VEGF誘導(dǎo)致耐受性樹突狀細(xì)胞對口腔鱗狀細(xì)胞癌患者 T細(xì)胞免疫功能的影響

董斌，張兵#，封亞萍，韓彥博，楊新華，于兵兵

1平頂山市口腔醫(yī)院頜面外科，河南 平頂山467000

解放軍第一五二中心醫(yī)院2腫瘤科，3病理科，河南 平頂山467000

口腔鱗狀細(xì)胞癌是中國目前發(fā)病率和致死率較高的頭頸部惡性腫瘤之一，浸潤性強(qiáng)，易發(fā)生黏膜下擴(kuò)散和早期血行轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差，嚴(yán)重影響患者的呼吸、咀嚼、吞咽等正常生理功能以及患者的生命健康[1]。有研究顯示，口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展涉及多方面的因素，包括吸煙、飲酒、遺傳、環(huán)境、微生物感染等因素[2]。目前，對于口腔鱗狀細(xì)胞癌，臨床上主要采取以外科手術(shù)為基礎(chǔ)，聯(lián)合放療、化療、基因治療、靶向治療等的綜合序列治療方案，雖然大大提高了早期口腔鱗狀細(xì)胞癌患者的5年生存率，但是對于晚期口腔鱗狀細(xì)胞癌患者或復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后仍然較差[3]，因此，尋找新的治療方向和干預(yù)靶點(diǎn)具有十分重要的臨床意義。腫瘤與機(jī)體免疫系統(tǒng)的關(guān)系一直是醫(yī)學(xué)界長期研究的重點(diǎn)課題，腫瘤免疫治療、分子靶向治療、免疫檢查點(diǎn)療法等逐漸應(yīng)用于臨床，并取得良好的治療效果[4]。但是，有研究顯示，免疫治療的臨床療效受限于腫瘤免疫抑制性微環(huán)境，腫瘤免疫耐受是腫瘤細(xì)胞逃逸機(jī)體免疫系統(tǒng)監(jiān)控的主要機(jī)制之一，除了由于腫瘤細(xì)胞自身缺乏免疫原性，還與腫瘤細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子造成腫瘤微環(huán)境改變有關(guān)[5]。樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）是目前已知的功能最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞（antigen presenting cell，APC），在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞免疫耐受過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[6]。腫瘤微環(huán)境中存在的多種細(xì)胞因子可誘導(dǎo)DC向致耐受性DC分化，而血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）幾乎存在于所有的腫瘤組織內(nèi)，有研究顯示，VEGF與DC分化密切相關(guān)[7]，但是具體的作用機(jī)制目前尚不清楚。本研究將鱗狀細(xì)胞癌SCC-4細(xì)胞株與小鼠骨髓前體細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察VEGF對DC分化的影響，從而為口腔鱗狀細(xì)胞癌免疫治療的研究提供新的思路和臨床依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 受試細(xì)胞

人鱗狀細(xì)胞癌SCC-4細(xì)胞購自American Type Culture Collection公司。

1.2 受試動物

6～8周齡無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級別的C57BL/6小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)過程中對動物的處置符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 主要試劑

高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清、鏈霉素-青霉素雙抗均購自美國GIBCO公司，CFSE購自美國Sigma公司，rmGM-CSF、rmIL-6、rmIL-4和mVEGF均購自德國Miltenyi公司，兔抗鼠VEGF多克隆抗體、MIH5單克隆抗體均購自美國Abcam公司，CD11c-APC、CD80-FITC、CD86-PE、CD40-FITC、主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ（major histocompatibility complexⅡ，MHCⅡ）-PE、吲哚胺-2，3-雙加氧酶（indoleamine-2，3-dioxygenase，IDO）-eFluor、程序性死亡受體配體1（programmed cell death 1 ligand1，PDCD1LG1，也稱PD-L1）-PE和固定破膜試劑盒均購自美國eBioscience公司，IDO1抑制劑-1-甲基色氨酸（1-methyl-tryptophan，1-MT）購自美國Selleck公司，VEGF-A（mouse）ELISA試劑盒和IL-12P70（mouse）試劑盒均購自臺灣Abnova公司。

