長(zhǎng)鏈非編碼RNA在乳腺癌中診斷效能的Meta分析研究

王秀珍 ，王丹 ，韓春生 ，姜熙

(1、鄭州市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 鄭州450004；2、鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，河南 鄭州 450052；3、鄭州市第一人民醫(yī)院腫瘤血液科，河南 鄭州450004)

最新癌癥統(tǒng)計(jì)顯示，乳腺癌 （breast cancer，BC）在國(guó)內(nèi)女性中發(fā)病率占所有腫瘤的第一位，死亡率占四位[1]。早期診斷是提高BC患者預(yù)后的重要手段之一。近年研究表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long-noncoding RNA，lncRNA)在BC的臨床診斷中具有很高的價(jià)值和潛在的應(yīng)用前景[2-8]。然而，由于單項(xiàng)研究的各種局限性，研究結(jié)果間存在較大差異性。本研究擬通過綜合定量的Meta分析，系統(tǒng)性評(píng)價(jià)已報(bào)道的lncRNA分子在BC中的綜合診斷效能，為后期更好地研究lncRNA在BC中發(fā)揮的作用提供循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 文獻(xiàn)檢索 Meta分析按“系統(tǒng)評(píng)價(jià)和薈萃分析優(yōu)先報(bào)告的條目”（PRISMA 聲明，2009版）進(jìn)行[9]。系統(tǒng)性檢索 PubMed、Web of Science、EBSCO、知網(wǎng)和萬方數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)中英文文獻(xiàn)。主要檢索詞包括：“乳腺癌/乳腺腫瘤/breast carcinoma/breast cancer/breast tumor/breast neoplasm/tumor of breast”、 “長(zhǎng)鏈非編碼RNA/long non-coding RNA/lncRNA”、“診斷/敏感性/特異度/AUC/ROC/曲線下面積/sensitivity/specificity/diagnosis/AUC/area under curve”等。

1.2 研究的納入與排除 納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴文獻(xiàn)內(nèi)容為lncRNA在BC中診斷的應(yīng)用或評(píng)價(jià)；⑵研究需提供足夠的診斷指標(biāo)滿足資料提取和統(tǒng)計(jì)分析；⑶研究中對(duì)照組的類型明確，為健康者或乳腺良性疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴研究的對(duì)照組類型界定不明確或?qū)φ绽龜?shù)未知；⑵提取的數(shù)據(jù)不能滿足生成2×2四格表；⑶基礎(chǔ)研究、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、綜述、Meta分析、讀者來信、述評(píng)、會(huì)議摘要等。

1.3 數(shù)據(jù)提取和文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià) 資料提取由兩位作者獨(dú)立完成。提取內(nèi)容主要包括：論文作者、發(fā)表日期、研究人群、病例數(shù)、對(duì)照例數(shù)及類型、樣本類型、檢測(cè)方法、敏感度、特異度、AUC、cut-off值等。通過“診斷性研究的質(zhì)量表（QUADAS）”評(píng)價(jià)納入研究的質(zhì)量[10]，共含有14個(gè)條目，每個(gè)條目可評(píng)價(jià)為“是（1 分）”，“否（0 分）”或“未知（0 分）”。資料提取和文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)中存在的分歧或不一致意見通過共同討論解決。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 通過Meta-disc 14.0和Stata 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用雙變量Meta分析模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)量的合并，包括敏感度 （SEN）、特異度（SPE）、診斷的優(yōu)勢(shì)比（DOR）、陽性似然比（PLR）、陰性似然比（NLR）、合并的ROC曲線及曲線下面積（AUC）。通過Spearman相關(guān)系數(shù)評(píng)估閾值效應(yīng)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；通過Cochran’Q檢驗(yàn)和I2檢驗(yàn)評(píng)估非閾值效應(yīng)，顯著差異設(shè)定為P＜0.01或 I2＞50%[11]。 研究間存在顯著異質(zhì)性時(shí)，選用隨機(jī)效應(yīng)模型合并統(tǒng)計(jì)量。通過敏感性分析和Meta回歸探討異質(zhì)性來源[12]。論文發(fā)表偏移的評(píng)估采用Deek’s漏斗圖檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 文獻(xiàn)檢索結(jié)果和研究特征 如圖1所示，通過系統(tǒng)性檢索在線數(shù)據(jù)庫，排除重復(fù)文獻(xiàn)后共得到698篇文章。根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，最終納入7篇文獻(xiàn)（含有11個(gè)獨(dú)立組間研究）。納入的7項(xiàng)研究發(fā)表于2015年-2017年，均來自中國(guó)，共包括BC患者512例，非BC對(duì)照者446例；樣本類型包括血清和血漿；LncRNA表達(dá)譜包括H19、HOTAIR、MALAT1、ANRIL、HIFA-AS2、UCA1 和 RP11-445H22.4共7種lncRNA。LncRNA的檢測(cè)方法均為RT-qPCR，內(nèi)參照基因包括GAPDH、U6和βactin。

