響應面法優(yōu)化超聲輔助提取甘薯葉多酚工藝

田燕楠,鐘耀廣,2,3,4,5*

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響應面法優(yōu)化超聲輔助提取甘薯葉多酚工藝

田燕楠1,鐘耀廣1,2,3,4,5*

1. 上海海洋大學食品學院, 上海 201306 2. 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心, 上海 201306 3. 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風險評估實驗室(上海), 上海 201306 4. 國家淡水水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)分中心(上海), 上海 201306 5. 食品科學與工程國家級實驗教學示范中心(上海海洋大學), 上海 201306

采用超聲波輔助的方法提取甘薯葉中多酚，并利用響應面法對多酚提取工藝進行優(yōu)化。在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken中心組合法研究乙醇體積分數(shù)、料液比、超聲時間、超聲溫度對甘薯葉多酚得率的影響，建立了該工藝的二次多項數(shù)學模型。結(jié)果表明，甘薯葉總多酚最佳提取工藝條件為：乙醇體積分數(shù)80%，料液比1:22(g/mL)，超聲數(shù)間47 min，超聲溫度65 ℃，在此工藝條件下，甘薯葉總多酚得率可達到（15.80±0.014）mg/g，與預測值15.83 mg/g基本相符。

甘薯葉; 總多酚; 超聲提取; 響應面法

甘薯葉是甘薯在生長過程中地上秧莖頂端的葉子[1]，甘薯葉中含有豐富的營養(yǎng)成分及活性物質(zhì)，是天然的營養(yǎng)保健蔬菜，可降低膽固醇，提高人體免疫力，防止心血管脂肪沉積，有抗癌蔬菜的美稱[2,3]。甘薯葉中的主要活性成分為多酚類物質(zhì)，具有清除自由基、抗癌、降低膽固醇、抑菌的作用[4,5]，而甘薯葉中的總酚含量約為菠菜、油菜、卷心菜等常見蔬菜的2~3倍[4]。我國甘薯莖葉資源相當豐富，但是大部分薯藤被當做動物飼料或當做廢棄物丟棄，造成資源浪費和環(huán)境污染[6]。

超聲波輔助提取法因其操作簡便、設備簡單、提取時間短、提取得率高等優(yōu)點已廣泛應用于植物活性成分的提取[7,8]。其原理是利用超聲波機械熱震動，產(chǎn)生瞬時的高溫和高壓促使細胞壁破解，使其內(nèi)含物質(zhì)溶出與溶劑充分接觸，從而增加提取物的得率[9,10]。響應面法是一種優(yōu)化復雜過程的統(tǒng)計技術(shù)，可以通過回歸方程和直觀圖形分析，高效全面的對實驗進行分析[11,12]。Johnson等[13]研究發(fā)現(xiàn)在西蒙1號甘薯葉中清除自由基的主要物質(zhì)是多酚類化合物，并且抗氧化活性與多酚含量存在明顯的正相關(guān)性。Dini I等[14]對甘薯葉中酚類進行分離鑒定，得到6種咖啡酸及其衍生物，證明這些化合物具有抗突變的作用。目前，甘薯葉的研究主要集中在化學成分、生物學特性等方面[15]，對甘薯葉多酚的提取研究和報道甚少，目前還未發(fā)現(xiàn)用超聲輔助提取甘薯葉中多酚的報道。

本實驗是通過超聲輔助提取法，在單因素試驗基礎上考察乙醇體積分數(shù)、料液比、超聲時間、超聲溫度對多酚得率的影響，結(jié)合響應面法對多酚提取工藝進行優(yōu)化，以期得到多酚提取的最佳工藝，獲得更多的多酚物質(zhì)，為甘薯葉資源的進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘薯葉：2016年9月購于上海浦東新區(qū)臨港早市，洗凈控干70 ℃烘干粉碎，過40目篩，甘薯葉粉密封在自封袋中置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

