結(jié)腸炎小鼠模型的病理機(jī)制研究

楊 敏 安 國(guó) 趙 威 馬媛媛

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院干部綜合科， 北京 100038；2.北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室，北京 100142;3.北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所細(xì)胞生物室，北京 100142;4.北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所胸外二科，北京 100142； 5.惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100142)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis， UC)是一種慢性非特異性結(jié)腸炎性反應(yīng)，病變主要位于結(jié)腸的黏膜層，臨床表現(xiàn)為持續(xù)或反復(fù)發(fā)作的腹瀉、黏液膿血樣便伴腹痛，該病病程長(zhǎng)，治愈難度大，且與結(jié)腸癌關(guān)系密切，屬于消化系統(tǒng)難治疾病之一[1]。目前研究[2]顯示，炎性細(xì)胞因子失衡是UC發(fā)病的重要機(jī)制，這些炎性因子包括腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-1、IL-12、IL-23等。右旋葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate，DSS)誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型是研究UC較為成熟的動(dòng)物模型之一[3-5]。然而，小鼠模型建成后，免疫活力如何，免疫因子的浸潤(rùn)情況以及相關(guān)機(jī)制還并未清楚。本研究將以DSS建立小鼠結(jié)腸炎，進(jìn)而探討UC的病理、免疫機(jī)制，分析炎性因子在潰瘍性結(jié)腸炎中發(fā)揮的作用，為探究結(jié)腸炎的分子機(jī)制及藥物治療打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 DSS小鼠結(jié)腸炎動(dòng)物模型的建立

8周大的C57BL/6J清潔級(jí)小鼠24只[北京華阜康生物科技股份有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK (京)2006-0015]，飼養(yǎng)條件SPF級(jí)(屏障環(huán)境)，體質(zhì)量 20～25 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量應(yīng)符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求，采用數(shù)字表法隨機(jī)分為4組，每組6只。第1組小鼠為DSS陰性對(duì)照組，正常飼養(yǎng)5 d，記為DSS(-)組；第2組小鼠自由飲水4 d后，喂飼3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的DSS水溶液1 d，記為DSS(1)組；第3組小鼠自由飲水2 d后，喂飼3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的DSS水溶液3 d，記為DSS(3)組；第4組小鼠喂飼3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的DSS水溶液5 d，記為DSS(5)組。每日監(jiān)測(cè)動(dòng)物飲水量、體質(zhì)量變化以及一般健康狀況。5 d后處死小鼠，取結(jié)腸組織，液氮凍存，并取部分組織進(jìn)行甲醛固定和石蠟包埋。石蠟包埋組織HE染色后進(jìn)行組織學(xué)觀察。實(shí)驗(yàn)小鼠經(jīng)過(guò)北京市腫瘤醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：2016KT93)。

1.2 組織化學(xué)染色

取小鼠盲腸端到直腸之間的結(jié)腸，分成遠(yuǎn)端、中段和近端3部分。中段的結(jié)腸進(jìn)行組織化學(xué)分析。石蠟包埋的組織進(jìn)行甲苯胺藍(lán)(Sigma公司，美國(guó))染色，以評(píng)估DSS的吸收情況。冰凍切片(10 mm厚)進(jìn)行髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)染色，以觀察中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)

RNeasy Mini Kit (Qiagan公司，德國(guó))提取結(jié)腸組織全細(xì)胞RNA。采用Superscript Ⅲ(Invitrogen公司，美國(guó))合成cDNA。SYBR Premix Ex TaqTM II kit (Roche公司，德國(guó))進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)步驟參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)采用的設(shè)備為L(zhǎng)ight-Cycler?480 Real-Time PCR System(Roche公司， 德國(guó))。選取β-actin為內(nèi)參基因，采用相對(duì)Ct方法檢測(cè)TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6、趨化因子配體-1[chemokine (C-X-C motif) ligand 1，CXCL-1]、CXCL-2和環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase， COX-2)mRNA的表達(dá)水平?；蛞镄蛄幸?jiàn)表1。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

表1 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)驗(yàn)使用的引物Tab.1 Primers used for real-time quantitative PCR

PCR：polymerase chain reaction.

