小鼠骨髓源樹(shù)突狀細(xì)胞制備

王雪靜

（貴州省獸藥飼料監(jiān)察所，貴陽(yáng) 550003）

0 引言

1973年Steinman和Cohn首次分離出一類(lèi)同巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞形態(tài)與功能不同的細(xì)胞，命名為樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)。其主要來(lái)源是骨髓CD34+多能造血干細(xì)胞，是體內(nèi)唯一能直接激活初始T細(xì)胞的抗原提呈細(xì)胞(APC)[1]，是機(jī)體免疫的始動(dòng)者及固有免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁。髓系樹(shù)突狀細(xì)胞通過(guò)血液與淋巴液從骨髓移動(dòng)并分布到皮膚，后趨向淋巴組織啟動(dòng)免疫反應(yīng)。淋巴系樹(shù)突狀細(xì)胞是T細(xì)胞集聚區(qū)的固定哨兵，分布主要局限在胸腺髓質(zhì)及淋巴結(jié)T細(xì)胞區(qū)，具有免疫調(diào)節(jié)和免疫耐受作用。

當(dāng)抗原性物質(zhì)侵入機(jī)體時(shí)，宿主體內(nèi)的免疫系統(tǒng)會(huì)啟動(dòng)一系列免疫防衛(wèi)機(jī)制識(shí)別并清除病原體，特異性免疫應(yīng)答啟動(dòng)前，需要APC攝取、加工、處理抗原并將抗原信息提呈給免疫應(yīng)答的淋巴細(xì)胞。主要組織相容性復(fù)合物（MHC）是一段基因密度高的染色體區(qū)段，是一種復(fù)雜且多態(tài)性高的遺傳系統(tǒng)。主要存在2個(gè)途徑即溶酶體途徑（MHC-Ⅱ類(lèi)途徑）和胞質(zhì)溶膠途徑（MHC-Ⅰ類(lèi)途徑）。另外，還存在MHC非依賴(lài)性的抗原提呈途徑，稱(chēng)為CD1分子提呈途徑。DCs的成熟經(jīng)歷前體期、幼稚期及成熟期3個(gè)時(shí)期。開(kāi)始由骨髓進(jìn)入血液循環(huán)，隨后到達(dá)靶組織或器官，停留在潛在抗原物質(zhì)出現(xiàn)位置，主要有MHC-I型和MHC-II型2種抗原提呈途徑。

成熟DCs生物學(xué)特征有：能有效活化初始T細(xì)胞，有效攝取和處理抗原，CD80和CD11c可作為成熟DCs的標(biāo)志，成熟DCs能啟動(dòng)免疫應(yīng)答、釋放干擾素等細(xì)胞因子等。DCs能攝取抗原并將其加工處理成能夠被T細(xì)胞識(shí)別的多肽段。T細(xì)胞受體特異性識(shí)別抗原肽-MHC分子復(fù)合物，刺激T細(xì)胞活化，進(jìn)而啟動(dòng)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和分化有關(guān)基因的表達(dá)。成熟T細(xì)胞主要包括CD4+T細(xì)胞（輔助T細(xì)胞）和CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）2個(gè)亞群。免疫應(yīng)答中，輔助T細(xì)胞最先激活，并釋放細(xì)胞因子，激活巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)CTL成熟，促進(jìn)細(xì)胞免疫應(yīng)答，輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體等。

樹(shù)突狀細(xì)胞主要來(lái)源有小鼠（或大鼠）脾臟、淋巴結(jié)、骨髓，人臍帶血、外周血等。該試驗(yàn)制備的是小鼠的骨髓源樹(shù)突狀細(xì)胞（BMDCs）。實(shí)驗(yàn)室高純度的小鼠骨髓樹(shù)突狀細(xì)胞的成功制備，為臨床上治療疾病奠定了基礎(chǔ)。

1 設(shè)備與材料

1.1 主要儀器設(shè)備

（1）倒置相差顯微鏡37XB，購(gòu)自上海光學(xué)儀器廠(chǎng)。

（2）電子天平FA-N/JA-N，購(gòu)自上海民橋精密儀器公司。

（3）二氧化碳培養(yǎng)箱，購(gòu)自BB15德國(guó)賀利氏公司。

1.2 試驗(yàn)材料

RPMI-1640（Invitrogen）、南美洲胎牛血清（Hyclone）、Mouse IFN-γ（R&D Systems）、Mouse IL-4（R&D Systems）、DMSO（Sigma）HEPES（Amresco）淋巴細(xì)胞分離液-小鼠（lympholyte-M）（上海普飛生物技術(shù)有限公司）

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

BALB/c雄性小鼠（6～8周齡）購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，室溫（23±2） ℃，供給全價(jià)飼料，自由采食、飲水。

