肺結(jié)核病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中環(huán)狀RNA circRNF10的表達(dá)及意義

聞芳 ，姚芳苡 ，黃自坤 ，彭亦平 ，傅穎媛

(1、南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，江西 南昌 330006；2、江西省血液中心檢驗(yàn)科，江西 南昌 330052；3、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌 330006；4、江西省胸科醫(yī)院內(nèi)二科，江西 南昌 330006)

結(jié)核病是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的感染性疾病。我國(guó)結(jié)核病患者人數(shù)居全球第三位，被WHO列為全球22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一[1]。結(jié)核病的早期診斷及治療對(duì)結(jié)核的防治有至關(guān)重要的意義。環(huán)狀 RNA（circular RNA，circRNA）是新近發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)內(nèi)源性非編碼RNA，其呈環(huán)狀而得名[2，3]。近年研究表明環(huán)狀RNA不受RNA外切酶影響，表達(dá)更穩(wěn)定，大量存在于真核細(xì)胞中，具有一定的組織、時(shí)序和疾病特異性，在轉(zhuǎn)錄、翻譯以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多種層面上影響基因的表達(dá)和功能，廣泛參與機(jī)體各種生理和病理過(guò)程[4-6]。同時(shí)，環(huán)狀RNA的異常表達(dá)與包括惡性腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、自身免疫病在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7，8]。隨著環(huán)狀RNA研究的進(jìn)一步深入，越來(lái)越多的證據(jù)表明環(huán)狀RNA表達(dá)譜會(huì)隨著疾病進(jìn)程發(fā)生變化，同時(shí)，環(huán)狀RNA能夠穩(wěn)定存在外周血中，其檢測(cè)對(duì)于疾病診斷判斷預(yù)后具有重要意義[9]。在前期工作中，課題組采用高通量基因芯片篩查發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC） 中 circRNF10（又名hsa_環(huán)狀RNA_005086）表達(dá)顯著升高[10]，提示其可能作為結(jié)核病診斷標(biāo)志物。因此，本研究旨在檢測(cè)circRNF10在肺結(jié)核病患者PBMC中的表達(dá)水平，探討其在肺結(jié)核病診斷、療效監(jiān)測(cè)中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 病例資料 ⑴肺結(jié)核組：收集2016年3月至2017年3月江西省胸科醫(yī)院結(jié)核科收治的初治活動(dòng)性肺結(jié)核患者90例，男58例，女32例，平均年齡（40.5±12.4）歲。肺結(jié)核的診斷依據(jù)按照2005年中華醫(yī)學(xué)會(huì)《臨床診療手冊(cè)（結(jié)核病分冊(cè)）》診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]，并除外心、肝、腎等臟器并發(fā)癥。90例肺結(jié)核患者依據(jù)肺部病灶所占的范圍、肺部有無(wú)空洞進(jìn)行分組，經(jīng)胸部CT診斷，按照肺部有無(wú)空洞分為無(wú)空洞組57例和有空洞組33例；據(jù)影像學(xué)肺部病灶所占的范圍分為＜2個(gè)肺野組51例，≥2個(gè)肺野組39例。所有肺結(jié)核患者均在抗結(jié)核治療前采血。肺結(jié)核患者給予規(guī)范化治療：異煙肼+利福平+乙胺丁醇+吡嗪酰胺2個(gè)月，異煙肼+利福平4個(gè)月。20例肺結(jié)核患者均在規(guī)范化抗結(jié)核治療3月和6月后采血。⑵肺炎組：收集同期南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院肺炎患者40例，其中男26例，女14例，平均年齡（37.9±11.8）歲。入組病例均未接受過(guò)放、化療及其他免疫治療、無(wú)結(jié)核病接觸史。⑶肺癌組：收集同期南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院肺癌患者40例，其中男27例，女13例，平均年齡（45.5±9.7）歲。入組病例均經(jīng)過(guò)病理診斷確診，未接受過(guò)放、化療及其他免疫治療、無(wú)結(jié)核病接觸史。⑷健康對(duì)照組：收集同期南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院進(jìn)行體檢的健康人70例，其中男46例，女24例，平均年齡（38.7±11.6）歲。入組對(duì)象胸部影像學(xué)檢查均正常，無(wú)結(jié)核病接觸史。

