豬輪狀病毒對(duì)小鼠小腸粘膜TLR3表達(dá)的影響

劉北華

（廣東省深圳市寶安區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，深圳 518101）

0 引言

輪狀病毒（Rotavirus，RV）是雙鏈核糖核酸病毒，屬于呼腸孤病毒科。豬輪狀病毒易感于豬的小腸粘膜細(xì)胞，引起小腸絨毛的細(xì)胞損傷，進(jìn)而引發(fā)豬的腹瀉，此外，感染仔豬因腹瀉而生長遲緩對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前對(duì)豬病毒性腹瀉病毒感染特點(diǎn)、免疫應(yīng)答和疫苗開發(fā)研究具有一定的了解，但豬輪狀病毒是腸道病原微生物，其粘膜免疫機(jī)理尚不清楚，使得輪狀病毒感染免疫應(yīng)答的認(rèn)識(shí)還不完全。TLR3可以特異性的識(shí)別雙鏈RNA，雙鏈RNA又是輪狀病毒在復(fù)制期間的中間體，故TLR3可能在抗病毒的免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮一定的作用。

1 概述

1.1 輪狀病毒

輪狀病毒（Rotavirus，RV）是雙鏈核糖核酸病毒，屬于呼腸孤病毒科。輪狀病毒第一次發(fā)現(xiàn)于腹瀉的犢牛糞便中，此后在人、綿羊、豬、馬、犬、貓、鼠及禽類中都有所發(fā)現(xiàn)。仔豬感染豬輪狀病毒后可使仔豬出現(xiàn)嚴(yán)重的腹瀉、厭食等臨床癥狀。感染該病毒的仔豬死亡率變化較大，在0～50%之間。

1.1.1 生物學(xué)特性

輪狀病毒的病毒顆粒略呈圓形，沒有囊膜。輪狀病毒中心由核酸構(gòu)成，輪狀病毒粒子由3層衣殼組成，使得病毒顆粒呈致密的六角形棱心。輪狀病毒有6個(gè)血清型，即A、B、C、D、E、F，但是輪狀病毒的各血清型間沒有抗原相關(guān)性。然而，大部分豬輪狀病毒的血清型屬于C型。

輪狀病毒的體外培養(yǎng)困難，但可在培養(yǎng)基中加入胰酶或胰蛋白酶培養(yǎng)，但在制備原代豬腎細(xì)胞時(shí)須除去胎牛血清接受感染悉生小豬小腸內(nèi)容物的10%無菌濾液，吸附1 h后，將未吸附的殘留的液體倒掉，進(jìn)行培養(yǎng)18～24 h后，用免疫熒光試驗(yàn)檢驗(yàn)有無輪狀病毒顆粒的存在。該病毒感染性不能被乙醚和氯仿滅活，對(duì)環(huán)境因素有抵抗力，對(duì)常用的消毒劑如碘伏、次氯酸有耐受性[1]。

1.1.2 致病性

自然條件下，動(dòng)物之間不太可能發(fā)生輪狀病毒交叉感染，但試驗(yàn)感染時(shí)可以發(fā)生。試驗(yàn)感染低于1周齡的哺乳仔豬時(shí)，仔豬先出現(xiàn)嘔吐癥狀，之后發(fā)生水樣腹瀉，持續(xù)4～5 d，仔豬發(fā)生嚴(yán)重的脫水，最終死亡。豬輪狀病毒感染存在年齡分布的特點(diǎn)，日齡不足2 d的仔豬感染通常死亡；10～12 d感染者出現(xiàn)腹瀉，有的患病動(dòng)物可以康復(fù)；出生后19 d的仔豬感染輪狀病毒后無明顯的癥狀表現(xiàn)。自然狀態(tài)下發(fā)生感染時(shí)，大部分豬群中患病豬大都表現(xiàn)出輕微腹瀉的癥狀。

發(fā)病率和死亡率與輪狀病毒感染數(shù)量、動(dòng)物年齡、母源抗體含量、飼養(yǎng)條件、有無其他病原共同感染或繼發(fā)感染等密切相關(guān)。豬群感染豬輪狀病毒的發(fā)病率較高，在成年豬群中均可檢測(cè)到輪狀病毒的抗體。豬群感染輪狀病毒不具有季節(jié)性，但是干燥季節(jié)和4～20 ℃的環(huán)境容易使豬群感染該病。

