半夏白術天麻湯對癲癇大鼠海馬miRNA—146a—5p表達的影響及生物信息學分析

田茸 舍雅莉 董曉麗 史正剛 陳麗 程小麗 王宇

摘要：目的 通過對癲癇大鼠海馬miRNA-146a-5p進行靶基因預測及信號通路生物信息學分析，為探討癲癇的可能發(fā)病機制及半夏白術天麻湯抗癲癇作用機制的研究奠定基礎。方法 采用氯化鋰-匹魯卡品誘導制作癲癇發(fā)作大鼠模型。將實驗大鼠隨機分為正常組、模型組、中藥組，每組20只。使用miRNA芯片技術分析檢測大鼠海馬神經元細胞miRNA表達譜。實時熒光定量PCR檢測miRNA-146a-5p表達。利用miRDB對miRNA-146a-5p進行靶基因預測，并運用miRTarBase、DAVID進行GO功能和KEGG信號通路的富集分析。結果 行為學觀察顯示，中藥組大鼠發(fā)作次數和級別均較模型組明顯降低。miRNA芯片結果顯示，模型組miRNA-146a-5p表達水平是正常組的2.107倍（P<0.05），經半夏白術天麻湯治療后其表達量降至1.377倍（P<0.05）。RT-PCR結果與芯片結果一致，表達差異有統計學意義（P<0.05）。miRNA-146a-5p靶基因預測結果共有140個靶基因，GO注釋共得到14個GO生物學過程注釋信息（P<0.05），9個細胞組分注釋信息（P<0.05），11個分子功能注釋信息（P<0.05）。KEGG生物通路富集顯示，其140個靶基因顯著富集于EB病毒感染信號通路，以及甲狀腺激素信號通路上（P<0.05）。結論 miRNA-146a-5p與癲癇發(fā)生后的炎癥反應密切相關，半夏白術天麻湯可能通過控制癲癇發(fā)生后的炎癥反應發(fā)揮抗癲癇的效應。

關鍵詞：癲癇；海馬；miRNA-146a-5p；半夏白術天麻湯；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.07.009

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）07-0034-07

Abstract： Objective To lay the foundation for studying the possible pathogenesis of epilepsy and the anti-epileptic mechanism of Banxia Baizhu Tianma Decoction through the bioinformatic analysis of target gene prediction and signal pathway of miRNA-146a-5p in hippocampus of epileptic rats. Methods Lithium-pilocarpine was used to induce seizures in rat models. The experiment rats were randomly divided into normal control group， model group， Banxia Baizhu Tianma Decoction group， with 20 rats in each group. The method of miRNA expression profiling was used to observe the miRNA differential expression of hippocampus neuron cell of rats. The expression level of miRNA-146a-5p was detected by real-time quantitative PCR. MiRDB was used for target gene prediction of miRNA-146a-5p， and miRTarBase and DAVID were used for enrichment analysis on the GO function and KEGG signaling pathway. Results The attack times and grades of the rats in Banxia Baizhu Tianma Decoction group were significantly lower than those in the model group from behavioral observation. MiRNA microarray analysis showed that the expression level of miRNA-146a-5p in model group was 2.107 times normal control group （P<0.05）， and the expression level decreased to 1.377 times after treatment with Banxia Baizhu Tianma Decoction （P<0.05）. The results

of RT-PCR was consistent with that of miRNA microarray， with statistical significance （P<0.05）. MiRNA-146a-5p target gene prediction results had 140 target genes by GO， and there were 14 annotation information of biological process （P<0.05）， 9 annotation information of cellular component （P<0.05）， 11 annotation information of molecular function （P<0.05）. Enrichment analysis of KEGG biological pathway showed that 140 target genes of miRNA-146a-5p were enriched in EB virus infection signal pathway and thyroid hormone signaling pathway （P<0.05）. Conclusion miRNA-146a-5p is closely related to the inflammatory reaction after epilepsy， and Banxia Baizhu Tianma Decoction can control epilepsy possibly by controlling the inflammatory reaction after epilepsy.