所有對(duì)象均排除合并高血壓、糖尿病、慢性阻塞性肺疾病、自身免疫性疾病及服用免疫抑制藥物的患者；排除HBV、HCV、HIV感染者或 （和）AIDS患者；排除孕婦或哺乳期婦女。本研究經(jīng)南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，標(biāo)本的收取及患者信息的使用已獲得患者及家屬知情同意，所有患者及志愿者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑與儀器 逆轉(zhuǎn)錄試劑及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑購(gòu)自日本TaKaRa公司；Trizol試劑及熒光定量PCR引物購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Ficoll淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自美國(guó)sigma公司；熒光定量PCR儀美國(guó)ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集及處理 采集研究對(duì)象空腹靜脈血，EDTA-K2抗凝，按常規(guī)方法用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液提取PBMC。

1.3.2 總RNA提取及cDNA合成 向PBMC細(xì)胞沉淀物中加入1ml Trizol試劑，按Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取PBMC樣本總RNA，DEPC處理過(guò)的蒸餾水溶解。取1μl RNA，按照說(shuō)明書(shū)，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用SYBR法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，檢測(cè)步驟及反應(yīng)條件參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。circRNF10上游引物為：5'-ACCTGCTCCTCTGATTCTGCT-3'，下游引物為 5'-GGTGAGTGGCAAGTGAGAGA-3'；內(nèi)參 β-actin 基因上游引物為5'-CATGTACGTTGCTATCCAGGG-3'，下游引物為5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'。 反應(yīng)體系為 20μl，即：1×SYBR Green I mastermix、0.5μmol/L 特異前向引物、0.5μmol/L 特異反向引物、1μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃10min，95℃ 15s，60℃ 1min，72℃ 30s，40 循環(huán)，通過(guò)熔解曲線(xiàn)檢測(cè)PCR產(chǎn)物的特異性。熒光定量PCR檢測(cè)使用ABI 7500儀器進(jìn)行。每孔均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，取平均Ct值做為該樣本最后Ct值，以βactin基因作為內(nèi)參基因，計(jì)算2-△△Ct值反映circRNF10表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。以Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)（K-S檢驗(yàn)）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間的比較采用單因素方差分析。采用GraphPad Prism 5軟件繪制受試者工作特征曲線(xiàn)（receiver operator characteristic curve，ROC）， 并計(jì)算曲線(xiàn)下面積 （area under of ROC curve，AUC）評(píng)估PBMC中circRNF10的檢驗(yàn)效能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同分組circRNF10表達(dá)水平比較分析 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PBMC中circRNF10在各亞組中表達(dá)情況[肺結(jié)核組（2.11±1.13）；健康對(duì)照組（1.00±0.38）；肺炎組（1.14±0.57）；肺癌組（0.93±0.31），發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核患者circRNF10表達(dá)相比健康對(duì)照組、肺炎組和肺癌組表達(dá)高（F=38.15，P＜0.01；圖1），其余3組PBMC中circRNF10表達(dá)無(wú)明顯差異（F=2.75，P=0.07）。

圖1 不同分組中PBMC中circRNF10表達(dá)水平的散點(diǎn)圖

2.2 circRNF10表達(dá)與肺結(jié)核病灶范圍及肺部空洞的關(guān)系 根據(jù)肺結(jié)核患者肺部空洞的情況分為無(wú)空洞組和有空洞組（圖2A），檢測(cè)結(jié)果顯示，有空洞組 PBMC 中 circRNF10 表達(dá)（3.00±1.13）顯著高于無(wú)空洞組 （1.60±0.76），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t=7.02，P＜0.01）。根據(jù)影像學(xué)肺部病灶所占的范圍分為＜2個(gè)肺野組和≥2個(gè)肺野組（圖2B），檢測(cè)結(jié)果顯示，≥2個(gè)肺野組 PBMC中 circRNF10表達(dá)（2.68±1.18）顯著高于＜2 個(gè)肺野組（1.67±0.87），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.68，P＜0.01）。

