LncRNA HAGLR表達與前列腺癌預后的相關性分析

向宸輝，劉小勇，陳勝龍，王鵬橋

前列腺癌（PCa）是男性群體中最高發(fā)的惡性腫瘤，同時也是發(fā)達國家第2大致死性腫瘤[1]。絕大多數(shù)的PCa患者可在早期診斷后，實施包括根治性前列腺切除術等治療，可獲得較好的治療效果[2]。然而，仍然存在部分患者術后腫瘤復發(fā)的情況，其表現(xiàn)為持續(xù)性的前列腺素特異抗原（PSA）的水平持續(xù)上升或出現(xiàn)腫瘤遠端轉移。因此，研究與PCa復發(fā)有關的分子生物學機制，尋找與PCa復發(fā)相關的重要生物標志物，是目前治療PCa的關鍵。

長鏈非編碼RNA（LncRNA）為長度大于200 nt的非蛋白編碼的RNA，其編碼基因廣泛存在于生物基因組中，并在多種基因的調控中發(fā)揮重要作用[3-4]。其中，HAGLR是目前研究較多的LncRNA之一，其編碼基因位于2號染色體長臂，屬于HOX基因家族成員，是調控生長發(fā)育的重要基因[5]。有研究表明，HAGLR參與腫瘤的發(fā)生及轉移過程，并與患者的預后緊密相關，可能作為評估腫瘤患者預后的潛在生物學指標[6-7]。

本次研究采用實時熒光定量PCR技術（qRTPCR），檢測HAGLR在前列腺癌及癌旁組織中的表達差異，并分析HAGLR與患者臨床病例資料和預后的關系，以探討HAGLR與前列腺癌發(fā)病的相關性及其作為前列腺癌患者預后生物標記物的可能。

1 資料與方法

1.1 資料來源 收集2009年1月～2011年12月于筆者科室行手術切除并保存的PCa組織和配對瘤旁正常前列腺組織標本共96份，以及患者的臨床病例資料，包括年齡、Gleason評分、腫瘤分期、術前血清PSA濃度、內分泌治療情況、術前放療、預后等。所有PCa組織及配對癌旁組織于術中切除后立即放于液氮中速凍，后轉入-80℃保存，用于qRT-PCR逆轉錄聚合酶鏈實驗；患者隨訪時間為術后至2017年12月31日。

1.2 HAGLR表達水平檢測 取100 mg凍存PCa組織或配對瘤旁正常前列腺組織標本，放入研磨器中，加入1 ml Trizol液，研磨后靜置5 min，提取總RNA。取5 μl總 RNA，行瓊脂糖凝膠電泳，以檢測RNA完整性。按照逆轉錄試劑盒（Takara公司）說明書方法，用以合成cDNA，后放于-80℃保存。引物由北京擎科新業(yè)生物技術有限公司合成。參考SYBR GreenⅠ（美國Thermo Fisher公司）說明書配制反應體系，取cDNA進行qRT-PCR。qRT-PCR結果解讀：△Ct=樣本 Ct平均值-內參 Ct平均值；△△Ct=△Ct-（陰性對照樣品 Ct平均值-內參 Ct平均值）；2-△△Ct表示基因相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法應用SPSS 19.0軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以±s表示比較，采用t檢驗；計數(shù)資料以頻數(shù)和百分率表示，采用χ2檢驗；Kaplan-Meier法分析生存差異，組間比較采用Log-rank法；Cox回歸分析復發(fā)相關因素，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 患者基本臨床資料 共納入96例PCa患者，平均年齡（63.80±8.79）歲；PSA 濃度＜10 ng/ml者80例、≥10 ng/ml者16例；Gleason評分＜7分者55例，≥7分者41例；8例于術后行內分泌治療，2例術后行放射治療；76.0%患者處于TNMⅠ期。見表1。