1.1.3 免疫

輪狀病毒感染主要侵害的部位是腸道。豬機(jī)體內(nèi)的循環(huán)抗體對(duì)輪狀病毒感染導(dǎo)致的腸道感染病具有保護(hù)性作用，但可以作為豬是否感染該病毒的指示，如果循環(huán)抗體是母源抗體就可以起到一定的保護(hù)作用。小腸粘膜中的腸道相關(guān)淋巴樣組織（GALT）產(chǎn)生的局部抗體可起到保護(hù)腸道、防治感染的作用。當(dāng)輪狀病毒感染腸道絨毛上皮細(xì)胞后，GALT內(nèi)的淋巴細(xì)胞被激活，進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，之后回到隱窩。B淋巴細(xì)胞在GALT中分化為能夠產(chǎn)生輪狀病毒抗體的效應(yīng)性B細(xì)胞，效應(yīng)性B細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的抗體（IgA），并分泌到腸腔中中和輪狀病毒，阻止病毒侵害小腸的正常組織。動(dòng)物試驗(yàn)中，試驗(yàn)感染豬群后5～10 d內(nèi)便可以在血液中檢測(cè)到輪狀病毒抗體。感染后14～21 d用同種病毒攻擊可提供足夠保護(hù)作用[2]。哺乳仔豬的腸道中存在高水平的母源抗體，這些抗體中主要是IgA，IgA可保護(hù)腸道免受輪狀病毒的感染。

1.2 Toll樣受體

Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR），是一種可以參與天然免疫的重要蛋白分子，TLR也可以起到連接非特異性免疫和特異性免疫的作用。TLR可以識(shí)別出病原微生物所攜帶的特殊抗原決定，當(dāng)病原微生物突破機(jī)體的皮膚、粘膜侵害機(jī)體時(shí)，TLR就可以識(shí)別這些病原體并激活機(jī)體的免疫應(yīng)答。目前，Toll樣受體有13種已經(jīng)確認(rèn)，這些受體基本存在于哺乳動(dòng)物巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞以及某些組織上皮細(xì)胞表面，這些Toll樣受體中與病毒感染有關(guān)的TLRs有TLR2、TLR3、TLR4、TLR7以及TLR9。當(dāng)TLR識(shí)別并結(jié)合病原體的抗原簇后就會(huì)激活下級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)增加，誘導(dǎo)下一步反應(yīng)中的抗微生物分子、細(xì)胞因子、刺激分子等相關(guān)物質(zhì)的表達(dá)增加，這些物質(zhì)的表達(dá)增加會(huì)繼續(xù)激活天然免疫和獲得性免疫，產(chǎn)生特定的效果對(duì)機(jī)體起到保護(hù)作用[3]。

1.3 Toll樣受體3

Toll樣受體3（TLR3）可以特異性的識(shí)別病毒的雙鏈RNA，而豬輪狀病毒在復(fù)制時(shí)可以產(chǎn)生雙鏈RNA，TLR3可能會(huì)識(shí)別這些雙鏈RNA進(jìn)而在抗病毒的免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要功能。TLR3主要表達(dá)具有抗原呈遞的細(xì)胞內(nèi)如樹突狀細(xì)胞，識(shí)別病毒的核糖核酸部分。TLR3在動(dòng)物中不同組織和細(xì)胞的分布特點(diǎn)中存在差異性。較多的病毒復(fù)制時(shí)可產(chǎn)生dsRNA，這些dsRNA又能夠被TLR3捕獲并識(shí)別，進(jìn)而激活I(lǐng)型干擾素（IFN-α/β）的表達(dá)。TLR3識(shí)別病毒的雙鏈RNA后，便會(huì)誘導(dǎo)NF-κB和IFN-（α/β）的基因表達(dá)增加，這樣便會(huì)導(dǎo)致促炎性細(xì)胞因子及輔助刺激因子的釋放增高。TLRs/ NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在引發(fā)機(jī)體炎癥和免疫應(yīng)答的過程中起到不可替代的作用[4]。該信號(hào)通路激活后大量的炎性介質(zhì)釋放，在這些炎性介質(zhì)中，IFN-γ是一種重要的抗病毒細(xì)胞因子，IFN-γ能夠抵抗輪狀病毒在小腸粘膜細(xì)胞中的復(fù)制。