圖2 肺部不同病灶范圍及肺部空洞組患者PBMC中circRNF10表達(dá)水平的散點(diǎn)圖

2.3 抗結(jié)核治療前后PBMC中circRNF10表達(dá)變化 我們對(duì)已收治的20例初治肺結(jié)核患者均進(jìn)行了6個(gè)月的隨訪(fǎng)，檢測(cè)患者接受抗結(jié)核治療3個(gè)月及6個(gè)月后PBMC中circRNF10的表達(dá)變化。隨訪(fǎng)結(jié)果顯示，隨訪(fǎng)患者抗結(jié)核治療效果良好。熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，與治療前circRNF10表達(dá)水平 （2.31±0.72）相比，治療3月（1.27±0.41）（t=5.62，P＜0.01）、6 月 （0.94±0.38）（t=7.54，P＜0.01）circRNF10 的表達(dá)水平均顯著下降。與治療3月組相比，治療6月組circRNF10的表達(dá)水平顯著降低（t=2.63，P=0.01）。此外，接受治療6月組PBMC中circRNF10水平與健康對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.69，P=0.49）。

圖3 肺結(jié)核患者抗結(jié)核治療前后PBMC中circRNF10表達(dá)水平的散點(diǎn)圖

2.4 circRNF10對(duì)結(jié)核病的診斷效能 為了評(píng)估PBMC中circRNF10的診斷效能，我們繪制了肺結(jié)核患者區(qū)別于健康對(duì)照組及肺炎、肺癌的ROC曲線(xiàn)。結(jié)果如圖4所示，circRNF10在用于區(qū)別肺結(jié)核患者與健康對(duì)照者（圖4A）、肺炎患者（圖4B）及肺癌患者 （圖 4C）的 AUC分別為 0.837、0.782、0.861。以1.37為臨界值，circRNF10鑒別肺結(jié)核患者與健康對(duì)照的敏感度和特異度分別為88.57%和73.33%；以1.22為臨界值，circRNF10鑒別肺結(jié)核患者與肺炎患者的敏感度和特異度分別為70.00%和80.00%；以1.26為臨界值，circRNF10鑒別肺結(jié)核患者與肺癌患者的敏感度和特異度分別為87.50%和77.78%。

圖4 circRNF10診斷肺結(jié)核病的ROC曲線(xiàn)

3 討論

環(huán)狀RNA（circRNA）是區(qū)別于傳統(tǒng)線(xiàn)性RNA的一類(lèi)新型非編碼RNA分子，通常由前體mRNA經(jīng)可變剪切產(chǎn)生，具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，也是目前RNA領(lǐng)域最新的研究熱點(diǎn)分子[12]。盡管目前大多數(shù)環(huán)狀RNA的生物學(xué)功能尚不明確，但不少研究表明，環(huán)狀RNA分子因富含微小RNA（microRNA，miRNA）結(jié)合位點(diǎn)，在細(xì)胞中起到一種類(lèi)似于“miRNA海綿”的作用，它可以解除miRNA對(duì)其靶基因的抑制，從而提高靶基因表達(dá)水平[13]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)部分環(huán)狀RNA可通過(guò)與RNA聚合酶Ⅱ相結(jié)合從而促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄[14]，或充當(dāng)RNA結(jié)合蛋白海綿，調(diào)控有關(guān)蛋白質(zhì)的活性[15]，在人體多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

