• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    沙門氏菌及副溶血性弧菌的 共增菌培養(yǎng)基的研制

    2018-10-22 09:33:02秦鮮菊徐思源寧喜斌
    食品工業(yè)科技 2018年19期
    關(guān)鍵詞:增菌溶血性弧菌

    晨 凡,秦鮮菊,徐思源,寧喜斌,2,3,4,*

    (1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306; 2.上海海洋大學(xué),食品科學(xué)與工程國家級實驗教學(xué)示范中心,上海 201306; 3.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海 201306; 4.國家淡水水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心(上海),上海 201306)

    食源性致病菌是引起食源性疾病的主要因素之一,在世界食品安全領(lǐng)域中備受關(guān)注。世界衛(wèi)生組織(WHO)最新研究報告表明,在2015年全球有5600多萬人死亡,其中約有139萬人死于腹瀉病[1]。在眾多食源性致病菌中,沙門氏菌與副溶血性弧菌最受關(guān)注。2008~2015年間,我國共有1597起食物中毒事件,其中由食源性致病菌引起的食物中毒占總中毒人數(shù)的62.02%,而在所有致病菌中,沙門氏菌和副溶血性弧菌分別在常見微生物食物中毒占比23%和21%,分別為第一和第二位[2-3]。

    近年來,在食源性致病菌快速檢測方面,檢測方法主要涉及免疫學(xué)、代謝學(xué)、以DNA探針等技術(shù)為代表的分子生物學(xué)等,較之傳統(tǒng)國標(biāo)法檢測,具有較高的特異性和靈敏性?,F(xiàn)代技術(shù)如多重PCR、基因芯片等,甚至可以實現(xiàn)同一平臺上對多種致病菌的檢測[4-7]。同時,檢測方法的快速發(fā)展也要求樣品前處理步驟更加快捷,在食源性致病菌的檢測過程中,仍需要對目標(biāo)菌進行富集培養(yǎng),但是不同的致病菌有特定的前增菌步驟,沙門氏菌等菌株更是需要進行多步增菌過程,較為費時、費力[8]。因此,研制可同時富集多種致病菌的共增菌培養(yǎng)基成為研究的熱點,這對于提高致病菌共檢技術(shù)的效率具有重要意義。沙門氏菌和副溶血性弧菌均為食品中重要的致病菌,研究其共增菌技術(shù)對于控制其疾病的傳播及預(yù)防相應(yīng)的食物中毒具有重大意義。

    目前國內(nèi)外研究中,涉及多種致病菌共增菌培養(yǎng)基的研究已有:沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的共增技術(shù)[9],沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的共增技術(shù)[10],沙門氏菌、大腸桿菌和單增李斯特氏菌的共增技術(shù)[11],沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特氏菌的共增技術(shù)[12]等,其中大部分培養(yǎng)基選擇性增菌能力不強,不能滿足對目標(biāo)菌進行富集的要求。翁思聰?shù)萚13]研究了一種選擇性富集沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌共增菌培養(yǎng)基,由于其共增菌的菌株種類較多,菌株間存在較為復(fù)雜的抑制和共生關(guān)系,容易影響檢出效率和重復(fù)率。沙門氏菌和副溶血弧菌均為革蘭氏陰性菌,需氧或兼性厭氧,營養(yǎng)需求不高,且兩種細(xì)菌均可利用葡萄糖、檸檬酸和甘露醇作為碳源,因此可在同種培養(yǎng)條件下迅速生長,兩者在同一選擇性增菌環(huán)境中共增菌具有現(xiàn)實的可行性,且更具有針對性。

    本實驗對富集沙門氏菌和副溶血性弧菌兩種引起食源性疾病致病菌的共增菌培養(yǎng)基進行了研究,對其增菌效果進行了初步的評估驗證,并根據(jù)目標(biāo)菌不同的營養(yǎng)需求,篩選適宜抑制劑和促進劑,進行單因素實驗,確定共增菌培養(yǎng)基的配方,最后驗證該培養(yǎng)基的增菌效果,以得到具有較優(yōu)增菌效果的共增菌培養(yǎng)基,為今后檢測方法的修訂提供必要的依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    沙門氏菌(Salmonellaenteritidis,Se)CMCC 15611、副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus,Vp)ATCC 13847 均為本研究室保藏;營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 分析純,用于食品及其他物品檢驗中的菌落計數(shù)(上海疾控)上海華康科技開發(fā)公司;木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂(Xylose lysine deoxycholate agar,XLD) 分析純,用于沙門氏菌的選擇性分離,北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂(Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar,TCBS) 分析純,用于致病性弧菌的選擇性分離,青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;蛋白胨 分析純,生工生物工程(上海)股份有限公司;磷酸氫二鉀、檸檬酸鈉(Na3C6H5O7·2H2O)、硫代硫酸鈉(Na2S2O3·5H2O)、氯化鈉、葡萄糖、甘露醇 分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司;牛膽鹽 分析純,廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