1.4 冰凍組織切片

冰凍組織切片是在低溫的作用下使組織達(dá)到一定的硬度后進(jìn)行切片的技術(shù)。冰凍切片較石蠟切片相比，制作過程更加簡便、快捷，在切片的制作過程中不需要進(jìn)行包埋、烤干等處理，卻可以很好的保護(hù)組織抗原和酶的活性不受損傷，因而冰凍組織切片較多的應(yīng)用于HE染色、免疫組織化學(xué)、免疫熒光等病理診斷和醫(yī)學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的研究。制作出的高質(zhì)量冰凍組織切片能夠保證試驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)可靠[5]。

1.5 免疫組織化學(xué)技術(shù)

免疫組織化學(xué)技術(shù)（Immunohistochemistry ，IHC）指的是用標(biāo)記物標(biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞抗原結(jié)合，對(duì)特定的抗原作出定性、定位和定量檢測(cè)的一門生物學(xué)技術(shù)。免疫組化技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，而又可將形態(tài)與功能的研究相聯(lián)系。其所用材料為組織切片和細(xì)胞爬片兩類，其中組織切片的制作最常用并且最基本的方法是石蠟組織切片[6]。石蠟組織切片可以長期保存樣本組織的形態(tài)，這種特點(diǎn)有利于各種試驗(yàn)的染色對(duì)照觀察，但是石蠟組織切片制作中會(huì)使用甲醛固定液，經(jīng)過甲醛固定液的組織會(huì)影響抗原的暴露，利用石蠟組織切片時(shí)需要進(jìn)行免疫組化，試驗(yàn)前需要進(jìn)行抗原修復(fù)以暴露抗原。然而冰凍組織切片在抗原保護(hù)上優(yōu)于石蠟組織切片，冰凍組織切片可以良好的保護(hù)組織或細(xì)胞的抗原活性，特別是在科研實(shí)驗(yàn)的免疫組化中，冰凍組織切片可以標(biāo)記出那些在石蠟切片上無法顯示出來的抗原組織。鑒于這種優(yōu)勢(shì)使得冰凍組織切片也成為免疫組織化技術(shù)中經(jīng)常采用的切片制作方法[7]。

1.6 免疫組化SP法

鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶（Streptavidin-Peroxidase，SP）連接體系指的是一種用來檢測(cè)組織或細(xì)胞中特定抗原的一種免疫組織化學(xué)技術(shù)方法[8]，即SP法（Streptavidin-Peroxidase Method）。霉菌抗生物素蛋白（SA）是從鏈霉菌中分離提取出的一種蛋白，這種蛋白具有穿透組織能力強(qiáng)，反應(yīng)速度快的特點(diǎn)，霉菌抗生物素蛋白幾乎不與組織的內(nèi)源性凝集樣物質(zhì)發(fā)生非特異性結(jié)合，因而，利用該連接體系形成的SP法可以制作出低背景、高放大效果并且清晰的免疫組化切片[9]。免疫組化SP法相比其他的PAP、ABC法，操作更加簡便，得出的檢測(cè)結(jié)果具有高敏感性和高特異性等優(yōu)點(diǎn)。免疫組化SP染色法原理見圖1。

圖1 免疫組化SP染色法原理

1.7 目的與意義

豬輪狀病毒是一種常見的引起仔豬腹瀉的病毒，感染途徑多以患病豬排泄出的糞便進(jìn)行傳播，經(jīng)其他健康豬舔食而感染[10]。該病毒感染時(shí)，小腸上皮細(xì)胞最易受到損害，臨床表現(xiàn)出嚴(yán)重的腹瀉。輪狀病毒每年在夏秋冬季流行，患病豬的治療費(fèi)用、豬群高患病率與高死亡率都會(huì)造成高的經(jīng)濟(jì)損失[11]。因此，研究機(jī)體對(duì)于該病毒的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制中對(duì)TLR3的影響具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，并且為制定合理的預(yù)防措施提供重要理論依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 材料