Keywords： epilepsy； hippocampus； miRNA-146a-5p； Banxia Baizhu Tianma Decoction； rats

癲癇是一種由于腦部神經元異常放電導致瞬時、反復發(fā)作的大腦功能紊亂疾病，病理機制復雜，包括神經細胞凋亡、神經膠質再生、炎癥反應等，其分子機制涉及基因轉錄、翻譯、翻譯后修飾等遺傳信息鏈中多個環(huán)節(jié)。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類在生物進化過程中具有高度保守性及穩(wěn)定性的內源性非編碼RNA，其主要作用是通過負性調控mRNA來協調多種靶蛋白的合成，從而影響生命進程。在神經系統中，miRNA參與神經系統疾病的生理、病理及生物反饋調節(jié)，如神經細胞發(fā)育、樹突突觸形成、膠質細胞增生、神經細胞凋亡及壞死等[1]。本研究運用基因芯片檢測實驗大鼠間的差異miRNA，選擇其中的miRNA-146a-5p作為目標，通過生物信息學工具對miRNA-146a-5p靶基因的功能及其信號通路等進行多層次分析，以miRNA-146a為切入點探討癲癇的可能發(fā)病機制，以及具有熄風化痰作用的經典方劑半夏白術天麻湯的抗癲癇作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級健康雄性Wistar大鼠60只，9周齡，體質量（200±10）g，成都達碩實驗動物有限公司，動物合格證號SCXK（川）2013-24。飼養(yǎng)于溫度18～29 ℃、相對濕度40%～70%環(huán)境，無菌條件下飼養(yǎng)。

1.2 藥物

半夏白術天麻湯（由法半夏、天麻、茯苓、橘紅、白術、甘草組成，比例為3∶2∶2∶2∶5∶1），成都中醫(yī)藥大學制劑室加工，按照處方比例取以上藥材，用8倍量70%乙醇每次回流2 h，提取3次，得醇提取液和醇提取藥渣。合并3次醇提取液，過濾，濾液減壓回收乙醇后得醇提取濃縮液，醇提取濃縮液干燥得干膏，干膏粉碎成細粉，加入揮發(fā)油。實驗用不含賦形劑的浸膏，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑與儀器

氯化鋰、阿托品、匹魯卡品、水合氯醛，上海伯豪生物技術有限公司；miRNA Complete Labeling and Hyb Kit，Gene Expression Wash Buffer Kit，Agilent公司；miScript II RT Kit，美國QIAGEN；miRcute miRNA qPCR Detection Kit SYBR Green，天根生化科技（北京）有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。芯片：Hybridization Chamber， stainless，Hybridization Chamber gasket slides 8 microarrays/slide， 5 slides/box，Microarray Scanner，Agilent公司。定量PCR儀，7900 HT Sequence Detection System（美國BI公司）。

1.4 分組、造模及給藥

將60只大鼠隨機分為正常組、模型組和中藥組，每組20 只。除正常組大鼠外，其余2組均腹腔注射127 mg/kg氯化鋰進行預處理，24 h后腹腔注射阿托品1 mg/kg，30 min后按35 mg/kg比例腹腔注射新配制的匹魯卡品溶液。30 min后未引起癲癇發(fā)作的以每間隔10 min注射1次匹魯卡品10 mg/kg，直至癲癇發(fā)作達到Ⅳ或Ⅴ級；誘發(fā)癲癇發(fā)作1 h后，腹腔注射300 mg/kg 10%水合氯醛和1 mg/kg阿托品以停止癲癇發(fā)作。正常組大鼠給予腹腔注射等劑量生理鹽水。根據Racine分級[2]，大鼠癲癇發(fā)作分為0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ級。0級：無任何反應；Ⅰ級：凝視、咀嚼和須動；Ⅱ級：點頭或濕狗樣抖動、搔抓；Ⅲ級：前肢局限性陣攣；Ⅳ級：伴有后肢站立的全身強直性發(fā)作；Ⅴ級：伴有站立并摔倒的全身強直-陣攣性發(fā)作。本實驗以連續(xù)出現3次Ⅳ級或Ⅳ級以上的癇性發(fā)作為模型復制成功的評價標準。造模成功后1 d，中藥組給予半夏白術天麻湯藥液灌胃，按70 kg質量成人量換算成大鼠等效劑量，每日1次，劑量2 mL，相當于1.548 g原藥材/mL，共30 d，其余2組給予等量蒸餾水同步灌胃。

