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨LPS濃度增加蛋白表達(dá)越高，500ng/mL和100ng/mL LPS組與對照組比較（P＜0.05），且500ng/mL LPS組明顯高于100ng/mL LPS組（P＜0.05）。

3 討論

Barrett食管中柱狀細(xì)胞化生被認(rèn)為是食管上皮細(xì)胞慢性損傷的結(jié)果[5-6]。CDX2是一種腸型分化的標(biāo)志物，是BE的早期和特異性標(biāo)志蛋白[7-8]。而NF-κB的途徑激活可促炎性因子的基因表達(dá)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[9-10]。通過試驗(yàn)，我們研究了正常食管和BE食管組織中NF-κB和CDX2的表達(dá)，結(jié)果顯示，正常食管組織NF-κB和CDX2陽性率分別為12.50%和9.37%，而BE食管組織中NF-κB和CDX2陽性率分別為75%和80%，差異顯著。說明NF-κB的活性上調(diào)，并伴Cdx2的表達(dá)水平同時(shí)上調(diào)。NF-κB和CDX2參與BE的發(fā)生發(fā)展。

表2 不同濃度LPS對CDX2 mRNA和蛋白表達(dá)的影響（± s）

表2 不同濃度LPS對CDX2 mRNA和蛋白表達(dá)的影響（± s）

注：a為對照組，b為10ng/mL LPS組，c為100ng/mL LPS組，d為 500ng/mL LPS組。（1）mRNA表 達(dá)：ta-b=61.543，P＜ 0.05；ta-c=60.176，P ＜0.05；ta-d=64.972，P ＜ 0.05；tb-c=33.973，P ＜ 0.05；tb-d=44.305，P＜0.05；tc-d=23.620，P＜0.05。（2）蛋白表達(dá)：ta-b=33.281，P ＜ 0.05；ta-c=96.598，P ＜ 0.05；ta-d=47.055，P ＜ 0.05；tb-c=60.445，P＜0.05；tb-d=33.862，P＜0.05；tc-d=15.684，P ＜ 0.05。

組別 CDX2 mRNA表達(dá) 蛋白表達(dá)對照組 1.013±0.023 0 10ng/ml LPS組 2.006±0.087 0.269±0.046 100ng/ml LPS組 4.790±0.356 1.918±0.113 500ng/ml LPS組 8.886±0.689 3.423±0.414

圖2 不同濃度LPS中NF-κb、CDX2和GAPDH和GAPDH的表達(dá)

既往Barrett食管研究主要針對酸和膽鹽對食管上皮的直接作用，近年來，大量研究顯示胃腸道微生態(tài)系統(tǒng)失衡與人體疾病有著密切的關(guān)聯(lián)[11]。研究發(fā)現(xiàn)，在Barrett食管患者中鏈球菌與普氏菌為其主要菌群，比值越大，Barrett食管發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)越高，并且與早期食管腺癌有明顯相關(guān)性[12]。脂多糖(LPS)，作為革蘭氏陰性細(xì)菌主要的外膜結(jié)構(gòu)，能夠誘導(dǎo)宿主固有免疫反應(yīng)，通過激活Toll-4受體和NF-κB的途徑促炎癥發(fā)生[13]。通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，正常食管鱗狀上皮細(xì)胞并不表達(dá)NF-κb，10ng/mL LPS組培養(yǎng)基可輕微刺激NF-κb表達(dá)，但二者無差異，而100ng/mL LPS和500ng/mL LPS組則明顯增強(qiáng)NF-κb基因轉(zhuǎn)錄與蛋白合成分別是對照組的2.7倍和5.0倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說明LPS可以促進(jìn)食管鱗狀上皮表達(dá)NF-κb，而且隨濃度增強(qiáng)效應(yīng)明顯增強(qiáng)。同樣正常食管鱗狀上皮細(xì)胞無CDX2表達(dá) ，而實(shí)驗(yàn)組10、100、500ng/mL LPS均可促進(jìn) CDX2基因轉(zhuǎn)錄與蛋白合成，并隨濃度升高效應(yīng)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說明在LPS作用下可上調(diào)CDX2表達(dá)。作為BE腸化的關(guān)鍵基因CDX2上調(diào)機(jī)制目前尚不清楚，實(shí)驗(yàn)顯示CDX2上調(diào)過程中，無論組織細(xì)胞還是體外培養(yǎng)細(xì)胞均伴有NF-κb活化和高表達(dá)，說明NF-κb可能是誘導(dǎo)CDX2上調(diào)的重要因素。目前有研究發(fā)現(xiàn)BMP4參與CDX2的調(diào)控，我們前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LPS可誘導(dǎo)BMP4 及BMP信號通路相關(guān)蛋白Smad1的表達(dá)。因此考慮LPS可通過激活多條通路促CDX2表達(dá)參與Barrett食管的發(fā)生發(fā)展[14-15]。

總之，通過實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)BE食管組織中NF-κB和CDX2高表達(dá)，LPS可以通過NF-κb通路促CDX2表達(dá)參與BE的發(fā)生。探索了BE發(fā)生和CDX2在BE上調(diào)的可能機(jī)制。益生菌的治療可能有助于抑制NF-κb信號途徑的激活以及預(yù)防BE甚至食管腺癌發(fā)生。但結(jié)論仍需進(jìn)一步研究證實(shí)，如LPS影響CDX2表達(dá)的具體分子機(jī)制，LPS與酸及膽鹽之間的關(guān)系等。進(jìn)一步了解食管微生態(tài)變化為BE的發(fā)病機(jī)制和臨床治療提供新的思路。