2.2 質(zhì)量評(píng)價(jià)和異質(zhì)性分析 通過QUADAS量表對(duì)納入7項(xiàng)研究的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果如圖2所示：所有7篇文獻(xiàn)存在的偏移及風(fēng)險(xiǎn)整體較低，提示納入研究的質(zhì)量較可靠。異質(zhì)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，整體合并效應(yīng)量的Spearman相關(guān)系數(shù)P=0.018，提示研究存在由閾值效應(yīng)引起的異質(zhì)性。同時(shí)，Cochran’Q和I2檢驗(yàn)顯示，整體合并效應(yīng)量的P=0.2334，I2=22.1%，提示研究不存在非閾值效應(yīng)引起的異質(zhì)性。

2.3 合并診斷效能 LncRNA檢測(cè)診斷BC整體合并 的 SEN、SPE、PLR、NLR 和 DOR 分 別 為 0.75(95%CI：0.72～0.78)、0.80(95%CI：0.77～0.83)、3.63(95%CI：2.9～4.53)、0.32(95%CI：0.27～0.38)和 12.93(95%CI：9.38～17.82)，AUC 為 0.85（SROC 曲線見圖3）。

表1 納入文獻(xiàn)的資料特征

圖1 文獻(xiàn)的納入和排除流程

圖2 納入文獻(xiàn)的QUADAS質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.4 亞組分析 亞組分析顯示，基于血漿的lncRNA檢測(cè)的診斷效能優(yōu)于血清，SEN、SPE和AUC分別為 0.71(95%CI：0.66~0.77)vs 0.78(95%CI：0.74~0.82)、0.88(95%CI：0.83~0.91)vs 0.76(95%CI：0.70~0.81)和0.86 vs 0.84。此外，單項(xiàng)lncRNA檢測(cè)中，以lncRNA-HORTAIR檢測(cè)診斷的AUC最高（0.86），均高于 lncRNA-MALAT1（AUC=0.81）和-H19（AUC=0.80）。

圖3 LncRNA用于BC診斷的SROC曲線及AUC

圖4 Deek’s漏斗圖檢驗(yàn)評(píng)估研究間的發(fā)表偏倚

2.5 敏感性分析和Meta回歸分析 敏感性分析顯示，所有納入研究分布均在允許限范圍內(nèi)，提示研究間的同質(zhì)性較好。Meta回歸分析進(jìn)一步對(duì)研究質(zhì)量、標(biāo)本類型、參考基因、cut-off值設(shè)定、病例數(shù)和對(duì)照組數(shù)等因素進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述因素中，不同的cut-off值設(shè)定（P=0.0466）和對(duì)照組樣本例數(shù)（P=0.0323）可能是研究異質(zhì)性的來源之一。2.6 發(fā)表偏移 整體合并效應(yīng)量的Deek’s漏斗圖分析顯示，所有研究基本呈對(duì)稱分布，其斜率對(duì)應(yīng)P值為0.063，提示研究間不存在發(fā)表偏移（圖4）。

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。早期診斷對(duì)BC的治療至關(guān)重要。研究顯示，早期BC患者治療的5年生存率可達(dá)90%以上，充分說明早期診斷是BC患者獲得較好預(yù)后的關(guān)鍵[13]。盡管如此，腫瘤的早期診斷對(duì)仍是當(dāng)今面臨的一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)，臨床仍缺少高靈敏度和特異度的診斷指標(biāo)。LncRNA屬于非編碼RNA家族的主要類型之一。近年來，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)的lncRNA分子可作為BC診斷的較好指標(biāo)[2-8]。