綠原酸標準品：上海源葉生物科技有限公司；福林酚試劑（BR）、碳酸鈉（AR）、無水乙醇（AR）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

分析天平（CPA124S）:賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；分光光度計（UV2300）:上海元析儀器有限公司；數(shù)控超聲波清洗機（DS-351ODT11）:寧波新芝生物科技有限公司；臺式高速離心機（TGL-16G）:上海安亭科學儀器廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（R250B）:上海申生科技有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-S）:金壇市正基儀器有限公司；鼓風干燥箱(DGG-9203AD):上海森信實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 甘薯葉多酚的提取準確稱取一定量甘薯葉粉，加入一定量的浸提液（乙醇溶液），放入超聲清洗器中在不同條件下浸提甘薯葉多酚，20 ℃條件下3500 g離心10 min，收集上清液，殘渣按照上述方法重復提取兩次，合并兩次上清液，40 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，得到甘薯葉多酚粗提液，用去離子水定容至50 mL。

1.3.2 甘薯葉多酚含量的測定采用福林酚比色法[5]測定。取1 mL甘薯葉多酚提取液，加入2.0 mL10%的福林酚試劑，30 ℃避光水浴保溫30 min后加入4 mL10%（w/v）碳酸鈉溶液，繼續(xù)30 ℃避光水浴保溫30 min，在740 nm處測量吸光度。以綠原酸為標樣，制作標準曲線，以標準溶液的質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標，得到標準曲線方程：=8.94+0.048，2=0.9995。甘薯葉多酚得率按公式（1）計算：多酚得率（mg/g）=12/3(1)

式中：1為總多酚質(zhì)量濃度(mg/mL)；2為提取液定容體積（mL）；3為提取前莖葉粉末質(zhì)量（g）。

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 乙醇體積分數(shù)的選擇稱取甘薯葉粉末10.0 g，按料液比1:10的比例分別加入體積分數(shù)為60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液，30 ℃超聲輔助提取30 min，測定不同乙醇體積分數(shù)條件下的甘薯葉多酚得率。

1.3.3.2 料液比的選擇稱取甘薯葉粉末10.0 g，乙醇體積分數(shù)由1.3.3.1確定，料液比為1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35，30 ℃超聲輔助提取30 min，測定不同料液比條件下的甘薯葉多酚得率。

1.3.3.3 超聲時間的選擇稱取甘薯葉粉末10.0 g，乙醇體積分數(shù)由1.3.3.1確定，料液比由1.3.3.2確定，30 ℃超聲輔助，分別提取15 min、30 min、45 min、60 min、75 min，測定不同超聲時間下的甘薯葉多酚得率。

1.3.3.4 超聲溫度的選擇稱取甘薯葉粉末10.0 g，乙醇體積分數(shù)由1.3.3.1確定，料液比由1.3.3.2確定，超聲時間由1.3.3.3確定，超聲溫度20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃，測定不同溫度條件下的甘薯葉多酚得率。

1.3.4 響應面實驗設計在單因素試驗基礎上，根據(jù)Box-Behnken實驗設計原理，以多酚得率Y為響應值，以A(乙醇體積分數(shù))、B(料液比)、C(超聲時間)、D(超聲溫度)為因變量，設計四因素三水平的響應面分析試驗，其中5個中心試驗共29個試驗點。試驗因素水平如表1所示。對響應面試驗結(jié)果所得數(shù)據(jù)用Design-Expert 8.0.6軟件進行分析和作圖。

表 1 響應面試驗設計因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

圖 1 不同因素對多酚得率的影響

(a)乙醇體積分數(shù)對提取得率的影響 Effect of ethyl alcohol volume fraction on extracting yield; (b)料液比對提取得率的影響 Effect of material and ratio on extracting yield; (c)提取時間對提取得率的影響 Effect of extraction time on yield; (d)提取溫度對提取得率的影響 Effect of extraction temperature on yield.