1.4 主要儀器

FACS Vantage SE型流式細(xì)胞儀購自美國BD公司，550型iMaker酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司，DI-CJ-2ND超凈工作臺購自北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司，HERcell 150i型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱和NanoDrop ND-1000紫外分光光度計(jì)均購自美國Thermo Scientific公司，Eppendorf 5427 R臺式高速冷凍離心機(jī)和各種型號的移液器均購自德國Eppndorf公司，CX41倒置光學(xué)顯微鏡購自日本OLYMPUS公司，F(xiàn)A系列電子分析天平購自上海光學(xué)儀器廠。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 細(xì)胞培養(yǎng)將人鱗狀細(xì)胞癌SCC-4細(xì)胞置于含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，將細(xì)胞置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。24～48 h更換培養(yǎng)液，48 h傳代1次。

1.5.2 制備小鼠骨髓細(xì)胞將小鼠頸椎脫臼處死，浸泡于75%乙醇溶液中10 min；在無菌條件下，取出下肢骨，采用RPMI1640沖洗骨髓腔，制成細(xì)胞懸液；用200目濾網(wǎng)過濾后，2500 r/min離心5 min，離心半徑為8 cm，棄除上清液；加入紅細(xì)胞裂解液，裂解細(xì)胞，靜置2 min，2500 r/min離心5 min，離心半徑為8 cm，棄除上清液；采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）沖洗3次后，收集骨髓細(xì)胞備用。

1.5.3 腫瘤微環(huán)境中培養(yǎng)DC采用RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基（含10%FBS，30 ng/ml rmGM-CSF，10 ng/ml rmIL-4，100 U/ml青霉素，100 μg/ml鏈霉素）重懸小鼠骨髓細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml。將小鼠骨髓細(xì)胞單層加入12孔板中，實(shí)驗(yàn)分為空白對照組（骨髓細(xì)胞）、VEGF組（骨髓細(xì)胞+20 ng/ml VEGF因子）、共培養(yǎng)組（骨髓細(xì)胞+SCC-4細(xì)胞）、抗VEGF組（骨髓細(xì)胞+SCC-4細(xì)胞+50 ng/ml VEGF抗體）。培養(yǎng)5 d后，收集懸浮及半懸浮細(xì)胞獲得未成熟DC。

1.5.4 ELISA法將SCC-4細(xì)胞以1×106/孔接種至6孔板中，分別培養(yǎng)24、48、72 h后收集上清，2500 r/min離心20 min，離心半徑為8 cm。采用雙抗體夾心ELISA法檢測VEGF含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。按要求依次稀釋標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，分別加入酶標(biāo)包被板中的各檢測孔中，每孔加入100 μl；設(shè)空白孔，每孔加入50 μl生物素化抗體工作液，室溫下孵育120 min，棄去液體，洗滌3次，每孔加入100 μl酶結(jié)合工作液，室溫下孵育60 min。棄去液體，洗滌3次，每孔加入100 μl顯色液，37℃避光顯色15 min。每孔加入100 μl終止顯色液，15 min內(nèi)檢測波長為450 nm處的光密度值（optical density，OD），計(jì)算平均值。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-12的檢測方法同上所述。