    THZ-300恒溫培養(yǎng)搖床、THZ-300隔水式培養(yǎng)箱9270 上海一恒科技有限公司;InoLab pH730臺式pH測量儀 德國WTW公司;UV-1100型紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的選擇 參照沙門氏菌、副溶血性弧菌在食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.4-2016及GB 4789.7-2013中規(guī)定的增菌培養(yǎng)基配制方法,分別列出其中的成分及含量,參考劉園園等[12]方法,去除培養(yǎng)基中具有選擇性的組分,并根據(jù)兩種細(xì)菌生長所必要的成分確定共增菌培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分。

    1.2.2 共增菌培養(yǎng)基中單因素成分的篩選 根據(jù)兩種細(xì)菌營養(yǎng)需求和抑制條件的不同,參考之前的研究[11-12]和兩種目標(biāo)菌各自選擇培養(yǎng)基中的特異成分,篩選不同的抑制劑和促進劑進行實驗。將添加成分列為:葡萄糖、檸檬酸鈉、硫代硫酸鈉、甘露醇、氯化鈉、牛膽鹽。根據(jù)方法1.2.1配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基,取四支試管編號1~4號,其中1號試管作為空白對照,只加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基4 mL,2、3、4號試管分別加入含低濃度、中濃度、高濃度添加成分的基礎(chǔ)培養(yǎng)基4 mL(見表2),分裝后高壓滅菌備用。將沙門氏菌和副溶血性弧菌分別接入不同添加成分的培養(yǎng)基中,在37 ℃,120 r/min下?lián)u床振蕩培養(yǎng)24 h,用紫外可見分光光度計測定在600 nm波長處的光密度OD值,以此確定適宜添加成分及適宜添加量,制備共增菌培養(yǎng)基。

    1.2.3 目標(biāo)菌增菌效果的驗證 以102CFU/mL作為目標(biāo)菌初始接種量,將沙門氏菌及副溶血性弧菌分別接種至共增菌培養(yǎng)基中,于37 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)24 h。分別取0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h時的菌液1 mL,加入9 mL生理鹽水中,制成1∶10稀釋液,以此類推,分別進行適宜梯度稀釋,每個梯度平行三次,平板涂布至XLD及TCBS培養(yǎng)基中,置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,對平板進行菌落計數(shù),并乘以對應(yīng)的稀釋倍數(shù),得出總菌落數(shù),繪制目標(biāo)菌生長曲線并分析結(jié)果。由于營養(yǎng)肉湯沒有特定選擇性,且沙門氏菌和副溶血性弧菌均可在營養(yǎng)肉湯中生長,故以營養(yǎng)肉湯增菌液作為對照組,重復(fù)上述操作,得出對照組生長曲線。并以102CFU/mL為初始接種量,將沙門氏菌及副溶血性弧菌以1∶1比例一同接種至共增菌培養(yǎng)基中,于37 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)24 h并稀釋涂布平板,觀察目標(biāo)菌生長情況并計算菌落總數(shù),實驗平行三次,同樣以營養(yǎng)肉湯作為對照組,驗證培養(yǎng)基共增菌效果。

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    利用IBM SPSS Statistics 22.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計,對培養(yǎng)基不同成分添加后目標(biāo)菌的生長情況進行單因素顯著性差異分析,對目標(biāo)菌在共增菌培養(yǎng)基及對照組中的增菌情況進行配對T檢驗,進行顯著性差異分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的篩選

    根據(jù)GB 4789.4-2016及GB 4789.7-2013,對目標(biāo)菌增菌培養(yǎng)基成分進行比較,結(jié)果如表1所示。由表1分析可知,蛋白胨為沙門氏菌和副溶血性弧菌提供氮源和能源,參照國標(biāo),其含量取10.0 g為宜,氯化鈉在增菌液中起到調(diào)節(jié)滲透壓的作用,而磷酸二氫鉀的添加可以穩(wěn)定菌體生長過程中pH的變化[10],綜合考慮兩種目標(biāo)菌的基本生長條件及配制簡便性,取氯化鈉5.0 g,磷酸氫二鉀1.5 g為適宜含量,得出共增菌培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分為:蛋白胨10.0 g,磷酸二氫鉀1.5 g,氯化鈉5.0 g,蒸餾水1000 mL。將以上成分進行分裝,振蕩搖勻,調(diào)節(jié)pH至7.2~7.4,于1×105Pa高溫滅菌15 min后置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    表1 目標(biāo)菌增菌培養(yǎng)基成分比較Table 1 Comparison of enrichment medium compositions of target bacteria