2 結(jié)果

2.1 DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎模型體質(zhì)量、結(jié)腸長(zhǎng)度及脾的變化情況

DSS(-)組小鼠飼養(yǎng)5 d后體質(zhì)量略有增加。DSS模型組小鼠隨著飲用DSS水時(shí)間的增長(zhǎng)，體質(zhì)量逐漸降低， DSS(5)組小鼠體質(zhì)量降低最為明顯，與DSS(-)組小鼠的體質(zhì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1A)。結(jié)腸長(zhǎng)度的測(cè)量結(jié)果表明，DSS(5)組的小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度比DSS(-)組顯著縮短，DSS(3)組小鼠的結(jié)腸長(zhǎng)度也比DSS(-)組有所縮短(圖1B，C)。DSS造模小鼠在飲用DSS水溶液3 d和5 d后出現(xiàn)了顯著的脾增大(圖1D，E)。以上結(jié)果提示，對(duì)小鼠進(jìn)行DSS水飼養(yǎng)5 d后，小鼠的體質(zhì)量減輕，結(jié)腸長(zhǎng)度縮短，脾增大，小鼠結(jié)腸炎模型建成。

2.2 DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎模型組織學(xué)改變

小鼠結(jié)腸組織進(jìn)行HE染色分析顯示，DSS(3)組小鼠的結(jié)腸上皮細(xì)胞被明顯破壞，DSS(5) 組小鼠進(jìn)展為嚴(yán)重的腸黏膜潰瘍(圖2A)。MPO染色結(jié)果顯示，DSS(5)組小鼠的腸黏膜上皮出現(xiàn)了廣泛的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)DSS(5)組MPO活性與DSS(-)組相比有顯著升高(圖2B、C)。

圖1 DSS小鼠結(jié)腸炎模型體質(zhì)量和結(jié)腸長(zhǎng)度變化Fig.1 Body weight and length of colon in DSS mice colitis model

A： Slightly lower body weight in DSS(+) mice than in DSS(-) mice， significantly decreased body weight in the DSS(5) group;B： Shorter length of colon in DSS(+) mice than in DSS(-) mice;C： Randomly pick up and compare colon length from the four groups;D： Randomly pick up and compare spleen weight from the four groups;E： Spleen weight in four group mice. Significantly increased weight of spleen in DSS(3) group and DSS(5) group， compared to DSS(-) group(**P<0.01，***P<0.001)；DSS：dextran sodium sulfate.

圖2 HE染色及MPO染色Fig.2 HE staining and MPO staining

A： HE staining(200×);B： MPO staining(200×);C： MPO activity analysis;**P<0.01vsDSS(-) group；DSS：dextran sodium sulfate；HE: hematoxylin-eosin；MPO：myeloperoxidase.

2.3 DSS吸收情況

采用甲苯胺藍(lán)染色法，觀察腸黏膜細(xì)胞對(duì)DSS的吸收情況。染色結(jié)果表明，DSS(5)組小鼠的腸黏膜細(xì)胞對(duì)DSS有明顯的吸收(圖3)。

2.4 DSS小鼠結(jié)腸炎模型中炎性因子表達(dá)升高

小鼠飲用DSS水溶液5 d后，結(jié)腸組織中TNF-α表達(dá)顯著升高，IL-1α、IL-1β及IL-6的表達(dá)量也比DSS(-)組小鼠有顯著升高。此外，CXCL-1、CXCL-2以及COX-2的表達(dá)也顯著升高(圖4)。

圖3 甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果顯示，DSS(5)組的小鼠腸黏膜細(xì)胞對(duì)DSS有明顯的吸收Fig.3 Toluidine blue staining results indicates significant absorption of intestinal mucosa cells in DSS(5) group

DSS：dextran sodium sulfate.

圖4 炎性反應(yīng)因子mRNA在DSS(-) 組和DSS(5)組小鼠結(jié)腸組織中的表達(dá)量Fig.4 Inflammatory factor mRNA expression quantity in colon tissue of DSS(-) group and DSS(5) group mice

*P<0.05,**P<0.01vsDSS(-) group；DSS：dextran sodium sulfate；TNF-α：tumor necrosis factor-α；CXCL-1：chemokine(C-X-C motif) ligand 1；IL：interleukin；COX-2：cyclooxygenase-2.

3 討論

UC發(fā)病機(jī)制至今尚不明確。DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型與人潰瘍性結(jié)腸炎癥狀相似，且該模型重復(fù)性好[5-6]。本研究以DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎為動(dòng)物模型，研究在UC發(fā)生的炎性反應(yīng)，進(jìn)而探討炎性反應(yīng)相關(guān)因子在結(jié)腸炎發(fā)展中的作用。

本研究中將小鼠分為4組，動(dòng)態(tài)觀察小鼠在飲用DSS水溶液不同時(shí)間的病理改變。與文獻(xiàn)[3]報(bào)道相一致，隨著飲用DSS水溶液時(shí)間的增加，小鼠結(jié)腸黏膜受損傷的程度加重，小鼠連續(xù)自由飲用DSS水溶液5 d即可形成穩(wěn)定的結(jié)腸炎模型。張忠等[7]比較了DSS、乙酸以及幽門(mén)螺桿菌3種方法構(gòu)建小鼠UC模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DSS誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的動(dòng)物模型是研究UC發(fā)病機(jī)制和藥物療效較理想的工具。