1.5.5 形態(tài)學(xué)觀察在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，采用倒置光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞的生長狀況以及細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.5.6 流式細(xì)胞術(shù)采用流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）收集未成熟DC，采用預(yù)冷的PBS洗滌3次后，2500 r/min離心20 min，離心半徑為8 cm，棄除上清液；加入500 μl的Binding Buffer重懸細(xì)胞，調(diào)整未成熟DC細(xì)胞至細(xì)胞濃度約為1×105/ml；取每管100 μl，加入2 μl的熒光標(biāo)記抗體，包括DC表面特異性分子CD11c、CD80、CD86、CD40、MHCⅡ以及IDO、PD-L1抗體，室溫下避光孵育15～20 min；2500 r/min離心20 min，離心半徑為8 cm；棄除上清液；加入500 μl的Binding Buffer重懸細(xì)胞；上機(jī)檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5.7 同種異體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（mixed lymphocyte reaction，MLR）分離小鼠脾臟T細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/ml。實(shí)驗(yàn)一：T細(xì)胞對照組（未成熟DC+T細(xì)胞）、VEGF組（未成熟DC+T細(xì)胞+20 ng/ml VEGF因子）、腫瘤上清培養(yǎng)組（未成熟DC+T細(xì)胞+SCC-4細(xì)胞上清）、抗VEGF組（未成熟DC+T細(xì)胞+SCC-4細(xì)胞上清+50 ng/ml VEGF抗體）；實(shí)驗(yàn)二：空白對照組（RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基）、陰性對照組（T細(xì)胞）、T細(xì)胞對照組（未成熟DC+T細(xì)胞）、抗IDO組（未成熟DC+T細(xì)胞+1 mmol/L 1-MT）、抗PD-L1組（未成熟DC+T細(xì)胞+1 mg/ml MIH5抗體）、抗IDO+PD-L1組（未成熟DC+T細(xì)胞+1 mmol/L 1-MT+1 mg/ml MIH5抗體）。將各組未成熟DC與T細(xì)胞（5×105/孔）分別按1∶5、1∶10、1∶20、1∶50的比例單層加入至96孔板中，加入RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基（10%FBS、30 ng/ml rmGM-CSF、10 ng/ml rmIL-4、1000 U/ml IL-2、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素），72 h后，加入20 μl噻 唑 藍(lán)（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT），置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h后，棄除上清液，每孔加入200 μl的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），置于振動器上振動5 min，置于顯微鏡下觀察無紫色結(jié)晶物。將96孔板放置于450酶標(biāo)儀上，檢測波長為450 nm處的OD值，計(jì)算平均值。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的方差分析和單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SCC- 4細(xì)胞培養(yǎng)上清中的VEGF水平

ELISA檢測結(jié)果顯示，24、48、72 h時(shí)SCC-4細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF的相對表達(dá)量分別為（181.54±52.67）pg/ml、（329.46± 73.23）pg/ml、（648.74±62.17）pg/ml，3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=164.250，P＜0.01）。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，VEGF的相對表達(dá)量明顯增加，培養(yǎng)72 h后，SCC-4細(xì)胞上清中VEGF的相對表達(dá)量高于24、48 h時(shí)SCC-4細(xì)胞上清中VEGF相對表達(dá)量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 體外誘導(dǎo)DC的形態(tài)特征和表型特征分析

于400倍倒置光學(xué)顯微鏡下觀察DC的形態(tài)特征，T細(xì)胞對照組小鼠骨髓細(xì)胞在rmGM-CSF和rmIL-4的誘導(dǎo)下，呈集落狀分布，體積增大，細(xì)胞表面有少量毛刺狀突起，為典型的DC形態(tài)，但是VEGF組和共培養(yǎng)組細(xì)胞集落形成數(shù)量及懸浮DC數(shù)目均較對照組明顯減少。提示口腔鱗狀細(xì)胞癌微環(huán)境及VEGF因子可有效地抑制DC的分化。

與空白對照組比較，VEGF組、共培養(yǎng)組和抗VEGF組DC表面特異性分子CD11c、CD80、CD86、CD40、MHCⅡ的表達(dá)水平及細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-12的表達(dá)水平均有所降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但是，共培養(yǎng)組和抗VEGF組DC表面特異性分子的表達(dá)水平卻均稍高于VEGF組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而抗VEGF組和共培養(yǎng)組DC表面的CD11c、CD80、CD86、CD40、MHCⅡ的表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