    2.2 共增菌培養(yǎng)基添加成分及含量

    添加抑制劑和促進劑的增菌液按濃度從低到高進行排列,成分及添加濃度如表2所示。

    表2 各添加成分及其添加量Table 2 Additive amount of different candidate agents

    將目標(biāo)菌接種培養(yǎng)后,在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后,沙門氏菌的OD600值為0.523±0.014,副溶血性弧菌的OD600值為0.332±0.007,以此作為空白對照。在添加不同成分的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后,兩種目標(biāo)菌的OD600值如表3所示。

    表3 各添加成分對兩種目標(biāo)菌生長的影響Table 3 Effect of different candidate agents on the growth of two target bacterias

    對抑制劑單因素實驗的結(jié)果顯示,硫代硫酸鈉的添加對沙門氏菌和副溶血性弧菌的生長均起到明顯的作用。當(dāng)硫代硫酸鈉的添加量不大于5.0 g/L時,沙門氏菌受到顯著促進作用,而副溶血性弧菌受到顯著抑制作用(p<0.05),當(dāng)硫代硫酸鈉添加量達到10.0 g/L時,沙門氏菌和副溶血性弧菌均受到顯著的抑制作用,綜合考慮,硫代硫酸鈉的適宜添加量為5.0 g/L。不同濃度的氯化鈉對兩種目標(biāo)菌的作用不同。對于沙門氏菌而言,氯化鈉濃度越高,對其生長的抑制作用越強,而氯化鈉濃度為2%~4%時,對副溶血性弧菌的生長最為適宜[15]。當(dāng)氯化鈉添加量為2.5 g/L時,由于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中已添加5.0 g/L氯化鈉,此時氯化鈉的總濃度為7.5 g/L,沙門氏菌OD值為0.703±0.013,副溶血性弧菌為0.721±0.009,兩種目標(biāo)菌的生長較對照組顯著增加(p<0.05);但當(dāng)氯化鈉添加量為5.0 g/L,總濃度達10.0 g/L時,沙門氏菌的OD值降到0.450±0.008,其生長受到顯著抑制(p<0.05),由此可知,為了使沙門氏菌和副溶血性弧菌在相同增菌時間內(nèi)均達到檢測限,氯化鈉濃度不能達到副溶血性弧菌最適濃度,適宜添加量為2.5 g/L。牛膽鹽作為一種革蘭氏陽性菌的生長抑制劑[16],在0.1 g/L以下的濃度時,對沙門氏菌和副溶血性弧菌等革蘭氏陰性菌生長的影響不大,但高于此濃度會使抑制作用顯著增強(p<0.05),因此0.1 g/L為牛膽鹽的適宜添加量。

    對促進劑單因素實驗的結(jié)果顯示,檸檬酸鈉在1.25~2.5 g/L濃度范圍內(nèi),可以促進沙門氏菌和副溶血性弧菌的生長,但當(dāng)添加量達到5.0 g/L時,其促進作用不顯著(p>0.05),表明檸檬酸鈉的促進作用有限,其適宜添加量為2.5 g/L。在1.25~5.0 g/L濃度范圍內(nèi),相較對照組,甘露醇對沙門氏菌和副溶血性弧菌有顯著的促進作用(p<0.05)。當(dāng)添加量為5.0 g/L時,甘露醇對沙門氏菌仍有顯著的促進作用(p<0.05),但對副溶血性弧菌的促進作用不顯著(p>0.05)。葡萄糖作為一種碳源,其添加對兩種細(xì)菌的生長均可起到一定程度的促進作用[17],根據(jù)表中結(jié)果分析,葡萄糖最適宜的添加量為2.5 g/L,此濃度對沙門氏菌和副溶血性弧菌的促進效果均顯著。

    綜上所述,最終確定共增菌培養(yǎng)基的添加成分及其含量為:蛋白胨10.0 g、磷酸二氫鉀1.5 g、氯化鈉7.5 g、硫代硫酸鈉5.0 g、牛膽鹽0.1 g、檸檬酸鈉2.5 g、甘露醇2.5 g、葡萄糖2.5 g、1000 mL蒸餾水。配制后充分混勻,調(diào)節(jié)pH為7.2~7.4。將該培養(yǎng)基命名為SV(Salmonella-Vibrioparahaemolyticus)富集培養(yǎng)基。

    2.3 目標(biāo)菌在共增菌培養(yǎng)基中增菌效果的驗證

    沙門氏菌和副溶血性弧菌在SV培養(yǎng)基和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(對照組)中分別增菌的結(jié)果如圖1和圖2所示。

