PDCD 4通過Wnt/β -catenin信號(hào)通路抑制宮頸癌細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)研究

劉莉娟，邢燕，岳青芬

鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院婦科，河南 洛陽471000

宮頸癌的發(fā)病率居中國女性生殖道腫瘤的首位，嚴(yán)重威脅著女性的健康[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球新發(fā)宮頸癌病例約為50萬/年，其中約7/8的新發(fā)病例發(fā)生于發(fā)展中國家[2]。目前，宮頸癌患者就診時(shí)多數(shù)已處于晚期，因此尋找一種與宮頸癌早期診斷、預(yù)后判斷和靶向治療有關(guān)的生物標(biāo)志物十分迫切。細(xì)胞程序性死亡蛋白4（programmed cell death 4，PDCD4）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種凋亡相關(guān)基因，在細(xì)胞程序性死亡過程起重要作用。相關(guān)研究表明，PDCD4可以抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[3]。據(jù)報(bào)道，PDCD4表達(dá)水平的變化與腫瘤病理分級(jí)和預(yù)后密切相關(guān)[4]。目前，關(guān)于PDCD4對(duì)宮頸癌細(xì)胞的影響及其在宮頸癌中的作用機(jī)制的研究比較缺乏。因此，本實(shí)驗(yàn)通過過表達(dá)PDCD4，檢測其對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

宮頸癌HeLa細(xì)胞由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；DMEM培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司；蛋白裂解液RIPA、蛋白酶抑制劑均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白含量檢測試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司；PDCD4抗體、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）抗體、分泌型蛋白Dickkopf-1（DKK1）抗體、細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的抗兔二抗均購自美國Cell Signal Technology公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將凍存在液氮中的HeLa細(xì)胞取出，迅速置于37℃水浴鍋中復(fù)蘇，隨后轉(zhuǎn)移至15 ml玻璃離心管中，加入含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，輕輕顛倒混勻，離心，棄上清，細(xì)胞計(jì)數(shù)，在37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)70%～80%時(shí)，0.25%的胰蛋白酶消化，按1∶3傳代培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取對(duì)數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞，將培養(yǎng)基更換為不含抗生素的DMEM培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)70%～80%時(shí)，使用LipofectamineTM2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。以加入PGC-FU-GFP-PDCD4表達(dá)載體的細(xì)胞為過表達(dá)組，以加入PGC-FU-GFP表達(dá)載體的細(xì)胞為空載體組，以未做轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為空白對(duì)照組。將各組細(xì)胞接種于6孔板中，每孔加入5×105個(gè)細(xì)胞，加入5 μl LipofectamineTM2000和500 μl無血清培養(yǎng)基，振蕩混勻，于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測轉(zhuǎn)染效果。

1.4 噻唑藍(lán)法檢測細(xì)胞增殖能力

將過表達(dá)組、空載體組和空白對(duì)照組HeLa細(xì)胞接種于96孔板中，每孔加入1×106個(gè)細(xì)胞，輕輕混勻，每組5個(gè)復(fù)孔，于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，加入20 μl MTT溶液，37℃培養(yǎng)4 h，待有藍(lán)色結(jié)晶紫產(chǎn)生，加150 μl二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），37℃、避光，搖床振蕩10 min，使用酶標(biāo)儀測定各孔490 nm波長處的吸光度值（OD值），計(jì)算細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡能力

采用不含EDTA的胰蛋白酶消化過表達(dá)組、空載體組和空白對(duì)照組HeLa細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌 2次，收集（1～5）×105個(gè)細(xì)胞，加入 500 μl Binding Buffer、5 μl Annexin V-FITC，振蕩混勻，室溫下避光培養(yǎng)5 min，采用流式細(xì)胞儀測定各組細(xì)胞的凋亡情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.6 Western blot檢測細(xì)胞中 β-catenin、DKK 1、cyclin D 1蛋白的表達(dá)

