T—SPOT.TB測定、PPD試驗和結(jié)核蛋白芯片對兒童肺結(jié)核診斷價值的研究

李丹　杜德兵　袁容靜　王德成

[摘要] 目的 利用T-SPOT.TB測定、結(jié)核菌素試驗方法（PPD法）及結(jié)核蛋白芯片法進(jìn)行兒童結(jié)核分枝桿菌的檢測診斷比較，以評價各種不同方法在兒童肺結(jié)核診斷中的臨床應(yīng)用價值。 方法 回顧性分析2015～2017年宜昌市第三人民醫(yī)院收治的疑似肺結(jié)核患兒108例，其中確診肺結(jié)核患兒57例，非結(jié)核患兒51例，用上述3種方法分別檢測108例患兒，統(tǒng)計分析三種方法在診斷兒童結(jié)核病的靈敏度、特異度，并比較T-SPOT.TB與PPD法及結(jié)核蛋白芯片法診斷兒童肺結(jié)核的準(zhǔn)確度。 結(jié)果 T-SPOT.TB測定法、PPD法及結(jié)核蛋白芯片法檢測兒童肺結(jié)核的靈敏度分別為87.72%、56.14%和52.63%；特異度分別為90.19%、66.67%和82.35%。 結(jié)論 T-SPOT.TB測定與PPD法及結(jié)核蛋白芯片法比較，具有快速、敏感性高和特異性強等優(yōu)點，是臨床兒童結(jié)核病快速診斷的有效檢測方法。

[關(guān)鍵詞] T細(xì)胞斑點試驗；PPD皮試；基因芯片；兒童結(jié)核病；檢測方法

[中圖分類號] R529.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）16-0019-04

[Abstract] Objective To compare the application of T-SPOT.TB determination， tuberculin test method（PPD method） and tuberculosis protein chip method for the detection and diagnosis of mycobacterium tuberculosis in children， so as to evaluate the clinical application value of different methods in the diagnosis of pulmonary tuberculosis in children. Methods 108 children patients with suspected tuberculosis who were admitted to Yichang Third Peoples Hospital from 2015 to 2017 were retrospectively analyzed. Of these， 57 children patients were diagnosed as pulmonary tuberculosis and 51 were non-tuberculosis. The above three methods were used to detect 108 cases of children. The sensitivity and specificity of the three methods in the diagnosis of pediatric tuberculosis were statistically analyzed， and the T-SPOT.TB， PPD methods and tuberculosis protein chip method in the diagnosis of pediatric pulmonary tuberculosis were compared. Results The sensitivity of T-SPOT.TB determination method， PPD method and tuberculosis protein chip method in the detection of pulmonary tuberculosis in children were 87.72%， 56.14% and 52.63% respectively； the specificity was 90.19%， 66.67% and 82.35% respectively. Conclusion Compared with PPD method and tuberculosis protein chip method， T-SPOT.TB determination method has the advantages of rapidity， high sensitivity and strong specificity. It is an effective clinical detection method for rapid diagnosis of tuberculosis in children.

[Key words] T-cell spot test； PPD skin test； Gene chip； Tuberculosis in children； Test method

世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）的結(jié)核病2014年度報告提示，現(xiàn)在全球兒童結(jié)核病患兒有增多趨勢，形勢較嚴(yán)峻，不容樂觀。近年來我國兒童肺結(jié)核病有明顯上升趨勢，由于目前我國對兒童肺結(jié)核病的特點及早期診療認(rèn)知不足，且診療手段有限，重癥兒童肺結(jié)核明顯增加[1-2]。因此早期診斷且及時治療兒童結(jié)核病是控制的關(guān)鍵。但是目前兒童肺結(jié)核早期診斷困難，漏診率和誤診率高。為了讓兒童肺結(jié)核病得到快速診斷，本文通過對兒童肺結(jié)核患者進(jìn)行血清T-SPOT.TB測定、PPD 皮試及結(jié)核蛋白芯片檢測，觀察其對兒童肺結(jié)核的診斷價值，評價其臨床診斷的意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取我院2015 年1 月～2017年12月肺結(jié)核或疑似肺結(jié)核患兒108 例，其中患兒的診斷、治療均符合中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會呼吸學(xué)組《兒童肺結(jié)核的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)和治療方案》[3]并隨訪 6 個月；出院時最終診斷與入選時診斷相符。明確診斷的肺結(jié)核患兒57 例，其中男35 例，女22例，年齡1～14歲，平均9.5歲。其中非肺結(jié)核患兒51例，男33 例，女18例，年齡1～14歲，平均9.8歲。將51例非肺結(jié)核患兒作為實驗對照組進(jìn)行對比分析。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并自身免疫系統(tǒng)病變；②合并代謝系統(tǒng)病變者及其他病變者；③有抗結(jié)核藥物使用史者；④有免疫類藥物使用史者；兩組研究對象年齡、性別比例及身體狀況比較差異均無顯著性（P>0.05），具有可比性。抽取入選者行卡介苗—純蛋白衍化物（BCG-PPD）皮試檢測。同時抽取空腹血液5 mL，血清標(biāo)本應(yīng)用血T-SPOT.TB檢測和血結(jié)核蛋白芯片檢測。該研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試患兒均已由兒童監(jiān)護(hù)人簽屬知情同意書。入院后詳細(xì)詢問病史、采集患兒卡介苗接種史、既往患兒結(jié)核患者密切接觸史、進(jìn)行體格檢查、影像學(xué)檢查、免疫學(xué)及分子生物學(xué)、痰涂片找結(jié)核菌、痰培養(yǎng)結(jié)核菌等檢查。