如圖1（a）所示，隨著乙醇體積分數(shù)的增加多酚得率呈現(xiàn)先增加當達到80%后又急劇減小的趨勢。根據(jù)相似相容的原理，可能是80%的乙醇體積分數(shù)和多酚極性最為相似，當乙醇體積分數(shù)繼續(xù)增大，二者極性差異增加，影響多酚的溶出[16]。所以乙醇濃度考察范圍為70%~90%為宜。

如圖1（b）所示，隨著料液比的減小多酚提取量逐漸增大，但當料液比小于1:20后，隨乙醇量增大多酚含量變化不明顯，說明溶出的多酚已經(jīng)達到飽和，繼續(xù)增加溶劑用量對提高多酚得率效果不明顯。這可能是由于適當增加提取溶劑的體積，提高了料液兩相體系的質(zhì)量濃度梯度，加快了傳質(zhì)推動力[17]，但從節(jié)約溶劑和后續(xù)分離純化的角度考慮，料液比考察范圍為1:15~1:25（g/mL）為宜。

如圖1（c）所示，隨著超聲時間的延長，多酚提取量逐漸增加，在45 min時達到最大量，繼續(xù)延長超聲時間，多酚提取量下降，可能是由于長時間超聲震動使多酚結(jié)構(gòu)遭到破壞[18]，此外超聲時間的延長也會增加能量消耗，因此超聲時間考察范圍定為30~60 min為宜。

如圖1（d）所示，甘薯葉多酚提取量隨浸提溫度的升高呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，當溫度為60 ℃的時候甘薯葉多酚提取量達到最大，可能是溫度升高有利于多酚物質(zhì)的運動[19]，在超聲輔助的條件下不斷溶出，當升到一定溫度時，多酚物質(zhì)化學結(jié)構(gòu)可能被破壞，高溫還導致乙醇揮發(fā)使料液比改變，從而影響多酚的提取[20]。所以提取溫度選擇50~70 ℃為宜。

2.2 甘薯葉多酚提取工藝條件的優(yōu)化

2.2.1 響應面實驗結(jié)果采用Design-Expert 8.0.6軟件，根據(jù)表2 Box-Behnken設計組合，對表2數(shù)據(jù)進行二次回歸擬合，建立提取工藝參數(shù)回歸模型。回歸方程為：=15.46-0.37A+0.56B+0.38C+0.87D-0.035AB+0.18AC+0.030AD-0.18BC+0.39BD-0.31CD-1.71A2-0.94B2-0.72C2-0.01D2

由方差分析結(jié)果可知，二次回歸模型<0.0001，模型達到顯著水平；失擬項值為0.0691>0.05，失擬項差異不顯著，表明模型與實驗擬合程度良好，無失擬因素存在；試驗模型的校正系數(shù)Adj R2為0.9567，變異系數(shù)CV值為1.88%，說明該模型只有4.33%的變異不能由該模型解釋。因此，利用此方程模型確定超聲輔助提取甘薯葉多酚工藝參數(shù)是可行的。

由回歸模型的顯著性檢驗可知，A、B、C、D、A2、B2、C2、D2的P值均小于0.05，說明對多酚得率影響顯著，交互相BD、CD的P值小于0.05，說明料液比和提取溫度，超聲時間和超聲溫度交互顯著。由F值的大小可知，這四個因素對甘薯葉多酚提取量的影響大小為：D（超聲溫度）>B（料液比）>C（超聲時間）> A（乙醇體積分數(shù)）。

2.2.2 響應面分析及最佳工藝研究利用Design-Expert 8.0.6軟件對各因素之間的交互作用做出相應的響應面曲線圖和等高線圖。圖2~7分別顯示6組以多酚得率為響應值的趨勢圖。響應面圖可直觀反映出試驗因素對多酚得率影響的兩兩交互作用的顯著程度，響應面坡度越陡峭，說明響應值對操作條件的改變越敏感[21]，該因素對多酚得率的影響越大；反之則說明試驗條件對多酚得率影響越小。在交互項對多酚得率的影響中，料液比與超聲溫度、超聲時間與超聲溫度之間的交互作用顯著，其它因素之間交互作用不顯著，這與方差分析結(jié)果一致。

表 2 響應面試驗設計及結(jié)果

表 3 回歸模型方差分析

注：*差異顯著，<0.05。Note: * showed the difference was significant at 0.05 level.