本研究顯示，7種lncRNA表達(dá)譜對(duì)BC具有較高的診斷價(jià)值，其診斷的SEN、SPE分別為0.75和0.80，相應(yīng)曲線下面積（AUC）達(dá)0.85。診斷的比值比（DOR，即真陽性與假陽性之比）是評(píng)價(jià)檢驗(yàn)效能的另一項(xiàng)重要指標(biāo)，當(dāng)DOR的值小于1時(shí)，提示一項(xiàng)檢測(cè)的診斷效能很低[14]。本研究中，lncRNA用于診斷BC的DOR為12.93，提示該檢測(cè)具有很高的診斷效能。另外，lncRNA用于診斷BC的陽性似然比為3.63，這說明BC患者7種lncRNA分子表達(dá)檢測(cè)陽性的概率約是對(duì)照組的4倍。合并的陰性似然比為0.32，說明在lncRNA檢測(cè)的陰性結(jié)果中，僅存在32%的假陰性。以上數(shù)據(jù)充分證明lncRNA表達(dá)檢測(cè)可很好用于BC的診斷。

本研究進(jìn)一步根據(jù)樣本類型和lncRNA單項(xiàng)檢測(cè)等因素進(jìn)行亞組分析?；跇颖绢愋偷姆治鼋Y(jié)果顯示，以血漿為檢測(cè)基質(zhì)的lncRNA檢測(cè)在BC中的診斷效能優(yōu)于血清，其SEN、SPE、PLR、NLR 和 DOR 分 別 為 0.71、0.88、5.25、0.34 和16.97，這提示血漿可作為檢測(cè)BC中l(wèi)ncRNA的較合適的樣本類型。盡管如此，因劃分亞組分后其樣本量減小，異質(zhì)性增大，在一定程度上增加了合并結(jié)果的不準(zhǔn)性。目前也有研究證實(shí)BC患者尿液中的lncRNA也對(duì)該疾病具有很好的診斷價(jià)值[8]。因此，血漿能否作為BC患者lncRNA檢測(cè)的較為合適樣本類型，有待進(jìn)一步被證實(shí)。另外，基于單項(xiàng)lncRNA檢測(cè)的結(jié)果中以lncRNA-HORTAIR檢測(cè)的診斷效能最高，AUC達(dá)0.86，高于lncRNA-H19和-MALAT1。目前已有多項(xiàng)關(guān)于lncRNA-HORTAIR，-H19和-MALAT1在腫瘤診斷、預(yù)后中的報(bào)道，其功能因不同的腫瘤類型而異[15-17]，因此有必要對(duì)這些lncRNA分子在不同腫瘤中發(fā)揮的作用進(jìn)行深入研究，為臨床開發(fā)新的腫瘤診斷、預(yù)后指標(biāo)及藥物靶點(diǎn)提供依據(jù)。

研究間的異質(zhì)性是所有meta分析實(shí)施過程中面臨的一個(gè)共性問題[18]。Spearman相關(guān)系數(shù)分析顯示，本研究產(chǎn)生的異質(zhì)性主要來源于閾值效應(yīng)。閾值效應(yīng)主要由不同研究設(shè)置的不同界值或cut-off值引起[19]。本研究納入的所有文獻(xiàn)中用于檢測(cè)lncRNA的cut-off值均不相同，且有些研究未提及cut-off值的設(shè)定，故本研究未設(shè)置亞組分析評(píng)估不同cut-off值設(shè)置對(duì)合并統(tǒng)計(jì)量的影響，因此可能導(dǎo)致整體合并效應(yīng)的異質(zhì)性增大。本研究通過Meta回歸進(jìn)一步對(duì)研究質(zhì)量、標(biāo)本類型、參考基因、cut-off值設(shè)定、病例數(shù)和對(duì)照組數(shù)等因素進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同的cut-off值設(shè)定是研究異質(zhì)性的來源之一（P=0.0466），從而進(jìn)一步佐證了Spearman相關(guān)系數(shù)分析的結(jié)果。另外，納入的對(duì)照組例數(shù)不均一也是研究異質(zhì)性的來源之一。盡管如此，Cochran’Q和I2檢驗(yàn)顯示本研究整體合并的效應(yīng)量及亞組分析中不存在由非閾值引起的異質(zhì)性，同時(shí)敏感性分析未檢測(cè)到離群研究，提示研究間結(jié)果的同質(zhì)性較好，研究結(jié)論整體相對(duì)穩(wěn)定、可靠。

本研究證實(shí)，lncRNA的表達(dá)檢測(cè)對(duì)BC的診斷有很高的應(yīng)用價(jià)值，可作為BC臨床診斷的輔助指標(biāo)。然而，本研究存在納入樣本例數(shù)較少及研究的異質(zhì)性大等諸多缺陷，在一定程度上降低了研究結(jié)論的可靠性。后期有必要對(duì)單項(xiàng)lncRNA在BC中的應(yīng)用作深入探討。