1.5 標本采集

給藥后第31日，腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，斷頭取腦。于生理鹽水冰面鈍性分離大鼠雙側海馬組織，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｕ麄€實驗過程中使用的器械均進行去酶處理。

1.6 miRNA芯片檢測大鼠海馬組織miRNA-146a-5p的表達

樣品RNA的標記：實驗樣品RNA采用Agilent miRNA芯片配套的試劑盒，按照標準操作流程的標記部分對樣品中的miRNA分子進行熒光標記。芯片雜交：按照Agilent miRNA芯片配套提供的標準操作流程和配套試劑盒的雜交部分進行樣品雜交實驗。在滾動雜交爐中55 ℃，20 r/min，滾動雜交20 h。雜交完成后在洗缸中洗片，洗片所用的試劑為Gene Expression Wash Buffer Kit。芯片掃描：芯片結果采用Agilent Microarray Scanner進行掃描，軟件設置Scan resolution=5 μm（大鼠），PMT 100%，用Feature Extraction software 10.7.1.1讀取數據，最后采用R語言程序包AgiMicroRna進行歸一化處理，所用算法為Quantile。差異基因基本信息：原始數據歸一化后用Fold-change（表達差異倍數）及t檢驗對差異基因進行篩選。篩選條件：①Fold Change（linear）分≤閾值或Fold Change（linear）≥閾值；②t檢驗P<閾值。

1.7 實時熒光定量PCR驗證大鼠海馬組織miRNA-146a-5p的表達

組織總RNA提取與質量檢測及反轉錄合成模板cDNA：取適量各樣本組織，分別取1 μL各組織RNA 樣品用核酸定量分析儀測定其OD260/OD280均在1.8～2.0，經總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測，提取的RNA符合純度要求，可用于后續(xù)PCR。按反轉錄試劑盒要求操作，所得單鏈cDNA置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?實時熒光定量PCR以U6作為內參基因，miRNA-146a-5p引物序列為：5'-TGAGAACTGAATT CCATGGGTT-3'，通過融解曲線分析，為單一峰，說明PCR擴增特異性較好，樣本3次重復實驗數據的重復性較好，得到各擴增反應的Ct值。連續(xù)檢測熒光并記錄擴增曲線，采用樣點擬合法分析結果得到目的基因和U6的Ct值，用相對定量2-ΔΔCt法對待測miRNA進行分析。

1.8 生物信息學分析

采用miRDB對miRNA-146a-5p靶基因進行預測。并運用miRTarBase（該數據庫收錄了文獻報道的、有實驗證據的microRNA與靶基因關系）對結果進行分析。用DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）在線工具進行GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析。

1.9 統計學方法

采用Excel2015軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，組間比較用方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 行為學觀察結果

造模后，模型組和中藥組大鼠出現節(jié)律性點頭，濕狗樣震顫，反復頭頸上仰，前肢交叉伴前沖動作，全身強直抖動，伴發(fā)聲音，繼而出現反復前肢陣攣、伴站立、跌倒、翻轉，進入癲癇持續(xù)狀態(tài)。3～14 d，大鼠出現精神萎靡、進食活動減少、消瘦，精神緊張、怕人、畏懼聲響，沖撞籠欄，甚至咬人等易激惹狀態(tài)。15～30 d，模型組大鼠出現癲癇自發(fā)發(fā)作，發(fā)作級數在Ⅰ～Ⅴ級之間不等，自發(fā)發(fā)作后大鼠高度緊張、興奮、易激惹，甚至躁狂。發(fā)作頻繁時，模型組大鼠進食明顯減少，毛發(fā)發(fā)黃、無光澤。中藥組大鼠發(fā)作次數和級別均較模型組大鼠明顯降低，進食、體質量、毛發(fā)等一般情況也較模型組大鼠良好。正常組大鼠一切表現均正常。