表1 各組未成熟DC表面標(biāo)志分子以及培養(yǎng)上清中IL-12表達(dá)水平的比較（±s）

表1 各組未成熟DC表面標(biāo)志分子以及培養(yǎng)上清中IL-12表達(dá)水平的比較（±s）

注：a與空白對照組比較，P＜0.05；b與VEGF組比較，P＜0.05

組別空白對照組VEGF組共培養(yǎng)組抗VEGF組F值P值CD11c（%）61.35±3.23 40.79±1.85a 49.21±2.02a b 50.76±1.76a b 135.489 0.000 CD80（%）53.62±0.94 43.19±1.28a 48.81±1.29a b 49.97±1.23a b 126.459 0.000 CD86（%）45.54±0.87 30.89±0.91a 38.74±0.83a b 39.15±1.02a b 434.192 0.000 CD40（%）65.91±2.84 53.17±3.08a 61.52±2.28a b 62.04±2.08a b 42.517 0.000 MHCⅡ（%）29.49±0.75 18.44±0.69a 22.83±0.70a b 22.61±0.83a b 376.548 0.000 IL-12（pg/ml）36.52±0.58 27.72±0.38a 30.33±0.48a b 29.94±0.51a b 588.705 0.000

2.3 各組DC對同種異源 T細(xì)胞增殖活性的影響

MLR法檢測結(jié)果顯示，未成熟DC能夠輕度刺激T細(xì)胞增殖，且隨著未成熟DC與T細(xì)胞比例的增加，未成熟DC刺激T細(xì)胞增殖的活性逐漸加強(qiáng)。在相同比例下，4組未成熟DC刺激T細(xì)胞增殖的活性比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；其中，T細(xì)胞對照組和抗VEGF組未成熟DC刺激T細(xì)胞的增殖活性均高于VEGF組和共培養(yǎng)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且T細(xì)胞對照組刺激T細(xì)胞的增殖能力高于抗VEGF組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；VEGF組和共培養(yǎng)組刺激T細(xì)胞增殖能力比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

表2 不同組別未成熟DC誘導(dǎo)后同種異源 T細(xì)胞增殖情況的比較（±s）

表2 不同組別未成熟DC誘導(dǎo)后同種異源 T細(xì)胞增殖情況的比較（±s）

注：a與T細(xì)胞對照組比較，P＜0.05；b與VEGF組比較，P＜0.05；c與共培養(yǎng)組比較，P＜0.05

組別T細(xì)胞對照組VEGF組共培養(yǎng)組抗VEGF組F值P值DC∶T細(xì)胞1∶5 9.35±0.21 6.48±0.21a 6.39±0.19a 7.19±0.19a b c 491.432 0.000 1∶10 6.15±0.17 3.31±0.18a 3.29±0.17a 4.03±0.14a b c 656.381 0.000 1∶20 2.83±0.19 1.49±0.19a 1.51±0.20a 1.69±0.21a b c 104.337 0.000 1∶50 1.15±0.16 0.41±0.16a 0.39±0.17a 0.53±0.14a b c 51.458 0.000

2.4 VEGF誘導(dǎo)未成熟DC表達(dá)IDO和PD-L1

FCM檢測結(jié)果顯示，4組未成熟DC表面IDO和PD-L1的表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與T細(xì)胞對照組比較，VEGF組、共培養(yǎng)組和抗VEGF組中未成熟DC表面IDO和PD-L1的表達(dá)水平均有所升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而共培養(yǎng)組未成熟DC表面IDO和PD-L1的表達(dá)水平最高?？筕EGF組未成熟DC表面IDO和PD-L1的表達(dá)水平均低于VEGF組和共培養(yǎng)組，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表3）