1.2 檢測方法

1.2.1 T-SPOT.TB檢測 采集受試患兒外周靜脈血5 mL用肝素鈉抗凝，使用試劑盒從外周血分離出單個核細(xì)胞，參照試劑盒使用說明書進(jìn)行檢測，并置于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)箱中孵育16～20 h，顯色洗板后對斑點進(jìn)行計數(shù)，設(shè)立陰陽性對照孔，結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)[4-5]：陰性對照孔斑點數(shù)為 0～5 個，CFP-10 和ESAT-6抗原檢測孔任一孔計數(shù)-陰性孔計數(shù)≥6判為陽性；如果陰性對照孔斑點數(shù)≥6，檢測孔斑點數(shù)≥2倍陰性孔斑點數(shù)判為陽性。

1.2.2 結(jié)核抗體蛋白檢測芯片的檢測 應(yīng)用蛋白芯片法檢測所有血清標(biāo)本，試劑盒、蛋白芯片閱讀儀等檢測儀器均由南京大淵生物技術(shù)工程有限公司提供，同一名檢驗人員按照說明書和相關(guān)規(guī)定在無菌條件下進(jìn)行所有操作，完成后將芯片放入芯片識別儀，根據(jù)生物芯片檢測軟件按程序操作，不同抗原點陣的灰度值進(jìn)行分析。該抗體檢測蛋白芯片試劑盒采用基因工程表達(dá)的脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）、結(jié)核菌重組蛋白抗原16 kD和38 kD蛋白檢測待檢血清中的抗體，若其中任何一種抗體陽性，則判斷該病例結(jié)核分枝桿菌抗體陽性。若三種抗體檢測均為陰性，則結(jié)果可判定為陰性[6]。

1.2.3 結(jié)核菌素純蛋白衍化物測定 于患兒前臂掌側(cè)皮內(nèi)注射 TB.PPD 0.1 mol·L-1（5 U），72 h后觀察注射部位的反應(yīng)情況，并測量硬結(jié)直徑（㎜）。PPD皮試結(jié)果判斷：硬結(jié)直徑（mm）<5 mm（-），≥5 mm（+），≥10～19 mm（++），≥20 mm或局部出現(xiàn)水泡、淋巴管炎、壞死潰破等為強陽性（+++）。

1.3 評價指標(biāo)

以臨床最終診斷結(jié)果作為金指標(biāo)，敏感性、特異性按下列公式計算：敏感性=真陽性數(shù)/（真陽性數(shù)+假陰性數(shù)），特異性=真陰性數(shù)/（真陰性數(shù)+假陽性數(shù)）。評價各個試驗方法的靈敏度、特異度，并進(jìn)行兩兩比較。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析。計數(shù)資料以%表示，采用χ2檢驗；P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 確診或疑似肺結(jié)核患兒的檢測結(jié)果

臨床確診為兒童結(jié)核病的57例中，T-SPOT.TB法陽性率87.72%，結(jié)核蛋白芯片法陽性率56.14%，PPD 法陽性率52.63%，臨床確診為非結(jié)核性疾病的51例中，T-SPOT.TB法陽性率9.81%，結(jié)核蛋白芯片法陽性率17.65%，PPD法陽性率33.33%，見表1。

2.2 T-SPOT.TB檢測與PPD試驗靈敏度、特異度比較

108例入選患兒中，根據(jù)結(jié)果可計算出T-SPOT.TB檢測的靈敏度為87.72%，特異度為90.19%；可計算出PPD試驗的靈敏度為56.14%，特異度為66.67%。見表2。T-SPOT.TB檢測診斷兒童結(jié)核病的靈敏度（87.72%）顯著高于PPD試驗的靈敏度（56.14%）（P<0.05）；特異度（90.19%）顯著高于PPD試驗的特異度（66.67%）（P<0.05）。