圖 2 乙醇體積分數(shù)和料液比的響應面和等高線圖

圖 3 乙醇體積分數(shù)和提取時間的響應面和等高線圖

圖 4 乙醇體積分數(shù)和提取溫度的響應面和等高線圖

圖 5 料液比和提取時間的響應面和等高線圖

圖 6 料液比和提取溫度的響應面和等高線圖

圖 7 提取時間和提取溫度的響應面和等高線圖

利用Design-Expert 8.0.6軟件分析計算出理論最佳提取工藝條件：乙醇體積分數(shù)79.98%，料液比1:21.96，超聲時間46.44 min，超聲溫度64.92 ℃，此時多酚得率最高達到15.83 mg/g。為了驗證模型的有效性，同時結(jié)合實際操作情況將最佳工藝條件修改為乙醇體積分數(shù)80%，料液比1:22，超聲時間47 min，超聲溫度65 ℃，在此工藝條件下重復三次進行驗證性實驗，得甘薯葉多酚得率為（15.80±0.014）mg/g，與預測值15.83 mg/g偏差不大，說明模型能較好的預測甘薯葉中多酚得率，優(yōu)化工藝條件可靠，具有實用價值。

3 結(jié)論

本研究是在單因素試驗的基礎上，通過Box-Behnken中心組合法優(yōu)化了甘薯葉多酚提取工藝，建立了該工藝的二次多項數(shù)學模型。由響應面分析結(jié)果知各因素對甘薯葉多酚得率的影響程度依次為：超聲溫度>料液比>超聲時間>乙醇體積分數(shù)，其中超聲溫度對甘薯葉中多酚提取量影響最顯著，交互項中料液比與超聲溫度，超聲時間與超聲溫度交互作用顯著。綜合回歸模型和驗證試驗，最終確定了超聲輔助提取甘薯葉多酚的最佳參數(shù)：乙醇體積分數(shù)80%，料液比1:22，超聲時間47 min，超聲溫度65 ℃，在此條件下甘薯葉多酚得率為（15.80±0.014）mg/g，與預測值15.83 mg/g基本一致，具有一定的實際意義。

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Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction of Polyphenols from Sweet Potato Leaves by Response Surface Methodology

TIAN Yan-nan1, ZHONG Yao-guang1,2,3,4,5*

1.201306,2.201306,3.()201306,4.()201306,5.201306,

The polyphenol in sweet potato leaves was extracted by ultrasonic - assisted method, and extraction process was optimized by response surface method. On the basis of single factor experiment, the effects of ethanol volume fraction, ratio of material to liquid, ultrasonic time and ultrasonic temperature on polyphenol yield of sweet potato leaves were studied by Box-Behnken central group method. The results showed that the optimum extraction conditions were ethanol concentration of 80%, solid- liquid ratio of 1:22g/mL, extraction time of 47min, extraction temperature of 65 ℃. Under these conditions, the yield of total polyphenols in sweet potato leaves was (15.80 ±0.014) mg/g, which was basically consistent with the predicted value of 15.83 mg/g.

Sweet potato leaves; total polyphenol; ultrasonic - assisted extraction; response surface methodology

TS255.1

A

1000-2324(2018)05-0894-06

10.3969/j.issn.1000-2324.2018.05.035

2017-04-04

2017-04-26

田燕楠(1992-),女,在讀碩士生,研究方向為食品營養(yǎng)與安全. E-mail:2270134374@qq.com

通訊作者:Author for correspondence. E-mail:ygzhong@shou.edu.cn