表3 口腔鱗狀細(xì)胞癌微環(huán)境中VEGF誘導(dǎo)未成熟DC表達(dá)IDO和PD-L1（%，±s）

表3 口腔鱗狀細(xì)胞癌微環(huán)境中VEGF誘導(dǎo)未成熟DC表達(dá)IDO和PD-L1（%，±s）

注：a與T細(xì)胞對照組比較，P＜0.05

組別T細(xì)胞對照組VEGF組共培養(yǎng)組抗VEGF組F值P值IDO 63.44±5.57 81.42±7.02a 84.37±5.53a 76.81±6.97a 21.750 0.000 PD-L1 49.22±5.51 62.06±7.02a 64.38±6.28a 59.42±6.53a 14.209 0.000

2.5 未成熟DC通過高表達(dá)IDO和PD-L1對 T細(xì)胞增殖活性的影響

MLR法檢測結(jié)果顯示，未成熟DC通過高表達(dá)IDO和PD-L1，在相同比例下，各組T細(xì)胞增殖活性比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；抗IDO組、抗PD-L1組和抗IDO+PD-L1組T細(xì)胞的增殖活性均高于T細(xì)胞對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中，抗IDO+PD-L1組T細(xì)胞的增殖活性最高。而抗IDO組和抗PD-L1組T細(xì)胞的增殖活性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表4）

表4 不同組別未成熟DC誘導(dǎo)后 T細(xì)胞增殖活性的比較（±s）

表4 不同組別未成熟DC誘導(dǎo)后 T細(xì)胞增殖活性的比較（±s）

注：a與T細(xì)胞對照組比較，P＜0.05；b與VEGF組比較，P＜0.05；c與共培養(yǎng)組比較，P＜0.05

組別T細(xì)胞對照組抗IDO組抗PD-L1組抗IDO+PD-L1組F值P值DC∶T細(xì)胞1∶5 5.98±0.34 7.52±0.46a 7.39±0.31a 8.46±0.52a b c 60.331 0.000 1∶10 2.64±0.19 3.87±0.26a 4.01±0.23a 4.53±0.21a b c 127.679 0.000 1∶20 1.42±0.14 1.87±0.11a 1.86±0.16a 2.49±0.08a b c 121.532 0.000 1∶50 0.31±0.04 0.54±0.04a 0.50±0.07a 0.83±0.06a b c 157.827 0.000

3 討論

與其他大多數(shù)惡性腫瘤一樣，口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生涉及多種因素、多個(gè)階段的調(diào)控，而腫瘤微環(huán)境為腫瘤的生長提供了有利條件，但是其中的非腫瘤成分，也參與調(diào)控腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸，包括腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor associated macrophage，TAM）、髓樣來源抑制細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、致耐受性DC等[8-9]。腫瘤免疫耐受是腫瘤細(xì)胞逃逸機(jī)體免疫系統(tǒng)監(jiān)控的主要機(jī)制之一，除與腫瘤細(xì)胞自身缺乏免疫原性有關(guān)外，也與腫瘤微環(huán)境中存在的影響免疫狀態(tài)的各種細(xì)胞因子有關(guān)[5]。

DC是目前發(fā)現(xiàn)的免疫調(diào)節(jié)功能最強(qiáng)大的APC，通過有效地識別、處理、呈遞外來抗原，使機(jī)體發(fā)揮正常的免疫監(jiān)視功能[10]。正常情況下，未成熟DC能夠識別吞噬抗原，繼而分化為成熟的DC，刺激抗原特異性T細(xì)胞發(fā)生免疫反應(yīng)[11]。但在腫瘤微環(huán)境中，雖然存在大量的浸潤DC，但是腫瘤細(xì)胞依然能夠發(fā)生免疫逃逸，這可能與腫瘤微環(huán)境中存在的免疫抑制分子有關(guān)，如VEGF、IL-2等[12]。本研究將口腔鱗癌細(xì)胞株SCC-4作為刺激細(xì)胞，將小鼠髓源性DC作為反應(yīng)細(xì)胞，共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，口腔鱗狀細(xì)胞癌中VEGF能夠抑制DC分化，同時(shí)抑制T細(xì)胞增殖，提示口腔鱗狀細(xì)胞癌中VEGF誘導(dǎo)的未成熟DC可能屬于一類致耐受性DC。