2.2 大鼠海馬組織miRNA-146a-5p的差異表達

利用miRNA 芯片技術分析正常組、模型組和中藥組的miRNA表達譜，在檢測的758種miRNA中，模型組較正常組共有49種miRNA產生差異表達，其中造模后26種miRNA顯著上調，23種顯著下調，差異均有統計學意義（P<0.05）；中藥組較模型組共有38種miRNA產生差異表達，其中32種miRNA顯著上調，6種顯著下調，差異有統計學意義（P<0.05）。模型組miRNA-146a-5p的表達較正常組明顯上調，其差異表達倍數是2.030；中藥組較模型組明顯下調，其差異表達倍數是0.590，差異有統計學意義（P<0.05）；中藥組與正常組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。

2.3 大鼠海馬組織miRNA-146a-5p的表達情況

模型組大鼠海馬組織miRNA-146a-5p表達明顯升高（P<0.05），且表達量是正常組的2.107倍；經半夏白術天麻湯治療后中藥組大鼠海馬組織miRNA-146a-5p表達明顯降低（P<0.05），其表達量降至1.377倍。RT-PCR驗證結果與miRNA芯片分析結果趨勢一致。

2.4 miRNA-146a-5p靶基因預測結果

用miRDB對miRNA-146a-5p靶基因的進行預測，結果發(fā)現預測的靶基因共有140個，其中預測評分在80分以上共37個靶基因，見表1。并運用miRTarBase數據庫對結果進行分析，發(fā)現主要集中在6個靶基因上，見表2。

2.5 miRNA-146a-5p靶基因GO分析結果

針對以上miRNA-146a-5p的140個預測靶基因，通過GO注釋描述共得到14個GO生物學過程（biological process，BP）注釋信息（見表3）、9個細胞組分（cellular component，CC）注釋信息（見表4）及11個分子功能（molecular function，MF）注釋信息（見表5）。BP注釋信息主要集中在聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄負調控、蛋白質定位的建立、負轉錄調控DNA模板、細胞間連接組織、心臟發(fā)育、基因表達負調控、剪接調控、酮體分解、核轉錄mRNA降解過程中核酸外切、血管平滑肌細胞的發(fā)育、細胞反應的UV-C、肌性間隔形態(tài)、細胞黏附、大腦發(fā)育等；CC注釋信息主要集中在核仁、細胞核、細胞膜、細胞質、核質、核斑點、蛋白復合物、突觸、染色質；MF注釋信息主要集中在聚（A）RNA結合、蛋白復合物的結合、蛋白結合、蛋白體的活動、蛋白激酶活性、Toll樣受體結合、組蛋白去乙?；附Y合、泛素蛋白連接酶的活性、PDZ結構域結合、相同蛋白結合、鈣黏蛋白結合參與細胞與細胞間的黏附。

2.6 KEGG通路分析結果

在GO注釋分類的基礎上，利用已有生物通路數據，對基因集合中的140個基因進行生物通路富集分析。結果顯示，在經典通路數據庫KEGG中miRNA-146a-5p顯著富集于EB病毒感染信號通路，以及甲狀腺激素信號通路上，差異有統計學意義（P<0.05）。見表6。

