SP-C基因exonⅡ結構基因突變與新生兒呼吸窘迫綜合征的關系

牛銀萍 ，郭淼 ，付朝陽 ，王喆

(1、南陽市第二人民醫(yī)院兒科，河南 南陽473000；2、南陽市第二人民醫(yī)院檢驗科，河南 南陽 473000)

新生兒呼吸窘迫綜合征 （neonatal respiratory distress syndrome，NRDS）是臨床上較為常見的呼吸系統(tǒng)疾病，流行病學研究顯示，NRDS的發(fā)病率可達233～455/1萬人左右，在孕周介于28～32周之間時，NRDS的發(fā)病率可進一步上升[1]。

表面活性物質蛋白C（surfactant protein C，SPC）的功能狀態(tài)或者表達缺失是影響到NRDS發(fā)生的重要因素，蛋白水平的修飾或者空間結構的改變，能夠通過影響到SP-C的合成量及生理功能，促進NRDS的發(fā)生[2]。SP-C基因exonⅡ結構基因突變能夠通過影響到SP-C的表觀遺傳學的改變，影響到肺泡表面凝脂的分泌，降低了SP-C前體成分的卷曲、末端修飾及磷酸化等過程，增加了肺泡擴張過程中肺泡表面張力，促進了肺泡的萎縮[3，4]。部分研究揭示了SP-C蛋白的表達異常對于NRDS的發(fā)生的影響，認為SP-C的表達下降是促進NRDS發(fā)生的重要因素[5]，但對于基因水平的改變研究不足。為了進一步探討SP-C基因exonⅡ結構基因突變與新生兒呼吸窘迫綜合征的關系，本研究選取2014年2月至2017年12月在我院治療的NRDS患兒110例，探討了exonⅡ基因突變與NRDS臨床特征的關系，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年2月至2017年12月在我院治療的NRDS患兒110例（NRDS組），納入標準：⑴符合《實用新生兒學》第4版中的診斷標準；⑵患兒監(jiān)護人知情同意。排除標準：⑴有嚴重先天性疾病、遺傳代謝性疾病、嚴重窒息等；⑵母親孕后期有明確感染史；⑶孕期糖尿病、胎膜早破。同時選取新生兒病房住院未發(fā)生NRDS患兒110例作為對照組，兩組患兒性別、胎齡、出生體重及母親年齡比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準。

表1 兩組患兒一般資料比較

1.2 試劑和方法 離心機minix-6k購自上海精密儀器有限公司，Applied Biosystems ABI 2720購自美國墨塞飛公司，熒光PCR試劑盒Real-Time PCR Reagents&Kits購自美國墨塞飛公司。

1.3 檢測方法 采集患者抗凝血5ml（2.5%枸椽酸鈉溶液抗凝），按照10000r/min的離心速度進行離心分離血清，每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿，加0.2ml氯仿，劇烈搖動30s，室溫 3min，12000×g，4℃離心 15min 得到 RNA。加等體積異丙醇，-20℃，30min，棄上清，加75%乙醇 1ml，振蕩，20μl DEPC 水，室溫放置 5min 使其完全溶解。加入逆轉錄酶5ul，室溫下放置20min后植入37℃水浴鍋中孵育30min，在底物中加入上游引物0.5uM、下游引物0.5uM，RT-PCR反應混合液 5ul，dNTP 稀釋至 20ul， 反應條件：95℃3min、95℃15s、90℃5s，一共 40 個循環(huán)，產物擴增長度為134bp。

1.4 統(tǒng)計學處理 統(tǒng)計分析采用SPSS 19.0軟件，計量資料采用（±s）表示，組間比較使用t檢驗，計數(shù)資料比較使用χ2檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SP-C基因exonⅡ基因突變篩查 SP-C基因exonⅡ基因測序發(fā)現(xiàn)，第115位基因位點發(fā)現(xiàn)雜合突變c.115G＞T，為錯義突變，基因型為G/T（突變型），c.115G＞T突變基因測序序列見圖1。

圖1 SP-C基因exonⅡ的測序圖

2.2 兩組SP-C基因exonⅡ c.115G＞T基因突變分析 NRDS組G/T基因型比例為8.18%，明顯高于對照組，差異比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組SP-C基因exonⅡc.115G＞T基因突變基因型比較

2.3 SP-C基因 exonⅡ c.115G＞T基因突變與NRDS臨床特征關系 G/T患兒胸片Ⅲ～Ⅳ級比例和病死率分別為100.00%和66.67%，明顯高于GG型患兒（P＜0.05）；G/T 和 GG 型患兒性別、胎齡、出生體重、使用機械通氣比例和PS使用3～4劑比例差異比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 SP-C基因exonⅡc.115G＞T基因突變與NRDS臨床特征關系

