黑曲霉電子束輻照突變菌的 遺傳毒性評價(jià)

崔敬愛,莊若巖,戴碧瑋,邵智韜,徐 巖,曹 勇,陳海燕,陳曉平,*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,吉林長春 130118; 2.長春科技學(xué)院,吉林長春 130600)

黑曲霉(Aspergillusniger)是一種絲狀子囊真菌,在環(huán)境中十分常見[1-2]。在自然生長狀態(tài)下,黑曲霉分泌大量多種用途的酶降解環(huán)境中的生物聚合物從而獲得營養(yǎng)。電子束輻照黑曲霉突變菌生產(chǎn)的工業(yè)酶在淀粉加工、發(fā)酵、釀造、飲料生產(chǎn)動物飼料和造紙行業(yè)等領(lǐng)域發(fā)揮了巨大的作用。此外,黑曲霉突變菌還可以作為異源蛋白的生產(chǎn)宿主及生產(chǎn)檸檬酸和葡萄糖酸的細(xì)胞工廠,因其具有高產(chǎn)、高分泌、高安全性等優(yōu)點(diǎn)，而被廣泛地應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)中。

電子束輻照黑曲霉是通過電子加速器發(fā)射電子束射線通過高能脈沖直接作用在生物細(xì)胞內(nèi)的DNA或通過間接作用使水和小分子物質(zhì)輻解,進(jìn)而破壞生物細(xì)胞內(nèi)DNA,使DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[3-4]。電子束輻照做為應(yīng)用于食品中的一種新型物理冷加工技術(shù)[5],其本身有著獨(dú)特的特點(diǎn)。電子束誘變育種具有速度高、輻照效率高、不產(chǎn)生放射性殘留、單位耗能低、操作方法簡單等特點(diǎn)[6],可以通過電子束誘變的方法來獲得優(yōu)良的突變菌株[7]。

近年來,隨著輻照技術(shù)在食品生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸上的廣泛應(yīng)用以及電子束輻照技術(shù)作為一種新型的物理冷加工技術(shù)在食品生產(chǎn)、加工上的飛速發(fā)展[8],電子束輻照已在蔬菜、水果、干果、肉類等保鮮方面有廣泛的研究[9-13]。食品輻照技術(shù)是對食品純物理的加工過程[14],加工后的產(chǎn)品不會造成殘留和環(huán)境危害[15]。但是通過電子束輻照誘變的黑曲霉突變菌的安全性還未有明確的試驗(yàn)證明,電子束誘變后黑曲霉的突變菌株作為食品發(fā)酵業(yè)的關(guān)鍵酶類[16-17]，其安全性也需要進(jìn)一步的試驗(yàn)證明。黑曲霉在接受電子束輻照后可能會產(chǎn)生一些輻解產(chǎn)物[18]，例如一些有毒的醛類物質(zhì)[19]。為了更好確定電子束輻照后黑曲霉突變菌的安全性,應(yīng)對輻照后的黑曲霉進(jìn)行安全性評價(jià)。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)《食品安全毒理學(xué)評價(jià)程序和檢驗(yàn)方法》的規(guī)定[20]，在前期已經(jīng)完成電子束輻照后黑曲霉突變菌的急性毒性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過對小鼠進(jìn)行Ames試驗(yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)、小鼠精子試驗(yàn)對電子束輻照后黑曲霉突變菌進(jìn)行遺傳毒性評價(jià),旨在全面評價(jià)電子束輻照后黑曲霉突變菌的遺傳安全性，為電子束輻照后黑曲霉突變菌的安全使用提供了可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉(編號40099)、察氏培養(yǎng)基 購于CICC工業(yè)微生物菌種保藏中心;黑曲霉突變菌(編號40099) 經(jīng)電子束誘變,從吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院安全實(shí)驗(yàn)室獲得;ICR小鼠(許可證號:SCXK(吉)2015-0001),50只7～12周齡的ICR小鼠,雌雄各半,50只6～8周齡的ICR雄性小鼠 遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司;鼠傷寒沙門細(xì)菌營養(yǎng)缺陷型突變株TA97、TA98、TA100和TA102 經(jīng)基因型和生物學(xué)性狀檢定合格,衛(wèi)生部食品安全衛(wèi)生監(jiān)督檢驗(yàn)所提供;磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、甲醇、Giemsa染色素 分析純,上海試劑廠;環(huán)磷酰胺 成都市華西生化制品廠;D-葡萄糖-6磷酸鈉鹽 上海生化所;敵克松 丹東市農(nóng)藥總廠;疊氮鈉 江蘇晶美生物科技有限公司;2-氨基芴、1,8-二羥基蒽醌 南京恒諾醫(yī)藥化工有限公司;桔霉素、二甲基亞砜 卡邁舒生物科技有限公司;牛血清蛋白(批號:SQ-2010A) 北京依托華茂生物科技有限公司;大鼠肝S9混合液 大鼠肝勻漿經(jīng)低溫離心9000 r/min后所得上清液,復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院。

