多指標(biāo)綜合評(píng)分法對(duì)理氣復(fù)胃口服液的澄清工藝優(yōu)化及比較

白 蘭，李晉奇，童榮生，師健友

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院，個(gè)體化藥物治療四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610072)

理氣復(fù)胃口服液為我院生產(chǎn)的醫(yī)院制劑，由木香、枳實(shí)、陳皮、大黃等七味中藥組成，臨床使用近三十余年，具有行氣寬脹、消積導(dǎo)滯、燥濕健脾的功效，用于腹脹、噯氣、早飽、上腹痛、反酸、燒心等消化不良癥的治療及手術(shù)后胃腸功能的恢復(fù)[1]，臨床觀(guān)察有效率達(dá)96.05%。理氣復(fù)胃口服液現(xiàn)有提取精制工藝為水提醇沉，操作方便，但成品外觀(guān)質(zhì)量較差，短期放置即出現(xiàn)沉淀，不符合現(xiàn)行藥典標(biāo)準(zhǔn)。為提高口服液的澄明度的同時(shí)保留有效成分，在課題組將含測(cè)指標(biāo)由測(cè)定大黃素提高到測(cè)定大黃總蒽醌(大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚)，并重新考察提取工藝的基礎(chǔ)上，以干膏率和大黃總蒽醌為綜合評(píng)分法考察指標(biāo)，比較醇沉法、離心法、ZTC1+1Ⅲ型天然澄清劑法三種澄清方法，為理氣復(fù)胃口服液澄清工藝的改進(jìn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1儀器與試藥Waters2690 高效液相色譜儀，包括2996二極管陣列檢測(cè)器，Empower Chromatography Manager 色譜數(shù)據(jù)工作站(美國(guó)waters公司)；BP 211D型十萬(wàn)分之一電子分析天平( 德國(guó)Sartorius 公司)；蒸發(fā)皿、離心機(jī)、水浴鍋、恒溫鼓風(fēng)干燥箱等。木香(141119)、枳實(shí)(141030)、陳皮(141104)、白術(shù)(141029)、大黃、萊菔子(141110)、法半夏(141114)七味藥材購(gòu)于四川省中藥飲片有限責(zé)任公司；ZTC1+1Ⅲ(150623，天津振天成科技有限公司)；大黃素對(duì)照品(110756-200210)，大黃酚對(duì)照品(110796-200208)，大黃酸對(duì)照品(110757-200206)，蘆薈大黃素對(duì)照品(110795-200806)，大黃素甲醚(110758-200611)，均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，乙醇為分析純。

1.2方法

1.2.1理氣復(fù)胃口服液提取液的制備 根據(jù)課題組前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，提取工藝為[2]：按處方量稱(chēng)取木香、枳實(shí)、陳皮、白術(shù)四味藥，加10倍量水，提取芳香水，濾過(guò)，濾液收集備用。殘?jiān)c大黃、萊菔子、法半夏合并加10倍水量，煎煮2 次，每次1小時(shí)，過(guò)濾。合并三份濾液，減壓濃縮至相應(yīng)體積(藥液濃度為1：1，即1 ml藥液相當(dāng)于1 g原藥材)。

1.2.2干膏收率的測(cè)定 精密量取一定量的藥液，置干燥恒重的蒸發(fā)皿中，105 ℃干燥至恒重，取出放入干燥器中冷卻至室溫，迅速稱(chēng)重，計(jì)算干膏收率(%)。干膏率(%)=提取液的干膏重量/相當(dāng)?shù)乃幉闹亓俊?00%

1.2.3大黃總蒽醌含量測(cè)定 色譜條件根據(jù)課題組已有報(bào)道，大黃總蒽醌含量測(cè)定條件為[3]：色譜柱Phenomenex Gemini C18( 250 mm×4.6 mm，5 μm，110 A)，保護(hù)柱Security Guard Cartridges Gemini C18( 4 mm×3.0 mm)，柱溫35 ℃，流動(dòng)相：甲醇-乙腈-0.01 mol/L，NaHP2O4(pH1.5) (2∶5∶3.5)，流速1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)435 nm。