取過表達(dá)組、空載體組和空白對(duì)照組HeLa細(xì)胞，加入 300 μl RIPA、3 μl蛋白酶抑制藥，充分搖勻，置于冰上反應(yīng)30 min，收集蛋白轉(zhuǎn)入干凈的EP管中，根據(jù)BCA蛋白濃度檢測試劑盒說明書檢測蛋白濃度；使用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離膠和5%SDSPAGE濃縮膠電泳，每孔大約加入30 μg的蛋白質(zhì)，沸水浴5 min，電泳；取下凝膠，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidenefluoride，PVDF）膜上；置于含5%脫脂奶粉的TBST液封閉1 h，加入一抗（分別加入β-actin一抗，1∶1000；PDCD4一抗，1∶1000；β-catenin一抗，1∶400；DKK1一抗 1∶400；cyclin D1一抗1∶1000），置于37℃、搖床中孵育1 h，4℃過夜培養(yǎng)；TBST洗膜3次，每次5 min；加入HRP標(biāo)記的抗兔二抗（1∶5000），室溫培養(yǎng)1 h，TBST洗膜3次，每次5 min；暗室中，滴加ECL發(fā)光液，采用凝膠成像儀掃描，目的蛋白灰度值/β-actin灰度值表示蛋白表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)-計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用F檢驗(yàn)，多組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果

Western blot檢測結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染后，過表達(dá)組、空載體組和空白對(duì)照組細(xì)胞中PDCD4蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為（1.53±0.12）、（0.41±0.07）和（0.39±0.04），3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=287.0，P＜0.01）。其中，空載體組細(xì)胞中PDCD4蛋白的相對(duì)表達(dá)量與空白對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；過表達(dá)組細(xì)胞中PDCD4蛋白的相對(duì)表達(dá)量高于空白對(duì)照組和空載體組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（圖1）

圖1 Western blot檢測轉(zhuǎn)染后 3組細(xì)胞中PDCD 4蛋白的表達(dá)

2.2 PDCD 4過表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響

MTT法檢測結(jié)果顯示：過表達(dá)組、空載體組和空白對(duì)照組細(xì)胞的存活率分別為（40.5±3.8）%、（96.5±6.2）%和（100.0±4.4）%，3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=229.6，P＜0.01）。其中，空載體組細(xì)胞的存活率與空白對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；過表達(dá)組細(xì)胞的存活率低于空白對(duì)照組和空載體組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 PDCD 4過表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡能力的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：過表達(dá)組、空載體組和空白對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率分別為（48.6±4.3）%、（12.4±1.4）%、（10.5±1.2）%，3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=316.6，P＜0.01）。其中，空載體組細(xì)胞的凋亡率與空白對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；過表達(dá)組細(xì)胞的凋亡率高于空白對(duì)照組和空載體組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（圖2）

圖2 不同組別HeLa細(xì)胞的凋亡情況

2.4 PDCD 4過表達(dá)對(duì)HeLa細(xì)胞中 β-catenin、DKK 1、cyclin D 1蛋白表達(dá)水平的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示：過表達(dá)組、空載體組和空白對(duì)照組細(xì)胞中β-catenin、DKK1、cyclin D1蛋白的表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。其中，空載體組細(xì)胞中β-catenin、DKK1、cyclin D1蛋白的表達(dá)水平與空白對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；過表達(dá)組細(xì)胞中βcatenin、DKK1、cyclin D1蛋白的表達(dá)水平均低于空白對(duì)照組和空載體組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（圖3、表1）

圖3 Western blot檢測 3組細(xì)胞中 β-catenin、DKK 1、cyclin D 1的表達(dá)

表1 3組細(xì)胞中β -catenin、DKK 1、cyclin D 1表達(dá)量的比較（±s）

表1 3組細(xì)胞中β -catenin、DKK 1、cyclin D 1表達(dá)量的比較（±s）

注：*與過表達(dá)組比較，P＜0.05

組別空白對(duì)照組空載體組過表達(dá)組F值P值β-catenin 0.78±0.09*0.77±0.11*0.34±0.06 38.69＜0.01 DKK1 0.84±0.10*0.85±0.10*0.31±0.08 52.20＜0.01 cyclin D1 0.66±0.07*0.69±0.08*0.30±0.08 41.26＜0.01