BALB/c小鼠

MA-104細(xì)胞系培養(yǎng)的豬輪狀病毒DN30209，病毒滴度為1×107TCID

2.1.1 實(shí)驗(yàn)器材

冷凍切片機(jī) 德國徠卡微系統(tǒng)有限公司

黏附載玻片 福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司

蓋玻片 鹽城市弘達(dá)醫(yī)學(xué)器材有限公司

DAB顯色試劑盒 福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司

UltraSensitiveTMS-P免疫組化染色試劑盒 福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司

1 mL注射器 江蘇正康醫(yī)療器械有限公司

徠卡DM500雙目顯微鏡 德國徠卡微系統(tǒng)有限公司

恒溫培養(yǎng)箱 上海姚氏儀器設(shè)備廠

移液器 德國艾本德股份公司

分析天平 南京萊步科技實(shí)業(yè)有限公司

高壓蒸汽滅菌鍋 山東博科科學(xué)儀器有限公司

2.1.2 藥品與試劑

抗TLR3抗體 美國abcam抗體公司

冰凍切片包埋劑 德國徠卡微系統(tǒng)有限公司

丙酮 北京化工廠

無水乙醇 北京化工廠

二甲苯 北京化工廠

中性樹膠 中國上海標(biāo)本模型廠

蘇木精染色液 南昌雨露實(shí)驗(yàn)器材有限公司

濃鹽酸 北京化工廠

無水氯化鈉 北京化工廠

無水氯化鉀 北京化工廠

十二水合磷酸氫二鈉 北京化工廠

磷酸二氫鉀 北京化工廠

2.2 方法

2.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)采用BALB/c小鼠，實(shí)驗(yàn)分為兩組，一組為空白對(duì)照組，設(shè)置小鼠3只，每只灌服PBS緩沖液100 uL；另一組為實(shí)驗(yàn)組，設(shè)置3只小鼠，每只小鼠灌服100 uL病毒液?？诜?8 h后準(zhǔn)備進(jìn)行樣本的采集[12]。

2.2.2 儀器準(zhǔn)備

冰凍切片機(jī)使用前設(shè)置速凍臺(tái)為-25 ℃，冰凍箱為-20 ℃，切片厚度為在4 μm；恒溫箱設(shè)置溫度到37 ℃[13]。

2.2.3 試劑的準(zhǔn)備

2.2.3.1 豬輪狀病毒液的配置

采用MA-104細(xì)胞系培養(yǎng)的豬輪狀病毒DN30209，病毒滴度為1×107TCID。

解凍準(zhǔn)備灌服小鼠；丙酮放入冰箱進(jìn)行4 ℃預(yù)冷。

2.2.3.2 PBS緩沖液的配置

用分析天平分別稱取無水氯化鈉8 g、無水氯化鉀0.2 g、十二水合磷酸氫二鈉3.63 g、磷酸二氫鉀0.24 g放入1 L的容量瓶中溶解后[14]，加入蒸餾水900 mL混勻，并調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4，然后再加蒸餾水定容至1 L。移液至其他容器中，高溫高壓120 ℃，15 min后，常溫保存。

2.2.3.3 DAB染色液的配置

從冰箱中取出DAB顯色試劑盒，在1 mL的離心管中先加入850 uL的蒸餾水，再按試劑A、B、C 的順序依次加入試劑各50 uL（約1滴），混勻即可，配制成DAB顯色工作液，若出現(xiàn)沉淀可過濾后使用。配制好的工作液避光放置，工作液必須在30 min內(nèi)使用，超過后棄用[15]。

2.2.3.4 第一抗體的稀釋

從冰箱中取出采購的第一抗解凍，根據(jù)一抗使用說明書，按1∶5 000進(jìn)行稀釋。吸取1 uL抗體原液加入到999 mL PBS緩沖液中做1∶1 000的稀釋，吹打混勻。然后再取100 uL加入到400 uL的PBS緩沖液中做1∶5稀釋，吹打混勻，最后得到500 uL做1∶5 000稀釋的抗體工作液，放入4 ℃可保存1～2周[16]。