    圖1 沙門氏菌在營養(yǎng)肉湯(對照) 和SV增菌液中24 h內(nèi)生長情況Fig.1 Growth of Salmonella in nutritional broth(control)and SV broth within 24 h

    圖2 副溶血性弧菌在營養(yǎng)肉湯(對照) 和SV增菌液中24 h內(nèi)生長情況Fig.2 Growth of Vibrio parahaemolyticus in nutritional broth and SV broth within 24 h

    由圖1可知,較高氯化鈉濃度造成的高滲環(huán)境對沙門氏菌的生長起到抑制作用,沙門氏菌在SV培養(yǎng)基中的生長速率略慢,生長對數(shù)期相對于對照組滯后。

    表4列出了沙門氏菌在兩種培養(yǎng)基中每4 h時的菌濃度,由表中數(shù)據(jù)分析可知,在SV培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h時,沙門氏菌達到最高生長濃度可達108CFU/mL,與對照組109CFU/mL存在顯著性差異(p<0.05),表明沙門氏菌在SV增菌液中增菌效果低于對照組。

    表4 沙門氏菌在營養(yǎng)肉湯(對照)和SV增菌液中生長差異性比較Table 4 Comparison of Salmonella growth differences in nutritional broth(control)and SV broth

    與沙門氏菌相比,副溶血性弧菌受到鹽濃度的抑制作用較小,由圖2可知,副溶血性弧菌在SV培養(yǎng)基中培養(yǎng)時,約2 h就能進入對數(shù)期,且在增菌10 h時菌濃度達到最高值,相比對照組增效明顯,表明SV增菌液比對照組更適于Vp。

    表5中數(shù)據(jù)顯示,在4、8 h時,SV培養(yǎng)基中的菌液濃度同對照組比,存在顯著性差異(p<0.05),當(dāng)增菌時間到達16 h時,SV增菌液和對照組中菌液濃度均達到109CFU/mL,差異不顯著性(p>0.05),表明副溶血性弧菌在SV增菌液中增菌效率比對照組高。

    表5 副溶血性弧菌在營養(yǎng)肉湯(對照)和SV增菌液中生長差異性比較Table 5 Comparison of Vibrio parahaemolyticus growth differences in nutritional broth(control)and SV broth

    將沙門氏菌及副溶血性弧菌以1∶1比例一同接種至SV培養(yǎng)基及營養(yǎng)肉湯中,經(jīng)過24 h增菌培養(yǎng)后,沙門氏菌菌落總數(shù)可達到107CFU/mL,副溶血性弧菌菌落總數(shù)可達到108CFU/mL(見圖3),相比對照組,沙門氏菌在增菌24 h后菌濃度可達到107CFU/mL,而副溶血性弧菌在增菌24 h后菌濃度為106CFU/mL,表明SV培養(yǎng)基對沙門氏菌和副溶血性弧菌的共增菌效果優(yōu)于營養(yǎng)肉湯。較翁思聰?shù)萚13]研究結(jié)果中,沙門氏菌和副溶血性弧菌在SV培養(yǎng)基中共同增菌時生長更為旺盛,可達到后續(xù)檢測的檢測限。

    圖3 沙門氏菌和副溶血性弧菌在SV培養(yǎng)基 及對照組中共增菌生長情況Fig.3 Simultaneous growth of Salmonella and Vibrio parahaemolyticus in SV broth and control broth

    3 討論與結(jié)論

    本研究通過對GB 4789.4-2016及GB 4789.7-2013中沙門氏菌和副溶血性弧菌選擇性增菌液成分的篩選以及兩種目標(biāo)菌營養(yǎng)需求的分析配制了合適的基礎(chǔ)增菌液,并對共增培養(yǎng)基中促進劑和抑制劑進行了篩選,最終配制出可同時富集沙門氏菌和副溶血性弧菌的共增菌SV培養(yǎng)基。本研究中的兩種目標(biāo)菌均為革蘭氏陰性細(xì)菌,因而在設(shè)計SV培養(yǎng)基時,添加了硫代硫酸鈉、牛膽鹽等革蘭氏陽性菌抑制劑,同時添加適宜濃度的氯化鈉,使兩種目標(biāo)菌能以相對一致的速度生長。檸檬酸鈉、甘露醇、葡萄糖等可作為細(xì)菌的生長因子,對沙門氏菌和副溶血性弧菌的生長起到促進作用。本研究中對照組營養(yǎng)肉湯NB為通用型肉湯培養(yǎng)基,無法實現(xiàn)幾種目標(biāo)菌的共同增菌[18],且國標(biāo)中各個菌株的選擇性增菌液只能滿足單一菌種的增菌,而SV培養(yǎng)基可同時對沙門氏菌和副溶血性弧菌兩種目標(biāo)菌進行富集,成分相對簡單,配制簡易,針對性較強。同時可在此基礎(chǔ)上進一步研究目標(biāo)菌的多重PCR等技術(shù),實現(xiàn)快速檢測的需求。