XSP-4C生物顯微鏡 上海長方光學(xué)儀器有限公司;PH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器廠;低溫冰箱 海信容聲冰箱有限公司;SW-CJ-IFD超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;JY501電子分析天平 上海蒲春計(jì)量儀器有限公司;HH-6電恒溫水浴鍋 北京長風(fēng)儀器公司;DNP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 制備孢子懸浮液 用生理鹽水洗脫斜面試管孢子,180 r/min,30 ℃分散孢子,血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),調(diào)整黑曲霉孢子濃度到106CFU/mL。

1.2.2 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn) 將50只7～12周齡的健康ICR小鼠適應(yīng)飼養(yǎng)7 d后,隨機(jī)分為五組,每組十只,雌雄各半。由于誘變后的黑曲霉突變菌含毒可能性極低,故本研究采用最大劑量耐受法對黑曲霉突變菌進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)[21]。由于小鼠并未產(chǎn)生中毒死亡現(xiàn)象,所以將小鼠的最大耐受劑量設(shè)定為20 g/kg。根據(jù)小鼠的最高耐受劑量,將黑曲霉孢子懸浮液制備成不同濃度的高劑量組、中劑量組、低劑量組,以二倍梯度分別設(shè)計(jì)為6.700、3.350、1.675 CFU/mL。灌胃劑量為0.04 g/kg的環(huán)磷酰胺為陽性劑量組,蒸餾水為陰性劑量組。每個(gè)劑量組分兩次對小鼠經(jīng)口灌胃,每次間隔24 h。在第二次灌胃6 h后通過頸椎脫臼的方法處死小鼠。取出胸骨制作骨髓涂片,干燥后用Giemsa染液染色后在顯微鏡下觀察。每組小鼠涂片在生物顯微鏡下計(jì)數(shù)1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞(PCE),并計(jì)數(shù)出含有微核的嗜多染紅細(xì)胞[22]。以含微核的PCE千分率計(jì)算微核率。每組小鼠涂片計(jì)數(shù)200個(gè)PCE,顯微鏡下觀察并計(jì)算出嗜多染紅細(xì)胞與成熟正染紅細(xì)胞(NCE)的比值。

1.2.3 Ames試驗(yàn) 本次試驗(yàn)采用常規(guī)平板滲入法,采用四株經(jīng)過鑒定符合要求的鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株TA97、TA98、TA100、TA102進(jìn)行小鼠細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)[23]。整個(gè)實(shí)驗(yàn)實(shí)行無菌操作。本次試驗(yàn)設(shè)8、40、200、1000、5000 μg/皿五個(gè)試驗(yàn)劑量組,同時(shí)設(shè)陰性對照組(無菌蒸餾水)、空白對照組、陽性對照組。陽性對照組分別為疊氮鈉(TA100,不加S9)、敵克松(TA97、TA98、TA102,不加S9)作為非活化系統(tǒng)和2-氨基芴(TA97、TA98、TA100,加S9)、1.8-二羥基蒽醌(TA102,加S9)作為活化系統(tǒng)。每個(gè)劑量做三個(gè)平行皿。在相同的試驗(yàn)條件下,重復(fù)試驗(yàn)2次,以確定實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。在37 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，直接計(jì)數(shù)法計(jì)算每皿回變菌落數(shù)[24]。

1.2.4 小鼠精子畸形試驗(yàn) 選用6～8周齡,體重為25～35 kg的雄性小鼠50只,適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后,隨機(jī)分為五組,每組十只。試驗(yàn)設(shè)計(jì)高劑量組、中劑量組、低劑量組、陰性對照組和陽性對照組五個(gè)劑量組[25]。根據(jù)小鼠對黑曲霉突變菌的最大耐受劑量計(jì)算出,高劑量組為10 g/kg 體重、中劑量組為5 g/kg 體重、低劑量組為2.5 g/kg 體重。陰性對照組(蒸餾水代替藥品),陽性對照組(用環(huán)磷酰胺代替藥品,以40 mg/kg 體重灌胃)[26]。對小鼠經(jīng)口灌胃,連續(xù)5 d每天一次。在首次灌胃后的第35 d,利用頸椎脫臼的方法處死全部小鼠,取出小鼠的兩側(cè)副睪,通過制片、染色、干燥后在高倍顯微鏡下觀察其精子形態(tài),每只小鼠觀察1000個(gè)完整的精子,計(jì)算精子畸形率[27-28]。