2.2.3.5 梯度酒精的配置

吸取25 mL蒸餾水與75 mL的無水酒精混勻后，即可配制成75%的酒精溶液，按同樣的方法配置85%和95%的酒精溶液。

2.2.3.6 鹽酸酒精分色液的配制

95%的酒精吸取出100 mL與1 mL的38%的濃硫酸混合后，即可配制成試驗(yàn)所需要的鹽酸酒精分色液。

2.2.4 冰凍切片的制作

將實(shí)驗(yàn)小鼠脊椎脫臼處死，切開腹部皮膚及肌肉，找到小腸的空腸段并截取1 cm左右，小心的夾住一段豎直放入包埋盒中，并倒入包埋液直至完全包埋住，迅速放入冰凍切片機(jī)的速凍臺(tái)上進(jìn)行速凍，10 min左右即可，若包埋塊還發(fā)軟需繼續(xù)進(jìn)行冷凍并適當(dāng)降低切片機(jī)內(nèi)的溫度[17]。速凍好的包埋塊剝?nèi)ネ鈱渝a紙后將組織按在包埋架上并繼續(xù)進(jìn)行速凍5 min左右，之后將其夾在切片機(jī)的機(jī)頭上。放下護(hù)刀架，使樣本向刀架方向移動(dòng)。將刀架底座沿著滑槽向遠(yuǎn)離操作者的方向移動(dòng)到快要接觸到樣本，順時(shí)針旋轉(zhuǎn)柄輪一圈后，即可切除出一張切片，切到樣品位置時(shí)，放下防卷板再次切片。當(dāng)切到所需厚度的切片時(shí)，掀開玻璃防卷板用黏附性載玻片快速輕靠到切片上，切片立即附著在載玻片上，根據(jù)組織大小可在一張載玻片上多黏附幾塊組織，之后將粘有組織的載玻片自然晾干或者放入-20 ℃的冰箱中冷藏備用[18]。

2.2.5 免疫組化SP法操作方法

（1）冰凍切片晾干后，放入4 ℃的丙酮中浸泡處理10 min進(jìn)行組織固定。

（2）切片室溫下晾置10 min，這樣可以使殘留在組織上的丙酮揮發(fā)，以防止丙酮的干擾，再把切片用PBS緩液洗3次，每次5 min左右。

（3）傾倒去除切片上多余的PBS緩沖液，在每張切片滴加1滴過氧化酶阻斷溶液，室溫下靜置反應(yīng)10 min后，繼續(xù)用PBS緩沖液對(duì)切片進(jìn)行沖洗，每次沖洗3次，每次5 min左右。通過過氧化酶阻斷劑的處理可以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，以防止內(nèi)源性過氧化物酶的干擾，使得背景很深[19]。

（4）傾倒或甩去切片上多余的PBS緩沖液后，每張切片滴加1滴正常非免疫動(dòng)物血清，輕微振蕩切片使液體均勻覆蓋在切片上，放入恒溫箱中，37 ℃下靜置孵育10 min。

（5）除去組織上的血清，不用PBS緩沖液沖洗，滴加1滴第一抗體工作液，放入恒溫箱37 ℃孵育1.5 h。

（6）每張切片繼續(xù)用PBS緩沖液洗，每次沖洗次數(shù)為3次，每次沖洗時(shí)間為5 min左右。切片傾倒或甩去多余的殘留在切片上的PBS緩沖液，此時(shí)，滴加1滴生物素標(biāo)記的第二抗體，然后放置在室溫下靜置孵育10 min后，用PBS緩沖液繼續(xù)沖洗，每次沖洗次數(shù)為3次，每次沖洗時(shí)間為5 min左右[20]。

（7）傾倒或者甩去切片上多余存在的PBS緩沖液，每張切片滴加1滴鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液，放置在室溫下靜置反應(yīng)10 min后，用PBS緩沖液洗，每次沖洗3次，每次沖洗時(shí)間為5 min左右。

（8）傾倒或者甩去片上多余殘存的PBS緩沖液，然后滴加100 uL左右新鮮配制的DAB顯色液于切片上的組織，在顯微鏡下觀察或者肉眼觀察3～8 min，根據(jù)顯色變化的情況進(jìn)行終止顯色反應(yīng)[21]。