    本研究結(jié)果表明,研制出用于沙門氏菌和副溶血性弧菌的共增菌培養(yǎng)基成分為:蛋白胨10.0 g,磷酸二氫鉀1.5 g,氯化鈉7.5 g,硫代硫酸鈉5.0 g,牛膽鹽0.1 g,檸檬酸鈉2.5 g,甘露醇2.5 g,葡萄糖2.5 g,蒸餾水1000 mL。當(dāng)目標(biāo)菌初始濃度為102CFU/mL時,將沙門氏菌與副溶血性弧菌以1∶1比例接種至SV培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)24 h后,菌濃度可分別達到107CFU/mL和108CFU/mL,其共增菌效果優(yōu)于營養(yǎng)肉湯。本研究研制的SV共增菌培養(yǎng)基可同時富集沙門氏菌和副溶血性弧菌兩種目標(biāo)菌,滿足目標(biāo)菌檢測的要求,且增菌培養(yǎng)基成分相對簡單,成本較低,具有良好的市場前景,也為今后檢測方法的修訂提供了一定的依據(jù)。

    猜你喜歡
    增菌溶血性弧菌
    銷量增長200倍!“弧菌克星”風(fēng)靡行業(yè),3天殺滅98%弧菌
    副溶血弧菌檢測方法的研究進展
    碳氧血紅蛋白在新生兒ABO溶血性黃疸中的臨床意義
    不同檢測方法對妊娠晚期B族鏈球菌的篩查比較
    3種改良B族鏈球菌檢測方法的檢測效果比較▲
    如何有效防控對蝦養(yǎng)殖中的弧菌病
    大腸桿菌O157:H7快速增菌培養(yǎng)基檢測效果的研究
    副溶血弧菌噬菌體微膠囊的制備及在餌料中的應(yīng)用
    沙門菌和志賀菌通用增菌液增菌效果實驗觀察
    利巴韋林片致溶血性貧血伴急性腎衰竭1例
    欧美一区二区国产精品久久精品 | 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 日本一本二区三区精品| 亚洲国产精品成人综合色| 国产精品影院久久| 看免费av毛片| 操出白浆在线播放| 一本久久中文字幕| 90打野战视频偷拍视频| 国内揄拍国产精品人妻在线| 欧美日韩精品网址| 色综合婷婷激情| 亚洲精品国产一区二区精华液| 真人一进一出gif抽搐免费| 午夜亚洲福利在线播放| 色噜噜av男人的天堂激情| 午夜视频精品福利| 在线a可以看的网站| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 一区二区三区国产精品乱码| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| a级毛片在线看网站| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 国产精品久久久久久精品电影| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 777久久人妻少妇嫩草av网站| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲第一电影网av| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 免费看十八禁软件| 极品教师在线免费播放| 欧美黑人欧美精品刺激| 欧美在线黄色| 国产男靠女视频免费网站| 久久久国产精品麻豆| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 啦啦啦韩国在线观看视频| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 日本一二三区视频观看| 男女之事视频高清在线观看| 午夜福利免费观看在线| 国产精品免费一区二区三区在线| 午夜福利欧美成人| www.自偷自拍.com| 国产精品98久久久久久宅男小说| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | x7x7x7水蜜桃| 日韩高清综合在线| 亚洲av第一区精品v没综合| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 1024香蕉在线观看| 黄片小视频在线播放| 他把我摸到了高潮在线观看| 亚洲国产精品sss在线观看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国产精品免费视频内射| av免费在线观看网站| 国产精品国产高清国产av| 日韩欧美在线乱码| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 一区二区三区国产精品乱码| 99国产精品99久久久久| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产亚洲精品第一综合不卡| 精品人妻1区二区| 欧美+亚洲+日韩+国产| 久久人人精品亚洲av| 国产高清视频在线播放一区| 亚洲中文日韩欧美视频| aaaaa片日本免费| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 淫秽高清视频在线观看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产av在哪里看| 午夜福利在线在线| 久久久久久人人人人人| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 一级黄色大片毛片| 欧美日韩精品网址| 黄色成人免费大全| 国产精品99久久99久久久不卡| 婷婷精品国产亚洲av| 亚洲av五月六月丁香网| 欧美精品亚洲一区二区| 成年版毛片免费区| 日韩国内少妇激情av| 看片在线看免费视频| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 免费在线观看日本一区| 日日夜夜操网爽| 丁香六月欧美| 一级毛片精品| 在线国产一区二区在线| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 高潮久久久久久久久久久不卡| 日本在线视频免费播放| 精品欧美一区二区三区在线| 久久草成人影院| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产单亲对白刺激| 国产69精品久久久久777片 | 国产黄色小视频在线观看| 99国产综合亚洲精品| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 中文字幕熟女人妻在线| 哪里可以看免费的av片| 亚洲精品色激情综合| 国产免费av片在线观看野外av| 在线观看一区二区三区| 亚洲国产精品999在线| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 人人妻人人澡欧美一区二区| 少妇人妻一区二区三区视频| 日本五十路高清| 妹子高潮喷水视频| 