COX-2-PGE2-EP在白藜蘆醇抗結(jié)直腸癌中的作用研究

李燕 ，彭芳 ，鐘斌 ，馮李長 ，張羽 ，徐小軍

(1、贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院；2、贛州市人民醫(yī)院；3、贛南醫(yī)學(xué)院，江西 贛州 341000)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer)是全球第四大癌癥相關(guān)死亡原因，每年估計有超過60萬人死于結(jié)直腸癌，約占所有癌癥死亡病例的8%[1]。隨著近年來生活方式的改變，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率不斷上升，2012中國腫瘤登記年報顯示，腫瘤發(fā)病的排位中，結(jié)直腸癌首次超過胃癌，躍居第2位[2]。

80%的結(jié)直腸癌是由腺瘤性息肉演變而來，癌變前有長達(dá)10年的良性腫瘤發(fā)展階段，該時間窗為結(jié)直腸癌的預(yù)防和早期診斷提供了有利的時機(jī)[3]。白藜蘆醇為蒽醌萜類化合物，諸多醫(yī)學(xué)研究表明，白藜蘆醇能夠抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展中的多條信號通路，但其機(jī)制有待更深入的研究。

環(huán)氧合酶（COX）是前列腺素（PGs）合成過程的重要限速酶，COX-2在大多數(shù)組織中呈誘導(dǎo)性表達(dá)，并能被多種刺激因素如炎癥刺激、生長因子、細(xì)胞因子和某些癌蛋白等誘導(dǎo)而表達(dá)[5-10]，參與炎癥和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。本文研究COX-2在白藜蘆醇抗結(jié)腸癌中的作用及機(jī)制，為白藜蘆醇化學(xué)預(yù)防及輔助治療結(jié)腸癌提供理論及實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病例資料 收集我院2015年1月-2015年12月結(jié)直腸腺癌、腺瘤性息肉和“正?！苯Y(jié)腸黏膜標(biāo)本各50例及HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞。

1.2 實驗材料 一抗兔抗人COX-2多克隆抗體、HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞。

1.3 實驗方法 實驗采用免疫組織化學(xué)方法檢測COX-2在結(jié)直腸腺癌、腺瘤性息肉和“正常”結(jié)腸黏膜標(biāo)本、HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞及白藜蘆醇培養(yǎng)的HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)情況。免疫組織化學(xué)試劑一抗COX-2多克隆抗體購自福建邁新公司。采用福建邁新公司的Elivision試劑盒。石蠟切片厚度3微米，60℃烤箱烤片1h；先用梯度二甲苯脫蠟，繼以梯度乙醇水化，再用蒸餾水浸泡5min；用3%過氧化氫室溫孵育10min阻斷內(nèi)源性過氧化酶的活性，再用PBS液沖洗，高壓鍋抗原修復(fù)，最后自然冷卻至室溫。加入二步法Elivision試劑盒中試劑 A，室溫孵育20min，PBS沖洗 3次，每次5min，再加入試劑盒中的試劑B，室溫下孵育30min，PBS沖洗3次，每次5min。在鏡下控制DAB顯色，蒸餾水沖洗終止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化后用自來水沖洗返藍(lán)，脫水，透明，最后用中性樹膠封片，每次均做陽性對照及PBS代替一抗做陰性對照。

免疫組織化學(xué)判斷的標(biāo)準(zhǔn)：定位準(zhǔn)確，呈棕黃色顆粒為陽性，COX-2陽性定位于細(xì)胞漿或細(xì)胞膜， 陽性細(xì)胞小于10%為 （-），11%-25%為 （+），26%-50%為（++），51%-75%為（+++），76%-100%為（++++）。