（9）終止反應(yīng)時(shí)，用自來水沖洗或者浸泡去除殘余在切片上的DAB顯色液，之后將切片浸泡或者滴加蘇木素染色液，避光染色8 min，輕微擦拭組織旁殘存的染色液，放入到鹽酸酒精分色液中涮洗5 s進(jìn)行分色，然后再放入到自來水中浸泡10 min，進(jìn)行返藍(lán)的操作。

（10）返藍(lán)處理后切片需要進(jìn)行梯度酒精脫水干燥的操作，該操作包括先浸入75%酒精2 min；擦去殘留的多余酒精后，再浸入85%酒精2 min，擦去殘留的多余酒精，再浸入95%酒精2 min，擦去殘留的多余酒精，再浸入無水酒精Ⅰ3 min，繼續(xù)浸入無水酒精Ⅱ3 min處理[22]，完成脫水的操作。

（11）脫水干燥后需要進(jìn)行組織透明的處理，此步驟需要應(yīng)用二甲苯透明，在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，先將切片浸入二甲苯Ⅰ中5 min，然后再浸入二甲苯Ⅱ中5 min，進(jìn)行透明處理。

（12）中性樹膠封片。取出干凈的蓋玻片，在做好的切片組織旁滴加一滴中性樹膠（樹膠用前可先與二甲苯1∶1稀釋）后，用蓋玻片傾斜覆蓋在組織上，進(jìn)行封片。

（13）封好的切片放入恒溫箱中，37 ℃烤片1～2 h即可在顯微鏡下觀察[23]。

2.2.6 切片觀察與判讀

2.2.6.1 人工計(jì)數(shù)分析

人工分析時(shí)以細(xì)胞膜或細(xì)胞胞質(zhì)并伴有少量胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒就可以判定為陽性細(xì)胞[24]。將做好的免疫組化切片放到已經(jīng)調(diào)節(jié)好的顯微鏡下進(jìn)行觀察，并調(diào)整到合適的倍數(shù)，首先對(duì)觀察到的切片中圖像的染色強(qiáng)度進(jìn)行打分：切片圖像顯示為藍(lán)色則判定為0分；組織中出現(xiàn)淺黃色顆粒時(shí)為1分；當(dāng)組織中出現(xiàn)棕黃色顆粒著色時(shí)為2分；當(dāng)組織中的細(xì)胞著色有棕褐色顆?？捎?jì)為3分。對(duì)已染色的組織進(jìn)行染色強(qiáng)度與背景著色的比較，這在判定打分的操作過程中能夠做到準(zhǔn)確的判定[25]。

染色強(qiáng)度判定操作后，再按發(fā)生著色的陽性細(xì)胞在所有細(xì)胞中的百分比進(jìn)行打分操作的處理，0分為陰性，即不存在著色的細(xì)胞出現(xiàn)；當(dāng)陽性細(xì)胞占比＜15%時(shí)可計(jì)為1分；當(dāng)陽性細(xì)胞16%～50%時(shí)可計(jì)為2分；當(dāng)陽性細(xì)胞占51%～75%時(shí)可判定該張切片的分?jǐn)?shù)為3分；組織中的陽性細(xì)胞占比＞75%時(shí)，可認(rèn)為該張切片為4分[26]。

結(jié)果分析過程中，每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野，每個(gè)視野在400倍放大的顯微鏡下觀察，每個(gè)采集到的視野都要進(jìn)行陽性細(xì)胞在所有細(xì)胞中的占比計(jì)分與染色強(qiáng)度判定打分，對(duì)兩次判定結(jié)果進(jìn)行相加處理[27]。0分計(jì)為陰性（-）；1～2分判定為弱陽性（+）；3～4分為中等陽性（++）；5分以上判定為強(qiáng)陽性（+++）。