欧美三级亚洲精品| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 韩国av一区二区三区四区| 麻豆一二三区av精品| 麻豆一二三区av精品| 九九热线精品视视频播放| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 精品不卡国产一区二区三区| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产爱豆传媒在线观看 | 人人妻人人澡欧美一区二区| 天堂av国产一区二区熟女人妻 | 亚洲成a人片在线一区二区| 欧美日韩一级在线毛片| 三级毛片av免费| aaaaa片日本免费| 老司机福利观看| 国产人伦9x9x在线观看| 99热这里只有是精品50| xxx96com| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产探花在线观看一区二区| 国产探花在线观看一区二区| 国产午夜精品论理片| 国产黄片美女视频| 亚洲一区二区三区色噜噜| 人妻夜夜爽99麻豆av| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产精品免费一区二区三区在线| АⅤ资源中文在线天堂| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 国产单亲对白刺激| 中出人妻视频一区二区| 亚洲男人的天堂狠狠| svipshipincom国产片| 日韩欧美国产在线观看| 国产人伦9x9x在线观看| 国内精品久久久久精免费| 国产成人av激情在线播放| 免费在线观看日本一区| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 午夜日韩欧美国产| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产精品98久久久久久宅男小说| 动漫黄色视频在线观看| 最好的美女福利视频网| 日韩精品免费视频一区二区三区| 亚洲国产看品久久| 国产一区二区在线av高清观看| 一个人免费在线观看电影 | 男插女下体视频免费在线播放| 一进一出抽搐动态| 狂野欧美激情性xxxx| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 在线播放国产精品三级| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 一区二区三区国产精品乱码| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 中文亚洲av片在线观看爽| 男女下面进入的视频免费午夜| 一夜夜www| 一进一出抽搐动态| 亚洲国产中文字幕在线视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产亚洲精品一区二区www| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 我的老师免费观看完整版| 久久欧美精品欧美久久欧美| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 国产私拍福利视频在线观看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 一个人免费在线观看的高清视频| 欧美在线一区亚洲| 国产精华一区二区三区| 久久香蕉激情| 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲av成人精品一区久久| 中文字幕av在线有码专区| 黄色成人免费大全| 日本免费一区二区三区高清不卡| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 久久中文看片网| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| av超薄肉色丝袜交足视频| 最近在线观看免费完整版| 狂野欧美激情性xxxx| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 午夜福利免费观看在线| 日本a在线网址| 精品欧美国产一区二区三| 欧美丝袜亚洲另类 | 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 又黄又粗又硬又大视频| 日本免费一区二区三区高清不卡| avwww免费| 久久99热这里只有精品18| 欧美黑人欧美精品刺激| 成人午夜高清在线视频| 给我免费播放毛片高清在线观看| 三级毛片av免费| 两个人看的免费小视频| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 久久香蕉精品热| 亚洲精品在线观看二区| 国产91精品成人一区二区三区| 搡老妇女老女人老熟妇| 麻豆成人午夜福利视频| 欧美另类亚洲清纯唯美| 成人精品一区二区免费| 精品不卡国产一区二区三区| 亚洲精品一区av在线观看| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产高清有码在线观看视频 | 高清在线国产一区| 香蕉久久夜色| 一二三四在线观看免费中文在| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产一区在线观看成人免费| 国产精品一区二区三区四区久久| 亚洲av第一区精品v没综合| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲成a人片在线一区二区| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲最大成人中文| 波多野结衣高清无吗| avwww免费| 欧美日韩乱码在线| 久99久视频精品免费| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 国产精品98久久久久久宅男小说| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲国产欧美人成| 久久亚洲真实| 少妇的丰满在线观看| 在线观看舔阴道视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 免费在线观看完整版高清| 欧美zozozo另类| 精品一区二区三区四区五区乱码| 国产探花在线观看一区二区| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 一区福利在线观看| 大型av网站在线播放| 欧美色欧美亚洲另类二区| 亚洲av成人精品一区久久| 又紧又爽又黄一区二区| 国产又色又爽无遮挡免费看| 香蕉丝袜av| 国产日本99.