未成熟DC在誘導(dǎo)T細(xì)胞外周免疫耐受的過程中發(fā)揮了重要的作用，但是在腫瘤微環(huán)境中誘導(dǎo)未成熟DC產(chǎn)生致耐受性的作用機(jī)制尚不明確。本研究首先采用ELISA法證實(shí)了SCC-4細(xì)胞分泌VEGF的能力，提示可利用SCC-4細(xì)胞體外模擬口腔鱗狀細(xì)胞癌高表達(dá)VEGF的微環(huán)境，進(jìn)一步探討VEGF對未成熟DC的影響。結(jié)果顯示，VEGF組、共培養(yǎng)組和抗VEGF組DC表面CD11c、CD80、CD86、CD40、MHCⅡ的表達(dá)水平均低于空白對照組。DC在體內(nèi)分為成熟狀態(tài)和未成熟狀態(tài)，未成熟DC攝取抗原后，在炎性因子刺激下，將抗原物質(zhì)降解為抗原肽，經(jīng)過一系列的修飾加工后，與MHCⅡ分子結(jié)合成為穩(wěn)定的MHC-抗原肽復(fù)合物，從而被T細(xì)胞特異性識別[13]。由于T細(xì)胞對抗原的識別具有MHC限制，因此，MHC分子的表達(dá)水平可反映抗原呈遞能力。未成熟DC攝入抗原后，逐漸分化成為成熟DC，細(xì)胞表面的CD80、CD86、CD40、MHCⅡ共刺激分子的陽性表達(dá)率升高，CD80、CD86、CD40與相應(yīng)配體結(jié)合后可激活細(xì)胞表面黏附分子的表達(dá)，并誘導(dǎo)IL-12等多種細(xì)胞因子的分泌，延長DC壽命[14]。CD-11c屬于小鼠DC表面的標(biāo)志分子，其表達(dá)水平的降低說明腫瘤微環(huán)境中VEGF可抑制骨髓前體細(xì)胞向DC分化；而CD80、CD86、CD40、MHCⅡ表達(dá)水平的降低提示DC仍處于未成熟狀態(tài)，抗原呈遞功能受到抑制。

IDO和PD-L1是目前研究較為廣泛的致耐受性分子，主要表達(dá)于APC表面，并且與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)，通過多種調(diào)控機(jī)制抑制效應(yīng)T細(xì)胞的功能，促使調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）生成，進(jìn)而導(dǎo)致免疫耐受。有研究顯示，PD-L1可能通過與T細(xì)胞表面的CD80結(jié)合，抑制晚期T細(xì)胞的免疫監(jiān)視功能[15]。上述研究結(jié)果已經(jīng)證實(shí)口腔癌中的DC多為未成熟細(xì)胞，且腫瘤微環(huán)境中的VEGF可明顯抑制DC分化，因此推測VEGF誘導(dǎo)致耐受性DC可能的作用機(jī)制為促使未成熟DC高表達(dá)IDO和PD-L1分子。Marti等[16]經(jīng)研究認(rèn)為VEGF可促使成熟DC高表達(dá)IDO，進(jìn)而抑制T細(xì)胞的免疫反應(yīng)。本研究采用FCM證實(shí)IDO和PD-L1在未成熟DC表面表達(dá)水平較高，拮抗VEGF的表達(dá)后，IDO和PD-L1的表達(dá)水平下調(diào)，說明口腔鱗狀細(xì)胞癌微環(huán)境中VEGF可促使未成熟DC表達(dá)IDO和PD-L1，從而致誘導(dǎo)耐受性DC的生成。

綜上所述，口腔鱗狀細(xì)胞癌微環(huán)境中大量的VEGF分子通過刺激IDO和PD-L1的表達(dá)，可抑制未成熟DC向成熟DC分化，從而誘導(dǎo)致耐受性DC的形成，并進(jìn)一步抑制T細(xì)胞的增殖，干擾機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)控，產(chǎn)生免疫耐受，促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)展。