1.2.4綜合評(píng)分 對(duì)各個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合考慮和權(quán)衡，以綜合指標(biāo)( overall desirability，OD) 進(jìn)行直觀(guān)分析和方差分析。根據(jù)干膏率和大黃總蒽醌所做貢獻(xiàn)比重大小，分別賦予加權(quán)值0.2和0.8。OD=干膏率(%)×0.2 + 大黃總蒽醌(μg/ml)×0.8

1.2.5醇沉法醇沉法 為現(xiàn)有工藝[4]，取1.2.1項(xiàng)下制備的提取液9份，分成3組，濃縮至相對(duì)密度1.20～1.25(20 ℃)，每組分別加乙醇至含醇65%、75%、85%，4 ℃靜置24 h，濾過(guò)，濾液回收乙醇至無(wú)醇味，加水定溶至相應(yīng)體積，測(cè)定干膏率和大黃總蒽醌含量，平行試驗(yàn)3次。

1.2.6離心法正交實(shí)驗(yàn) 選取藥水比、離心轉(zhuǎn)速、離心時(shí)間三個(gè)影響離心效果的主要因素，進(jìn)行正交試驗(yàn)，因水平表見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)方法：取50 ml提取液，分別按要求稀釋?zhuān)x心，合并上清液，濃縮至50 ml，測(cè)定。

表1 離心法工藝正交試驗(yàn)因素水平

1.2.7澄清劑法[5～7]①ZTC 1 + 1 Ⅲ型天然澄清劑的配制。A組分的配制：精密稱(chēng)取A組分2 g，加入適量去離子水超聲溶解，再加入去離子水至200 ml，攪拌，溶脹24 h，雙層紗布濾過(guò)，即得到1% A組分溶液。B組份的配制：精密稱(chēng)取B組分2 g，加入適量1% 醋酸超聲溶解，再加1%醋酸至200 ml，攪拌，溶脹24 h，雙層紗布濾過(guò)，即得到1% B組分溶液。②ZTC 1 + 1 Ⅲ型天然澄清劑的加入順序及方法。加入順序：根據(jù)澄清劑使用原則，當(dāng)溶液pH<4.8，按照先A后B的順序添加澄清劑；在pH值>4.8溶液中，按照先B后A的順序添加澄清劑。經(jīng)測(cè)定，提取液分別稀釋1、4、8倍，溶液的pH值均小于4.8，因此按照先A后B的順序添加澄清劑。實(shí)驗(yàn)方法：取1.3.1項(xiàng)下理氣復(fù)胃口服液提取液100 ml，按比例加入一定量水稀釋?zhuān)瑴囟绕胶夂蠹尤階組分溶液，在相應(yīng)溫度下攪拌2 h，加入B組份溶液，再恒溫?cái)嚢枰欢〞r(shí)間，取出冷卻至室溫，4 ℃放置24 h，濾過(guò)，濾液濃縮至100 ml，測(cè)定。③正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。選取藥：水、ZTC1 + 1Ⅲ型天然澄清劑加入總量、溫度、加入B組分后攪拌時(shí)間四個(gè)影響澄清效果的主要因素，進(jìn)行正交試驗(yàn)，因水平表見(jiàn)表2。

表2 ZTC1+1Ⅲ澄清劑法正交試驗(yàn)因素水平

2 結(jié)果

2.1醇沉法實(shí)驗(yàn)結(jié)果由醇沉實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，原醇沉方案綜合評(píng)分最高為85%乙醇組，與75%乙醇組相差不大。見(jiàn)表3。

2.2離心法實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)綜合評(píng)分結(jié)果以及方差分析可知，離心法各因素對(duì)除雜效果影響優(yōu)劣：離心轉(zhuǎn)速>離心時(shí)間>藥水比。由直觀(guān)分析可知最佳方案為藥∶水為1∶3，轉(zhuǎn)速16000 r/min，離心時(shí)間60 min。方差分析顯示三個(gè)因素對(duì)離心法除雜效果均有顯著性影響。見(jiàn)表4、表5。

表3 醇沉法實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n= 3)