免费观看| 人人妻人人看人人澡| 好男人电影高清在线观看| 波多野结衣高清作品| 色精品久久人妻99蜜桃| www国产在线视频色| 欧美乱码精品一区二区三区| 男人舔女人的私密视频| 岛国视频午夜一区免费看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 校园春色视频在线观看| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 欧美又色又爽又黄视频| 床上黄色一级片| 麻豆国产av国片精品| 99热这里只有是精品50| 国产精品亚洲一级av第二区| 在线永久观看黄色视频| 麻豆av在线久日| 色尼玛亚洲综合影院| 欧美性长视频在线观看| 午夜福利18| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 欧美乱妇无乱码| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲熟女毛片儿| 日本 av在线| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 国产精品久久久久久久电影 | 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 亚洲av片天天在线观看| 久久婷婷成人综合色麻豆| avwww免费| 精品久久久久久久毛片微露脸| 无人区码免费观看不卡| 丁香六月欧美| 国产99白浆流出| 免费av毛片视频| 啪啪无遮挡十八禁网站| 精品欧美一区二区三区在线| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产亚洲精品久久久久5区| 麻豆成人午夜福利视频| 两个人看的免费小视频| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲av美国av| 亚洲国产欧美一区二区综合| 人妻久久中文字幕网| 国内精品一区二区在线观看| 很黄的视频免费| 一级毛片精品| 999久久久国产精品视频| 视频区欧美日本亚洲| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产伦一二天堂av在线观看| 成人三级黄色视频| 又黄又爽又免费观看的视频| 神马国产精品三级电影在线观看 | 亚洲一区二区三区不卡视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 久久久久久大精品| 欧美中文日本在线观看视频| 国产亚洲av高清不卡| 黄色女人牲交| 亚洲黑人精品在线| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲国产精品sss在线观看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 国产69精品久久久久777片 | 麻豆一二三区av精品| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 91麻豆精品激情在线观看国产| 最近最新免费中文字幕在线| 国产av一区在线观看免费| 亚洲中文字幕日韩| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 精品久久久久久久末码| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 国产成+人综合+亚洲专区| av国产免费在线观看| 久久精品91无色码中文字幕| 欧美另类亚洲清纯唯美| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲五月婷婷丁香| 看免费av毛片| 动漫黄色视频在线观看| 哪里可以看免费的av片| 麻豆国产av国片精品| 色综合婷婷激情| 亚洲自拍偷在线| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 在线观看美女被高潮喷水网站 | 久久久国产精品麻豆| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 亚洲成人精品中文字幕电影| 亚洲av熟女| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 在线观看免费视频日本深夜| 波多野结衣高清作品| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 欧美日韩国产亚洲二区| 99re在线观看精品视频| 久久性视频一级片| 色综合婷婷激情| 精品久久久久久,| 国模一区二区三区四区视频 | 亚洲一区高清亚洲精品| 激情在线观看视频在线高清| 99re在线观看精品视频| videosex国产| av有码第一页| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 91大片在线观看| 国产真实乱freesex| 欧美黑人精品巨大| 久久精品影院6| 高清毛片免费观看视频网站| 观看免费一级毛片| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 制服丝袜大香蕉在线| 成年女人毛片免费观看观看9| 欧美精品亚洲一区二区| 欧美黄色片欧美黄色片| 热99re8久久精品国产| 中文资源天堂在线| 两个人免费观看高清视频| 亚洲欧美日韩高清专用| 国产亚洲精品av在线| 亚洲片人在线观看| 久久九九热精品免费| 91在线观看av| 两个人免费观看高清视频| xxxwww97欧美| 国产精品98久久久久久宅男小说| 久久久精品欧美日韩精品| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 婷婷亚洲欧美| 男女床上黄色一级片免费看| 欧美黄色淫秽网站| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 久久精品综合一区二区三区| 国产激情欧美一区二区| 国产精品一区二区免费欧美| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 午夜亚洲福利在线播放| 最近最新中文字幕大全电影3| 身体一侧抽搐| 亚洲九九香蕉| 两个人看的免费小视频| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产精品久久视频播放| 久久久久久久久中文| 亚洲成人国产一区在线观看| 国产区一区二久久| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 美女扒开内裤让男人捅视频| 又粗又爽又猛毛片免费看| 亚洲国产欧美一区二区综合| 在线国产一区二区在线| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 黄色片一级片一级黄色片| av福利片在线观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 中文在线观看免费www的网站 | 亚洲精品久久国产高清桃花| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲片人在线观看| 精品一区二区三区四区五区乱码| 国产精品免费视频内射| 亚洲九九香蕉| 窝窝影院91人妻| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 人人妻人人澡欧美一区二区| 高清毛片免费观看视频网站| 欧美日韩国产亚洲二区| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 成年免费大片在线观看| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 国产激情欧美一区二区| 男女下面进入的视频免费午夜| 在线看三级毛片| 国产一级毛片七仙女欲春2| 极品教师在线免费播放| 久久人妻av系列| 99re在线观看精品视频| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲熟女毛片儿| 国产高清有码在线观看视频 | 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 99精品在免费线老司机午夜| 丰满的人妻完整版| 精品久久蜜臀av无| 亚洲 国产 在线| 久久性视频一级片| 757午夜福利合集在线观看| 免费高清视频大片| 欧美成人免费av一区二区三区| 男人舔女人的私密视频| 99riav亚洲国产免费| 不卡av一区二区三区| 波多野结衣高清作品| 国产精品永久免费网站| 久久久久亚洲av毛片大全| 亚洲成av人片免费观看| 欧美精品啪啪一区二区三区| 免费高清视频大片| 伦理电影免费视频| 啦啦啦免费观看视频1| 在线看三级毛片| 麻豆久久精品国产亚洲av| 夜夜爽天天搞| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 91成年电影在线观看| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 最新在线观看一区二区三区| 91字幕亚洲| 麻豆成人午夜福利视频| 一级黄色大片毛片| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 成人精品一区二区免费| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 高清在线国产一区| 国产一区在线观看成人免费| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 不卡一级毛片| 午夜免费激情av| 国产乱人伦免费视频| 久久久精品欧美日韩精品| 免费观看精品视频网站| 他把我摸到了高潮在线观看| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产野战对白在线观看| 国产成人aa在线观看| 少妇粗大呻吟视频| 男人的好看免费观看在线视频 | 日韩欧美免费精品| 一区二区三区国产精品乱码| 久久99热这里只有精品18| 成人亚洲精品av一区二区| 村上凉子中文字幕在线| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 欧美三级亚洲精品| a级毛片在线看网站| 又黄又爽又免费观看的视频| or卡值多少钱| 一区二区三区国产精品乱码| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 黄色a级毛片大全视频| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 成年女人毛片免费观看观看9| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 黄色片一级片一级黄色片| 日本黄色视频三级网站网址| 亚洲精品久久国产高清桃花| 国产乱人伦免费视频| 两个人视频免费观看高清| 亚洲专区字幕在线| 99国产综合亚洲精品| 中文字幕av在线有码专区| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国内精品久久久久精免费| 亚洲av美国av| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产精品av视频在线免费观看| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 久久久久亚洲av毛片大全| 午夜激情福利司机影院| 成人av一区二区三区在线看| 国产精华一区二区三区| 亚洲中文字幕日韩| 久久久久国内视频| 国产亚洲av高清不卡| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 18美女黄网站色大片免费观看| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲成人久久爱视频| 好男人电影高清在线观看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 无遮挡黄片免费观看| e午夜精品久久久久久久| 午夜福利18| av片东京热男人的天堂| 国产男靠女视频免费网站| 亚洲免费av在线视频| 亚洲精品一区av在线观看| 久久久久性生活片| 国产精品影院久久| 国产成人av教育| www.自偷自拍.com| 精品无人区乱码1区二区| av天堂在线播放| 欧美黄色淫秽网站| 久久国产乱子伦精品免费另类| 国产日本99.免费观看| 男女午夜视频在线观看| 狂野欧美激情性xxxx| 欧美在线黄色| 午夜成年电影在线免费观看| 草草在线视频免费看| 国产精品 欧美亚洲| 在线永久观看黄色视频| 一本精品99久久精品77| 88av欧美| 99国产精品99久久久久| 国产精品爽爽va在线观看网站| 久久久久久久久中文| 国产精品av久久久久免费| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲九九香蕉| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 久久久久久久精品吃奶| 国产精品99久久99久久久不卡| 麻豆av在线久日| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 欧美成狂野欧美在线观看| 我的老师免费观看完整版| 国产成人av教育| 国产成人系列免费观看| 午夜成年电影在线免费观看| 久久天堂一区二区三区四区| 欧美一级a爱片免费观看看 | 精品久久久久久久久久久久久| 丰满人妻一区二区三区视频av | 亚洲成人久久性| 热99re8久久精品国产| 亚洲成人精品中文字幕电影| 91麻豆av在线| 1024香蕉在线观看| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事|