精子畸形率(%)=精子畸形數(shù)/觀察精子總數(shù)×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對Ames每個(gè)劑量組的平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行計(jì)算。進(jìn)行t檢驗(yàn)和方差分析,并以LSD(least significant difference)法和Duncan-t檢驗(yàn)法對各劑量組進(jìn)行比較,檢驗(yàn)是否存在劑量-反應(yīng)關(guān)系。檢驗(yàn)的顯著性水平設(shè)定為p<0.05(顯著水平)和p<0.01(極顯著水平)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果

小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果如表1。

表1 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Micronucleus test results of mouse bone marrow

由表1可見,通過哺乳動物骨髓微核細(xì)胞試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雌、雄小鼠的環(huán)磷酰胺陽性對照組與蒸餾水陰性對照組的小鼠骨髓細(xì)胞微核率具有極顯著性差異(p<0.01),該結(jié)果表明環(huán)磷酰胺具有強(qiáng)烈的致突變效果,陽性對照組可靠,證明本次試驗(yàn)具有可靠性。黑曲霉突變菌各劑量組雌、雄小鼠的骨髓細(xì)胞微核率與陰性對照組比較均無顯著性差異(p>0.05),并且隨著灌胃劑量的增加,微核率并不隨之增加,即無劑量-效應(yīng)關(guān)系。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黑曲霉突變菌的小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果為陰性。證明黑曲霉突變菌不能引起哺乳動物嗜多染紅細(xì)胞的微核細(xì)胞率增加,黑曲霉突變菌無致突變作用。

2.2 Ames試驗(yàn)結(jié)果

黑曲霉突變菌兩次Ames試驗(yàn)結(jié)果如表2、表3。

表2 黑曲霉突變菌Ames第一次試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Aspergillus niger Ames first test

表3 黑曲霉突變菌Ames第二次試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Aspergillus niger Ames second test

試驗(yàn)結(jié)果表明,陽性對照組的細(xì)菌回變菌落數(shù)均超過空白對照組、陰性對照組和五個(gè)試驗(yàn)劑量組的細(xì)菌回變菌落數(shù)兩倍以上。陽性對照組表現(xiàn)出極強(qiáng)的誘變性,陽性對照組可靠,證明本次試驗(yàn)具有可靠性。不同劑量組的黑曲霉突變菌在加S9和不加S9的試驗(yàn)條件下,回變菌落數(shù)均未超過陰性對照組和空白對照組的細(xì)菌回變菌落數(shù)兩倍，差異不顯著(p>0.05)。兩次重復(fù)試驗(yàn)得出結(jié)果大致相同,即可認(rèn)為黑曲霉突變菌的小鼠Ames試驗(yàn)結(jié)果為陰性。在本次試驗(yàn)條件下，黑曲霉突變菌對小鼠未見致突變作用。

2.3 小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果

黑曲霉突變菌各劑量組的精子畸形率如表4。

表4 黑曲霉突變菌對小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果(n=5)Table 4 Test results of Aspergillus niger on sperm abnormality in mice(n=5)

小鼠陽性對照組的精子畸形率與陰性對照組的精子畸形率相比較具有極顯著性差異(p<0.01)，說明小鼠對環(huán)磷酰胺敏感,陽性對照組可靠，證明本次試驗(yàn)結(jié)果具有可靠性。小鼠的各個(gè)劑量組與陰性對照組的精子畸形率均在正常范圍內(nèi),通過高倍顯微鏡對小鼠的精子形態(tài)觀察,未出現(xiàn)雙頭、雙尾、尾折疊、胖頭等畸變類型,黑曲霉突變菌各劑量組精子畸形率與陰性對照組相比無顯著性差異(p>0.05)。所以在此試驗(yàn)條件下,黑曲霉突變菌的小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果為陰性[29-31]。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究中,通過最大耐受計(jì)量法測得黑曲霉突變菌屬于無毒級別。采用Ames試驗(yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)、小鼠精子畸形試驗(yàn)的方法，對誘變后的黑曲霉突變菌的遺傳毒性進(jìn)行測定。結(jié)果表明，在Ames試驗(yàn)中,無論是否添加S9,黑曲霉突變菌Ames試驗(yàn)結(jié)果均為陰性。表明黑曲霉突變菌無致突變作用。在小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)中,黑曲霉突變菌不能引起哺乳動物嗜多染紅細(xì)胞的微核細(xì)胞率增加，試驗(yàn)結(jié)果為陰性,表明黑曲霉突變菌并無致突變作用。在小鼠精子畸形試驗(yàn)中,試驗(yàn)結(jié)果為陰性,表明黑曲霉突變菌并未對小鼠的精子產(chǎn)生致畸作用。綜上所述,在此試驗(yàn)條件下,經(jīng)電子束輻照處理后的黑曲霉突變菌屬無毒性,并無遺傳毒性作用。