進(jìn)而，對(duì)DSS小鼠的腸黏膜組織進(jìn)行HE染色，可以看到飲用DSS水溶液5 d組的小鼠腸黏膜受到了嚴(yán)重破壞，出現(xiàn)腸潰瘍的癥狀，對(duì)其MPO染色可觀察到廣泛的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，表明DSS誘導(dǎo)出現(xiàn)了炎性反應(yīng)。筆者又進(jìn)一步進(jìn)行了甲苯胺藍(lán)染色，證實(shí)了DSS能直接被吸收進(jìn)入腸黏膜上皮細(xì)胞并對(duì)腸黏膜屏障造成破壞。結(jié)腸黏膜的病理性損傷，在UC發(fā)病的機(jī)制中起重要作用。研究[8-9]表明，DSS不僅能直接破壞腸黏膜細(xì)胞，也能使腸內(nèi)黏液性質(zhì)發(fā)生改變，從而使細(xì)菌更容易穿過(guò)黏液層并侵襲上皮細(xì)胞導(dǎo)致炎性損傷。黏蛋白MUC13 基因敲除的小鼠在給予 DSS 誘導(dǎo)后，出現(xiàn)更嚴(yán)重的結(jié)腸炎性反應(yīng)，上皮細(xì)胞凋亡更明顯[10]，表明腸黏膜屏障的缺陷或功能失調(diào)在UC發(fā)病中起重要作用。

炎性細(xì)胞因子間的平衡失調(diào)是 UC發(fā)病的重要機(jī)制之一[11-13]。促炎細(xì)胞因子如 TNF-α、IL-6、IL-1、IL-12、IL-23 等的過(guò)度產(chǎn)生和抑炎因子如 IL-4、IL-10、IL-19、IL-22 等生成不足，導(dǎo)致腸道內(nèi)環(huán)境紊亂是促使炎性腸病(inflammatory bowel disease， IBD)發(fā)生的重要環(huán)節(jié)[14]。DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型會(huì)出現(xiàn)以脾增大為特征的系統(tǒng)性炎性反應(yīng)。本研究對(duì)小鼠模型的腸黏膜組織中多種炎性因子的表達(dá)進(jìn)行了測(cè)定。單核和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1和IL-6屬于促炎性因子，參與細(xì)胞免疫反應(yīng)。DSS結(jié)腸炎模型中，IL-1α、IL-1β以及IL-6的mRNA表達(dá)量均比正常組小鼠顯著升高。細(xì)胞趨化因子對(duì)中性粒細(xì)胞的趨化和活化發(fā)揮重要作用[15]，中性粒細(xì)胞趨化因子配體CXCL-1和CXCL-2在DSS模型中的表達(dá)量顯著升高，這可能是導(dǎo)致中性粒細(xì)胞廣泛浸潤(rùn)的原因之一。TNF-α為促炎性蛋白，由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，除了抗腫瘤外，對(duì)機(jī)體代謝、免疫反應(yīng)及炎性反應(yīng)均有重要的調(diào)節(jié)介導(dǎo)作用[16]。有研究[17-18]表明，活動(dòng)性UC病變部位的TNF-α是正常部位的7倍。本研究中，DSS模型組中TNF-α的mRNA表達(dá)量比正常組顯著升高。TNF-α可通過(guò)激活NF-kB通路來(lái)促進(jìn)炎性反應(yīng)的進(jìn)展[19]。環(huán)氧化酶2(COX-2)是催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素E2(prostaglandin E2， PGE2)的關(guān)鍵酶，COX-2可被多種炎性遞質(zhì)和細(xì)胞因子所誘導(dǎo)，其過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致PGE2含量升高，而PGE2導(dǎo)致血管擴(kuò)張，通透性增加，黏膜充血水腫，可能與UC患者腹痛腹瀉癥狀相關(guān)[20]。本研究中，DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型中COX-2的表達(dá)顯著升高，提示COX-2在該模型中發(fā)揮促炎性反應(yīng)的作用。

綜上，筆者通過(guò)誘導(dǎo)DSS小鼠結(jié)腸炎模型，進(jìn)行DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎病理及免疫機(jī)制研究，發(fā)現(xiàn)炎性因子在結(jié)腸炎的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，炎性因子的過(guò)表達(dá)可促進(jìn)結(jié)腸黏膜中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，進(jìn)而引發(fā)炎性反應(yīng)，造成腸黏膜破壞。該研究深化了對(duì)結(jié)腸炎模型病理、免疫機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為結(jié)腸炎的治療提供了新的思路。