近年研究發(fā)現(xiàn)一些特定的環(huán)狀RNA具有疾病和組織特異性，人血清、血漿、唾液及其他體液中均有環(huán)狀RNA表達(dá)，而且循環(huán)環(huán)狀RNA具有良好的穩(wěn)定性，這種穩(wěn)定性也為其作為疾病診斷的標(biāo)志物奠定了基礎(chǔ)[16]。如，Zhao等[17]發(fā)現(xiàn)了外周血hsa_circ_0124644可作為冠心病的一個(gè)診斷性生物標(biāo)志物。Teng等[18]發(fā)現(xiàn)了外周血hsa_circ_0021001可作為篩查顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的新型生物標(biāo)志物。此外，近期Ouyang等[19]研究發(fā)現(xiàn)PBMC 中 hsa_circ_104871，hsa_circ_003524，hsa_circ_101873和hsa_circ_103047可作為類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷的標(biāo)志物。目前環(huán)狀RNA在結(jié)核病中研究尚剛起步，相關(guān)研究鮮有報(bào)道。

本課題組前期通過(guò)高通量芯片技術(shù)篩選發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照者比較，肺結(jié)核患者PBMC中環(huán)狀RNA表達(dá)譜發(fā)生部分變化[10]。本實(shí)驗(yàn)中，我們以變化顯著的circRNF10為研究對(duì)象，探討其對(duì)肺結(jié)核的診斷價(jià)值。結(jié)果顯示，相比于肺炎、肺癌患者及健康人群，肺結(jié)核患者PBMC中circRNF10的表達(dá)量升高。AUC結(jié)果顯示circRNF10能區(qū)別肺結(jié)核患者與健康人及肺炎、肺癌患者，可作為診斷肺結(jié)核的有效標(biāo)識(shí)。進(jìn)一步據(jù)肺部病灶范圍、肺部空洞不同臨床表型進(jìn)行分組分析，結(jié)果顯示，肺部有空洞結(jié)核患者PBMC中circRNF10水平顯著高于無(wú)空洞患者，肺部病灶范圍大的患者顯著高于病變范圍小患者。提示PBMC中circRNF10水平在一定程度上或可反映肺結(jié)核炎癥組織損傷的嚴(yán)重程度。

本研究對(duì)部分初治肺結(jié)核患者隨訪(fǎng)6個(gè)月，期間患者嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)抗結(jié)核治療方案接受治療，均未接受放化療及激素治療等其他治療，且患者抗結(jié)核治療效果良好。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與未接受治療組患者相比，circRNF10在抗結(jié)核治療3個(gè)月時(shí)表達(dá)明顯下降，且隨著治療時(shí)間延長(zhǎng)，circRNF10表達(dá)量逐漸降低。當(dāng)接受6個(gè)月抗結(jié)核治療后，隨訪(fǎng)患者中circRNF10表達(dá)量已下降至正常水平，與健康對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。需要指出的是，由于本研究收集樣本的時(shí)間較短，在90例肺結(jié)核患者中僅有20例患者均在規(guī)范化抗結(jié)核治療3月和6月后完成采血。由于病例數(shù)較少，在其用于抗結(jié)核治療效果評(píng)估時(shí)易出現(xiàn)誤差。在下一步研究中，我們將在擴(kuò)大樣本量的同時(shí)對(duì)肺結(jié)核患者進(jìn)行定期隨訪(fǎng)，以進(jìn)一步分析PBMC中circRNF10的表達(dá)水平在肺結(jié)核患者抗結(jié)核療效評(píng)價(jià)中的意義。

綜上所述，circRNF10在肺結(jié)核患者PBMC中表達(dá)升高，有望成為結(jié)核病快速診斷的潛在生物標(biāo)志物，同時(shí)或可用于抗結(jié)核治療效果評(píng)估，但是circRNF10的調(diào)控機(jī)制仍未清楚，我們希望通過(guò)更多研究來(lái)了解circRNF10在結(jié)核病中是如何發(fā)揮作用的。