表4 離心法正交試驗(yàn)安排及結(jié)果

表5 離心法實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析及方差分析

2.3ZTC1+1Ⅲ型澄清劑法實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)綜合評(píng)分結(jié)果以及表7極差分析可知，使用ZTC 1 + 1 Ⅲ型天然澄清劑澄清除雜各因素對(duì)除雜效果影響優(yōu)劣：藥水比>ZTC1 + 1Ⅲ型天然澄清劑加入總量>溫度>加入B組分后攪拌時(shí)間。因素A、B對(duì)使用ZTC1 + 1 Ⅲ型天然澄清劑澄清除雜效果有顯著性影響，因素C對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，綜合以上結(jié)果，從節(jié)約成本和時(shí)間出發(fā)，最佳實(shí)驗(yàn)方案定為藥水比按1∶1，澄清劑加入總量2%，溫度70 ℃，攪拌時(shí)間為15 min。見(jiàn)表6、表7。

表6 ZTC1 + 1Ⅲ型澄清劑法正交試驗(yàn)安排及結(jié)果

表7 ZTC 1 + 1 Ⅲ澄清劑法實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析及方差分析

3 討論

3.1澄清方法比較中藥水提液中含有大量雜質(zhì)如淀粉、樹(shù)膠、果膠、粘液質(zhì)、蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)、色素等，本次實(shí)驗(yàn)三種澄清方法均可達(dá)到一定程度的除雜目的。醇沉法是常見(jiàn)的除雜方法，但就理氣復(fù)胃口服液而言，經(jīng)放置后很快出現(xiàn)沉淀；離心法是借助互不相溶組分間不同的離心力而達(dá)到分離的物理方法，在其分離的過(guò)程中，不會(huì)引起溶液中有效成份發(fā)生相變，實(shí)驗(yàn)中藥液放置一段時(shí)間后仍會(huì)有較多沉淀出現(xiàn)，推測(cè)可能多次離心或提高離心轉(zhuǎn)速能夠提高澄清效果，但不適合于現(xiàn)有設(shè)備的大生產(chǎn)；ZTC1+1澄清劑主要用于去除鞣質(zhì)、蛋白質(zhì)、蠟質(zhì)等膠體不穩(wěn)定成分，對(duì)中草藥有效成分如黃酮、生物堿、皂苷類(lèi)、萜類(lèi)、多肽、維生素、礦物質(zhì)等不影響，作用原理是第一種組分加入后，在不同的可溶性大分子之間架橋連接，使分子迅速增大，第二種組分在第一種組分形成的復(fù)合物的基礎(chǔ)上再架橋，使絮體盡快形成沉淀而除去，達(dá)到除雜的目的[8]。本次實(shí)驗(yàn)中，用ZTC1 + 1Ⅲ型澄清劑法所得樣品能夠保持較長(zhǎng)時(shí)間不產(chǎn)生沉淀。

3.2評(píng)價(jià)指標(biāo)的選擇和綜合評(píng)分的建立由于理氣復(fù)胃口服液方中君藥木香主要成分木香內(nèi)酯和二氫木香內(nèi)酯等，屬于揮發(fā)性物質(zhì)，課題組發(fā)現(xiàn)樣品在放置過(guò)程中幾天內(nèi)揮發(fā)至無(wú)法測(cè)定，因此選擇大黃中大黃總蒽醌作為考察對(duì)象。為保證ZTC1+1Ⅲ型天然澄清劑除雜效果，選取干膏率與大黃總蒽醌作為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)分。

綜上所述，乙醇沉淀法、離心法、ZTC1+1Ⅲ型澄清劑法三種方法的最佳工藝OD分別為217.63、214.06、213.80，綜合評(píng)分結(jié)果相近，初步說(shuō)明改變工藝對(duì)制劑干膏率和大黃總蒽醌影響較小。與長(zhǎng)期常溫放置觀(guān)察樣品性狀結(jié)合，乙醇沉淀法3～5天出現(xiàn)沉淀，離心法5個(gè)月開(kāi)始出現(xiàn)沉淀，ZTC1+1Ⅲ型澄清劑法放置6個(gè)月不出現(xiàn)沉淀。此外，ZTC1+1Ⅲ型澄清劑法與其他方法相比不僅簡(jiǎn)便易行，成本可控，不需要特殊設(shè)備，可實(shí)現(xiàn)大生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。