3 討論

在孕周小于28周的早產兒中，NRDS的發(fā)病率可達65%以上，而在孕周介于28~37周的早產兒中，NRDS的發(fā)病率可達 1.5%~15%左右[6]。NRDS的病情進展，可以導致患者遠期生存預后的惡化，流行病學研究顯示，NRDS的臨床總體治療效果仍然較為局限，糖皮質激素等治療后的病情緩解率不足35%，孕周小于34周的早產兒NRDS治療后病死率仍然可達27%以上[7]。NRDS的發(fā)生呈現(xiàn)出了一定的區(qū)域性差異，提示基因水平的改變可能是影響到NRDS發(fā)生的重要因素[8]?；虻母淖兡軌蛲ㄟ^影響肺泡表面活性物質的合成，導致磷脂成分比例的下降，降低了磷脂單分子層的穩(wěn)定性[9，10]。通過揭示NRDS患者表觀遺傳學或者基因水平改變的結局，能夠為后續(xù)臨床上NRDS的治療、預后評估或者隨訪等提供參考指標。

SP-C基因exonⅡ是SP-C上游轉錄末端的最后一個外顯子，其轉錄活性的改變能夠提高SP-C的合成速度，并穩(wěn)定磷脂及蛋白的比例，提高其對于磷脂細菌表面多糖成分的抵御能力。部分研究認為，SP-C基因exonⅡ能夠提高SP-C蛋白在肺泡表面的擴散能力，降低局部氧化應激障礙等導致的肺泡張力的增加[11]。另外，在敲除了SP-C基因exonⅡ基因的小鼠中，可以發(fā)現(xiàn)顯著的早產子代NRDS的發(fā)生或者成熟子代肺不張及肺功能衰竭的發(fā)生[12]。在人群對照試驗中可以發(fā)現(xiàn)的是，SPC基因exonⅡ基因的異常表達在部分研究中有少量報道，認為SP-C基因exonⅡ的基因點突變或者錯義突變是促進患者SP-C發(fā)生的重要因素，但缺乏SP-C基因exonⅡ點突變與患兒臨床結局的關系研究。

可以發(fā)現(xiàn)的是，第115位基因位點發(fā)現(xiàn)雜合突變c.115G＞T，為點突變，G/T位點的點突變能夠影響到下游SP-C基因的翻譯及轉錄活性，影響到SP-C蛋白的生物學功能，同時在病例組中G/T類型的表型的比例更高，提示G/T位置的點突變或者表型的改變均可能顯著參與到了NRDS的發(fā)病過程中，從機制上考慮G/T位點的點突變或者基因型的改變對于NRDS發(fā)生的影響，考慮可能與下列幾個方面的因素有關[13]：⑴exonⅡc.115G＞T基因突變導致內質網氨基酸轉運過程的異常，影響到了SP-C蛋白的合成速度；⑵exonⅡc.115G＞T基因突變的發(fā)生，能夠通過影響到G/T表型的變化，促進患者體內肺泡表面活性物質的末端磷酸化修飾過程的障礙，導致SP蛋白特別是SP-C蛋白生物學活性的下降。有研究者[14，15]在探討了NRDS患者的體內基因表觀遺傳學的改變后發(fā)現(xiàn)，exonⅡ c.115G＞T基因突變可以增加5%左右的NRDS的發(fā)生率，同時相應位置點突變的發(fā)生能夠導致患者Ⅱ型上皮細胞功能的代償障礙，降低肺泡表面薄膜的穩(wěn)定性。G/T患兒胸片Ⅲ～Ⅳ級比例和病死率明顯高于GG型，差異具有統(tǒng)計學意義，提示不同的exonⅡc.115位置表型的改變能夠顯著影響到NRDS患兒的臨床預后，增加惡性臨床結局的發(fā)生風險，這主要考慮與GT基因型的改變能夠促進下游體內SP-C蛋白的錯誤折疊及四級空間結構的形成，并能夠通過影響到內質網囊泡運輸體的ATP能量利用障礙，導致患者SP-C蛋白的合成后運輸過程異常，肺泡表面活性物質含量及生物學活性明顯下降，肺部實質性病變明顯增強，而病死率也明顯增加。但并未發(fā)現(xiàn)胎齡、出生體重、使用機械通氣比例等與exonⅡc.115的關系，提示exonⅡc.115可能主要影響到NRDS的遠期生存預后。

綜上所述，SP-C基因exonⅡ c.115G＞T基因突變可能與NRDS的發(fā)生具有一定的關系，并與患者的病死率等臨床特征相關。