3 討論

PDCD4基因位于10q24，其編碼蛋白約含有469個(gè)氨基酸，可以影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移等過程，抑制腫瘤的惡化[5]。PDCD4表達(dá)水平的升高或降低均對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長、凋亡等過程產(chǎn)生較大影響。Matsuhashi等[6]研究表明，PDCD4可以通過調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）誘導(dǎo)原發(fā)性肝癌細(xì)胞凋亡。在卵巢癌中，異常表達(dá)的PDCD4可以通過調(diào)節(jié)p21和p27基因的表達(dá)，使卵巢癌細(xì)胞停滯在G1期或上調(diào)細(xì)胞周期，進(jìn)而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的目的[7]。PDCD4在鼻咽癌組織中的表達(dá)水平低于正常黏膜組織，穩(wěn)定地過表達(dá)PDCD4可以削弱腫瘤細(xì)胞的存活力，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，從而使體內(nèi)成瘤速度明顯減慢[8]。在血液惡性腫瘤中，PDCD4mRNA和蛋白的表達(dá)水平降低，表明PDCD4參與阻滯血液惡性腫瘤患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞凋亡過程，促進(jìn)血液惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[9]。毛玲等[10]研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿體外作用于人腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞可以提高PDCD4的表達(dá)水平及增加腫瘤細(xì)胞的敏感度和凋亡率。PDCD4在宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)[11]，但關(guān)于PDCD4對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控以及作用機(jī)制的報(bào)道較少。本研究通過對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染PGCFU-GFP-PDCD4和PGC-FU-GFP表達(dá)載體發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)組細(xì)胞中PDCD4蛋白的相對(duì)表達(dá)量高于空轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組（P＜0.05），細(xì)胞的存活率低于空白對(duì)照組和空載體組（P＜0.05），細(xì)胞的凋亡率高于空白對(duì)照組和空載體組（P＜0.05），表明PGCFU-GFP-PDCD4載體可以促進(jìn)HeLa細(xì)胞中PDCD4的表達(dá)，而過表達(dá)的PDCD4可以抑制HeLa細(xì)胞的增殖，促進(jìn)HeLa細(xì)胞的凋亡，其可能原因?yàn)镻DCD4阻礙了腫瘤細(xì)胞的有絲分裂過程，但PDCD4的具體作用機(jī)制尚未完全清楚。

Nusse等[12]報(bào)道中將小鼠乳腺瘤原癌基因int1和果蠅無翅基因wingless合稱為Wnt。Wnt信號(hào)通路調(diào)控胚胎發(fā)育和機(jī)體正常生理過程，同時(shí)誘導(dǎo)多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[13]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是Wnt信號(hào)通路的經(jīng)典途徑，該通路在細(xì)胞的生長、遷移過程中發(fā)揮重要作用，主要是提高βcatenin的表達(dá)水平并向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，其作用原理為Wnt蛋白通過與細(xì)胞表面因子結(jié)合形成三聚體，并活化細(xì)胞質(zhì)內(nèi)蓬亂蛋白，抑制β-catenin磷酸化降解，提高細(xì)胞質(zhì)中β-catenin的含量，細(xì)胞質(zhì)的通透性增強(qiáng)，β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核與T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子/淋巴樣增強(qiáng)因子相互作用，從而激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)下游靶基因的表達(dá)，調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、細(xì)胞生理過程及耐藥性等[14-15]。DKK1、cyclin D1是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的下游靶基因[16]。DKK1可以誘導(dǎo)產(chǎn)生具有內(nèi)吞功能的三元復(fù)合物，阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡[17]。cyclin D1能特異性調(diào)控細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)換，cyclin D1低表達(dá)可以抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[18]。本實(shí)驗(yàn)通過Western blot檢測轉(zhuǎn)染后HeLa細(xì)胞中β-catenin、DKK1、cyclin D1蛋白的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組和空轉(zhuǎn)染組相比，過表達(dá)組細(xì)胞中β-catenin、DKK1、cyclin D1蛋白的相對(duì)表達(dá)量均降低，表明PDCD4可以通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活化和細(xì)胞周期G1/S期的轉(zhuǎn)換，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

綜上所述，PDCD4通過阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活下游靶基因的表達(dá)，從而抑制宮頸癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡。PDCD4可以作為一種抑癌基因，調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，為宮頸癌的診斷、治療提供理論依據(jù)。