患者基本臨床資料（n=96）

表1

2.2 HAGLR表達與患者臨床病例特征的相關性

qRT-PCR檢測結果顯示，腫瘤組織HAGLR表達水平顯著高于癌旁正常前列腺組織（P＜0.01）。見圖1。

2.3 HAGLR表達與患者預后的相關性 Log-rank檢驗結果顯示（圖2），HAGLR的表達水平會影響PCa患者的無復發(fā)生存率（RFS）；Cox回歸分析顯示，Gleason評分≥7、TNM分期為Ⅱ～Ⅳ期、HAGLR高表達均是影響PCa患者RFS的獨立危險因素（P＜0.05）。

圖1 PCa及癌旁組織HAGLR檢測結果

圖2 不同HAGLR表達水平PCa患者RFS比較

3 討論

隨著基因組學研究的不斷深入，了解到基因組序列中只有2%的基因被翻譯成蛋白質，而大部分基因被轉錄為非編碼RNA[10]。作為非編碼RNA重要的一環(huán)，LncRNA曾被認為是基因組轉錄的噪聲，無生物學功能，但許多研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA與多種腫瘤密切相關。在肝癌中，LncRNA TSLNC8通過競爭性地與轉酮醇酶（TKT）以及信號傳導與轉錄激活因子3（STAT3）相結合，介導STAT3磷酸化及其編碼基因的轉錄活性，抑制IL-6/STAT3信號通路，從而影響肝癌細胞的增殖[11]。在肺癌中，LncRNA IGFBP4-1通過調控腫瘤細胞的能量代謝過程，影響肺癌細胞的增殖與侵襲能力[12]。這些研究結果表明，LncRNA具有成為腫瘤治療潛在靶點的可能。

HOX基因在腫瘤細胞各種生理過程中發(fā)揮著重要的作用，如調控細胞凋亡、受體信號轉導和細胞分化[13]。HAGLR作為HOX基因家族成員之一，同樣參與腫瘤的調控。目前的研究顯示，HAGLR在神經(jīng)膠質瘤、膀胱癌、胃癌等多種腫瘤中表達上調[6，14，15]。 而干擾 HAGLR 的表達，能顯著抑制腫瘤細胞系的增殖，證明其促癌基因的角色。目前研究發(fā)現(xiàn)，其致癌作用存在多種機制，Li等[15]發(fā)現(xiàn)，在胃癌細胞系，HAGLR的表達明顯上升，而通過抑制HAGLR表達，發(fā)現(xiàn)酪氨酸蛋白激酶2（JAK2）與STAT3的磷酸化水平明顯下降，提示HAGLR通過JAK2/STAT3通路促進胃癌細胞的增殖與遷移。同時有報道[7]，HAGLR可通過調節(jié)脂酸合成酶的活性，而誘導非小細胞肺癌（NSCLS）的發(fā)生。

本研究發(fā)現(xiàn)，PCa腫瘤的HAGLR表達水平顯著高于癌旁組織，推測其與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程相關。通過比較不同臨床病例特征患者的HAGLR表達水平，發(fā)現(xiàn)HAGLR的表達與Gleason評分（＜7 vs.≥7）、伴或不伴有血管侵犯以及不同TNM分期有關，Gleason評分越高，發(fā)生血管侵犯，TNM分期越高，HAGLR的表達水平也明顯增高，而與血清PSA濃度、包膜外侵犯及淋巴轉移無關，提示HAGLR與腫瘤的增殖分化相關。此外，生存分析結果顯示，HAGLR的表達與患者的RFS高度相關，低表達HAGLR的患者的RFS明顯優(yōu)于高表達HAGLR的患者，表明HAGLR與PCa患者術后復發(fā)高度相關。進一步Cox回歸分析顯示，Gleason評分≥7、TNM分期為Ⅱ～Ⅳ期、HAGLR高表達是影響PCa患者RFS的獨立危險因素。以上結果提示，HAGLR可作為判斷PCa患者復發(fā)的生物學指標。

綜上所述，HAGLR的表達水平顯著高于癌旁組織，且與PCa患者的預后密切相關；HAGLR可作為評估PCa患者預后的潛在指標，檢測HAGLR有助于PCa早期復發(fā)的診斷，對發(fā)現(xiàn)PCa的治療新靶點及預后評估方法提供了新思路。