2 實驗結(jié)果

免疫組織化學(xué)方法檢測結(jié)直腸腺癌、腺瘤性息肉和“正?！苯Y(jié)腸黏膜標(biāo)本中COX-2蛋白的表達(dá)情況(見圖1)：腺癌組陽性35例（陽性率70%）；腺瘤性息肉組陽性10例（陽性率20%）；“正?！苯Y(jié)腸黏膜陽性2例（陽性率4%）；HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞表達(dá)（陽性率70%）；白藜蘆醇培養(yǎng)的HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞（陽性率50%）。

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示環(huán)氧合酶-2（COX-2）在結(jié)腸腺癌中表達(dá)明顯高于腺瘤，但在正常黏膜上皮中幾乎不表達(dá)，HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞表達(dá)高于白藜蘆醇培養(yǎng)的HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞。差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 見圖 1。

圖1 免疫組織化學(xué)結(jié)果

3 討論

結(jié)直腸腺瘤向結(jié)直腸癌的逐級發(fā)展提示，特定的化學(xué)預(yù)防可延緩或防止浸潤性結(jié)直腸癌的發(fā)展。結(jié)直腸腺瘤/結(jié)直腸癌預(yù)防計劃（CAPP2）近期提供的數(shù)據(jù)顯示，在一項隨機(jī)、安慰劑對照試驗中，受試者每天服用600mg阿司匹林并至少持續(xù)2年之后，CRC的發(fā)病率明顯下降60%[4]。該臨床試驗表明，阿司匹林可以防止結(jié)直腸腺瘤及其潛在腫瘤的形成，但長期大劑量服用阿司匹林可能的消化道出血風(fēng)險限制了其作為化學(xué)預(yù)防藥物的使用。因此，在天然藥物有效成份中發(fā)掘預(yù)防和治療結(jié)直腸癌的藥物具有重要的研究價值。

白藜蘆醇為蒽醌萜類化合物，主要來源于蓼科植物虎杖的干燥根莖和根，豆科植物花生的種子，葡萄科植物葡萄果實的皮和籽等。Garvin S等[5]在體內(nèi)實驗研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞凋亡并抑制其血管生成。有資料表明[6]：白藜蘆醇也能促進(jìn)胃腺癌細(xì)胞的凋亡，但其誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制仍有待研究。最新的研究證實：白藜蘆醇與順鉑、奧沙利鉑聯(lián)用可增強(qiáng)后者對結(jié)直腸癌的化療效果，減少耐藥的發(fā)生；通過抑制脂多糖誘導(dǎo)的NF-κB激活，減少結(jié)直腸癌細(xì)胞的炎癥反應(yīng)；抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖與血管生成，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[7-9]。

目前研究發(fā)現(xiàn)，COX-2通過促進(jìn)PGE2的合成，誘導(dǎo)前致癌物的活化、抑制凋亡、促進(jìn)腫瘤新生血管的形成、增加腫瘤細(xì)胞的浸潤與轉(zhuǎn)移[11]。PGE2是一種重要的細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子，發(fā)揮廣泛的與炎癥和癌癥有關(guān)的生物學(xué)效應(yīng)，過表達(dá)的COX-2可促進(jìn)PGE2的合成，進(jìn)而直接刺激有絲分裂，最終誘導(dǎo)成骨細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞的腫瘤發(fā)生[12]。PGE2通過與G蛋白偶聯(lián)的前列腺素受體（E-prostanoid receptors，EP）結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，EP 有四種亞型，即 EP1、EP2、EP3 及 EP4，它們分布于機(jī)體的各種組織和細(xì)胞中，它們與PGE2結(jié)合后被激活，通過與G蛋白偶聯(lián)產(chǎn)生第二信使，將細(xì)胞外的信號傳到細(xì)胞內(nèi)，引起一系列的生理或病理效應(yīng)[13-15]。COX-2/PGE2/EP信號傳導(dǎo)通路在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用，本研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可減少COX-2表達(dá)進(jìn)而顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖，為進(jìn)一步闡明白藜蘆醇抗結(jié)腸癌的具體機(jī)制提供了理論及實驗依據(jù)。