3 討論

癲癇的發(fā)生與神經細胞的凋亡、突觸聯系重建、神經膠質纖維細胞增生、異常通路形成及炎癥反應密切相關[3-4]。反復的癲癇發(fā)作可導致大腦海馬神經元凋亡，形成異常興奮性突觸環(huán)路，最終促進難治性顳葉癲癇形成。研究表明，腦內的炎癥過程是癲癇發(fā)作的一個重要機制，即癲癇發(fā)生后啟動一系列炎癥反應，導致炎癥遞質大量釋放。一方面炎癥遞質可引起血管炎，破壞血腦屏障，加重腦水腫及神經損害；另一方面，炎癥遞質可調節(jié)興奮性氨基酸的釋放和影響離子通道結構和表達，從而增高神經元細胞興奮性，進一步促進癲癇發(fā)作。所以，炎癥反應對于癲癇發(fā)作的持續(xù)存在起著重要作用[5]。

有研究表明，miRNA-146a通過轉錄后水平調控核因子-κB（NF-κB）、白細胞介素（IL）-1等表達，影響癲癇發(fā)作后炎癥反應，提高癲癇腦組織miRNA-146a的水平可以減輕炎癥反應，從而治療癲癇[6]。Omran A等[7]研究發(fā)現，在幼年大鼠顳葉內側癲癇模型中，不同時期大鼠海馬IL-1與miRNA-146a的水平成反比，提示miRNA-146a在炎癥反應中起負性調控作用，即在癲癇過程中起著“抗炎”作用。但也有研究表明，輕型腦創(chuàng)傷后皮質區(qū)miRNA-146a表達顯著上調，NF-κB通過miRNA-146a上游調控元件增強miRNA-146a的轉錄水平，NF-κB-miRNA-146a途徑可能在促進腦創(chuàng)傷后炎癥反應過程中發(fā)揮重要作用[8]。本研究通過基因芯片和實時熒光定量PCR檢測出模型組大鼠miRNA-146a-5p表達顯著上調，經具有熄風化痰作用的半夏白術天麻湯治療后miRNA-146a-5p的表達水平顯著下調。

通過miRNA-146a-5p預測靶基因并針對靶基因進行GO及KEGG通路分析，GO生物學過程主要集中在對RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄、DNA模板轉錄、基因表達的負調控、剪接調控、核轉錄mRNA降解過程中核酸外切，以及參與心臟發(fā)育和大腦發(fā)育；GO細胞組分主要集中在核仁、細胞核、核質、突觸、染色質等；GO分子功能主要集中蛋白結合、蛋白體活動、蛋白激酶活性、Toll樣受體結合、細胞間黏附等。

KEGG通路分析miRNA-146a-5p顯著富集于EB病毒感染信號通路，其中涉及的關鍵基因有MDM2原癌基因（Mdm2）、腫瘤壞死因子受體相關因子6 （Traf6）、槐定堿（SP）、IL-1受體相關激酶1（Irak1）和脾相關酪氨酸激酶（Syk）等，大量研究集中在Mdm2與p53相關性上，有研究表明SCYL1BP1是存在于軸突生長物中的一種新的轉錄激活因子，通過直接調控MDM2/p53依賴途徑，可能在中樞神經系統發(fā)育和損傷后軸突再生中發(fā)揮重要作用[9]。研究表明p62通過影響TRAF6泛素化調節(jié)神經生長因子誘導的NF-κB活化[10]。SP可能是通過下調TRAF6的表達和上調ERK1/2磷酸化的表達發(fā)揮神經保護作用[11]。慢性的IL-18水平升高可能是通過增加Irak1的水平和NF-κB的活性加重胰島素抵抗，增強血管炎癥和重塑的[12]。Syk通過血管平滑肌細胞增殖和表型調制對血管重塑起著重要的作用，通過連接免疫受體到下游效應分子出現在小腦、海馬、視覺和嗅覺系統神經元的不同結構[13]。

綜上，miRNA-146a-5p與癲癇發(fā)生后的炎癥反應密切相關，但具體發(fā)生機制還有待進一步研究，而半夏白術天麻湯則有可能通過控制癲癇發(fā)生后的炎癥反應起到抗癲癇的效果。本研究為下一步深入研究癲癇發(fā)病機制和半夏白術天麻湯的治療機制提供了切入點。

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