2 試驗(yàn)方法

將小鼠脫頸處死，浸于75%的酒精中，無(wú)菌取其股骨，沖洗出其骨髓細(xì)胞，加入Tris-NH4Cl裂解液并室溫作用5 min，裂解紅細(xì)胞，用Hanks液沖洗2次，收集細(xì)胞。使用含10%胎牛血清，rmGM-CSF，IL-4的1640配成細(xì)胞懸液，接種在12孔培養(yǎng)板上，每孔1 mL，置于37 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d。取出培養(yǎng)板，輕搖數(shù)次，棄去懸浮細(xì)胞，再緩慢加入1 mL1640完全培養(yǎng)液，輕晃數(shù)次，洗去殘留非貼壁細(xì)胞。保留貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)板中加入1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至第6天，半量換液并繼續(xù)培養(yǎng)2 d；第8天，收集懸浮細(xì)胞即為小鼠骨髓來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞（BMDCs）。

3 試驗(yàn)結(jié)果

用倒置相差顯微鏡觀察并記錄形狀，結(jié)果表明：培養(yǎng)2～3 d時(shí)逐漸出現(xiàn)細(xì)胞集落，大部分貼壁，細(xì)胞逐漸增大而不規(guī)則；培養(yǎng)到4～5 d時(shí)，有部分BMDCs從集落上脫落懸浮于培養(yǎng)基中，有樹(shù)突狀形態(tài)的突起伸出；培養(yǎng)到6～7 d時(shí)，BMDCs逐漸從細(xì)胞集落上脫落，樹(shù)突狀形態(tài)明顯，分叉增多。見(jiàn)圖1。

培養(yǎng)7 d后，DCs已成熟，流式細(xì)胞儀檢測(cè)證明[2]，CD11c、CD80、MHC高表達(dá)，CD11c作為BMDCs特異性表面分子，證明小鼠骨髓來(lái)源的單個(gè)核細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)可以獲得較高純度的BMDCs。其細(xì)胞表面分子表達(dá)狀況見(jiàn)圖2。

圖1 培養(yǎng)時(shí)間增加DCS的形態(tài)變化

圖2 細(xì)胞表面分子鑒定圖

負(fù)載FMDV VP1蛋白質(zhì)的DC與T細(xì)胞按照1∶5的比例分別培養(yǎng)3、9、24、48 h后，收集共培養(yǎng)物上清液，用ELISA檢測(cè)各組中IFN-γ的含量。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 各組中IFN-γ含量對(duì)比圖

用SPSS軟件統(tǒng)計(jì)分析，共培養(yǎng)3 h后，負(fù)載VP1蛋白質(zhì)的DC與T細(xì)胞共培養(yǎng)組產(chǎn)生IFN-γ的量與兩個(gè)對(duì)照組接近，差異不顯著（P＞0.05）；共培養(yǎng)9 h后，負(fù)載VP1蛋白質(zhì)的DC與T細(xì)胞共培養(yǎng)組產(chǎn)生的IFN-γ分別與對(duì)照組DC+T和DC相比，含量明顯增高，差異極顯著（P＜0.01）；共培養(yǎng)24、48 h后，負(fù)載VP1蛋白質(zhì)的DC與T細(xì)胞共培養(yǎng)組產(chǎn)生IFN-γ的量也高于對(duì)照組DC+T和DC，差異顯著（P＜0.05）。

由圖3可知，在負(fù)載VP1蛋白質(zhì)的DC活化淋巴結(jié)T細(xì)胞過(guò)程中，T細(xì)胞釋放IFN-γ的量要明顯高于對(duì)照組，表明負(fù)載FMDV VP1蛋白的DCs能夠有效激活淋巴結(jié)T細(xì)胞，并表達(dá)高水平的IFN-γ，提取的DCs純度較高。

4 結(jié)論

樹(shù)突狀細(xì)胞有能力刺激初始T細(xì)胞，使其具有向細(xì)胞毒性T細(xì)胞轉(zhuǎn)化的功能，并介導(dǎo)腫瘤的清除；樹(shù)突狀細(xì)胞具有遷徙并浸入腫瘤的功能，因此可直接誘導(dǎo)潛在的T細(xì)胞發(fā)揮有效的免疫功能；樹(shù)突狀細(xì)胞可以同時(shí)提呈一系列不同抗原，引發(fā)全面的抗腫瘤免疫反應(yīng)[3]。

對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞的研究，能更好的解決一些臨床疾病。如研究樹(shù)突狀細(xì)胞最適于腫瘤的免疫治療的類(lèi)型，樹(shù)突狀細(xì)胞負(fù)載抗原能否適用于所有類(lèi)型的腫瘤以及研究在臨床移植中，利用樹(shù)突狀細(xì)胞的細(xì)胞免疫及免疫耐受治療移植排斥及對(duì)抗病毒感染等。