2.2.6.2 圖像分析方法

圖像分析方法（Image analysis）是通過數(shù)碼相機(jī)對(duì)切片染色結(jié)果進(jìn)行圖像拍照采集后，利用相關(guān)軟件進(jìn)行分析的方法。圖像結(jié)果采集使用配備拍照功能的數(shù)碼顯微鏡進(jìn)行拍攝，采取免疫組化切片的結(jié)果[28]。首先將切片放置到顯微鏡上并調(diào)到合適的倍數(shù)（×400）后獲得清晰圖像，打開 Motic Images Advanced 4.0系統(tǒng)，通過在采集窗的操作進(jìn)行圖像捕捉，記錄試驗(yàn)切片的結(jié)果，并對(duì)每張切片隨機(jī)拍照5個(gè)視野。捕捉圖像采用美國Media Cybernetics公司研發(fā)的圖像分析軟件Image-Pro Plus（Version 6.0）進(jìn)行圖像分析。用軟件對(duì)捕獲的圖像進(jìn)行相對(duì)灰度值的測(cè)定，記錄所有圖像的灰度值，最后該切片的圖像分析結(jié)果有5次結(jié)果的均值作為該切片的灰度值測(cè)定結(jié)果[29]。

通過拍攝切片采集到的圖像用軟件分析后的結(jié)果用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（±S）表示；圖像的灰度值與人工判定間的關(guān)系采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析兩者之間的相關(guān)性，該步驟的操作有助于保證兩種分析方法對(duì)結(jié)果判定的準(zhǔn)確性和可靠性，其中分析的結(jié)果（P＜0.05）有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 切片圖像采集結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的對(duì)比可以看出，實(shí)驗(yàn)組中，在小腸微絨毛中出現(xiàn)了較多的黃褐色顆粒，且較多的出現(xiàn)在細(xì)胞膜上，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)較少[30]。可見圖2、圖3、圖4與圖5。

圖2 對(duì)照組小腸絨毛TLR3，SP法，×400

圖3 對(duì)照組小腸絨毛TLR3， SP法，×400

圖4 實(shí)驗(yàn)組小腸絨毛TLR3表達(dá)SP法，×400

圖5 實(shí)驗(yàn)組小腸絨毛TLR3表達(dá)， SP法，×400

3.2 人工計(jì)數(shù)結(jié)果

人工判定結(jié)果按照判定標(biāo)準(zhǔn)判定，實(shí)驗(yàn)組攻毒病毒的小鼠空腸組織中TLR3的表達(dá)呈中到強(qiáng)陽性者多于對(duì)照組，見表1。

表1 人工計(jì)數(shù)結(jié)果 單位：個(gè)

3.3 圖像分析結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組攻毒小鼠空腸組織中的TLR3陽性細(xì)胞的平均灰度值、陽性細(xì)胞在所有細(xì)胞中的百分比明顯高于對(duì)照組，此結(jié)果見表2。

表2 圖像分析結(jié)果

3.4 灰度與人工判定結(jié)果的相關(guān)性

根據(jù)兩種判定結(jié)果進(jìn)行灰度值與人工分析結(jié)果間的相關(guān)性分析，結(jié)果見表3，通過表中人工計(jì)數(shù)方法與圖像分析的結(jié)果可以判斷，在該試驗(yàn)分析中是比較符合的。

表3 各相關(guān)系數(shù)比較

4 結(jié)束語

豬輪狀病毒在豬群中的感染率比較高，感染仔豬因腹瀉而導(dǎo)致生長遲緩，對(duì)畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，這也是困擾養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的難題之一[31]。目前對(duì)豬輪狀病毒感染的特點(diǎn)、免疫反應(yīng)和疫苗開發(fā)做了大量的研究工作，但豬輪狀病毒屬于易于感染豬腸道的病原微生物，主要損害小腸絨毛的腸黏膜細(xì)胞，進(jìn)而改變上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，其粘膜免疫機(jī)理尚不清楚，對(duì)輪狀病毒感染免疫應(yīng)答的認(rèn)識(shí)還不完全，通過該試驗(yàn)，應(yīng)用豬輪狀病毒攻毒小鼠觀察對(duì)小鼠小腸粘膜中TLR3的表達(dá)影響，結(jié)果表明：感染病毒后的小鼠小腸粘膜中TLR3的表達(dá)明顯升高，通過對(duì)免疫組化切片的觀察，可以發(fā)現(xiàn)TLR3主要表達(dá)于這些細(xì)胞的細(xì)胞膜上，這些細(xì)胞很可能是具有抗原呈遞功能的樹突狀細(xì)胞遷移到微絨毛進(jìn)行抗原捕獲，發(fā)揮抗原呈遞的功能，調(diào)節(jié)免疫功能。