2.3 T-SPOT.TB檢測與結(jié)核蛋白芯片靈敏度、特異度比較

108例入選患兒中，根據(jù)結(jié)果可計算出T-SPOT.TB檢測的靈敏度為87.72%，特異度為90.19%；可計算出結(jié)核蛋白芯片檢測的靈敏度為52.63%，特異度為82.35%。見表3。T-SPOT.TB檢測診斷兒童結(jié)核病的靈敏度（87.72%）顯著高于結(jié)核蛋白芯片檢測的靈敏度（52.63%）（P<0.05）；兩種方法的特異度經(jīng)χ2檢驗比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。

2.4 聯(lián)合試驗

當(dāng)T-SPOT.TB與PPD試驗、結(jié)核蛋白芯片檢測聯(lián)合使用時，兒童結(jié)核病組57例中T-SPOT.TB檢測陽性或結(jié)核蛋白芯片陽性或PPD試驗陽性例數(shù)共53例，靈敏度診斷率達(dá)到92.98%（53/57），提示為了需要達(dá)到更高的診斷靈敏度時，臨床上可將三種診斷試驗聯(lián)合使用，診斷效果更佳。

3 討論

兒童肺結(jié)核是一個特殊的群體，其感染后患病率高，病情嚴(yán)重，預(yù)后差。兒童肺結(jié)核臨床癥狀不典型，小兒結(jié)核無明顯自覺癥狀，又不易對癥狀清楚準(zhǔn)確地描述，很難與其他兒童肺部感染性疾病區(qū)別；肺結(jié)核特別是肺外結(jié)核的標(biāo)本采集困難。結(jié)核病確診手段依然是細(xì)菌學(xué)方法。但由于結(jié)核菌的遺傳特性，使常規(guī)細(xì)菌學(xué)檢查方法存在取材困難、靈敏度低、操作復(fù)雜，且結(jié)核培養(yǎng)周期較長，病原學(xué)診斷因此受限等缺點，使臨床診斷小兒結(jié)核十分困難。目前，結(jié)核病由于其具有極強的傳染性，早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療顯得尤為重要。0～14 歲兒童由于其免疫力較低，初次感染結(jié)核分枝桿菌后就有可能發(fā)展成結(jié)核病，如未能及時發(fā)現(xiàn)并診斷極易發(fā)展成重癥肺結(jié)核和肺外結(jié)核，晚期可引起嚴(yán)重的后遺癥。如何早期診斷小兒結(jié)核是臨床共同關(guān)注的問題[7-8]。PPD 試驗雖然具有時間短、簡便、價格便宜的優(yōu)點，但由于受重癥感染及患兒免疫力影響，在嚴(yán)重播散性結(jié)核病和免疫抑制兒童患兒中常表現(xiàn)為假陰性，且PPD檢測不易排除卡介苗接種（BCG）與非結(jié)核分枝桿菌（NTM）感染，對檢測的靈敏度、特異度影響較大，常導(dǎo)致誤診、漏診。本研究顯示結(jié)核病患兒PPD陽性率為56.14%，此受我國實行普遍接種卡介苗的影響，假陰性率高達(dá)33.33%，與小兒免疫力低有關(guān)，給臨床診斷兒童肺結(jié)核帶來很大的困惑。

結(jié)核蛋白芯片系統(tǒng)是以微孔濾膜為載體，利用微陣列技術(shù)將純化的結(jié)核菌脂阿拉伯甘露糖（LAM）、蛋白38 kD和16 kD等三種抗原固相于同一膜片上，并利用微孔濾膜的滲濾、濃縮、凝集作用，使抗原抗體反應(yīng)在固相膜上快速進(jìn)行，再以免疫金作為標(biāo)記物而直接在膜上顯色，對其灰度值進(jìn)行分析。LAM是分枝桿菌屬細(xì)胞壁的重要組成部分，屬特異性抗原，具有較強的免疫原性，其檢測的靈敏度較高，但除結(jié)核分枝桿菌外，其他分枝桿菌也有LAM成分，因此其特異性相對較低。結(jié)核分枝桿菌38 kD 抗原與16 kD抗原是結(jié)核分枝桿菌所特有的抗原，與其他分枝桿菌和非結(jié)核分支桿菌不存在交叉反應(yīng)，其診斷的特異性較高[9]。結(jié)核蛋白芯片法可分別檢測結(jié)核菌的特異性細(xì)胞壁脂多糖 LAM 抗體、38 kD 抗體和16 kD 抗體，以便能快速診斷患者結(jié)核菌感染情況。本實驗結(jié)果顯示，結(jié)核蛋白芯片檢測結(jié)核病患者的特異度為82.35%，靈敏度為52.63%，但診斷的靈敏度不夠高，不能滿足臨床診斷需要。

T-SPOT.TB是近幾年發(fā)展的一種快速準(zhǔn)確新型免疫性的診斷結(jié)核的方法，具有取材方便、快速、靈敏度及特異性強等優(yōu)點。當(dāng)前歐美等發(fā)達(dá)國家均已將T-SPOT.TB試驗列入結(jié)核病診療指南，成為替代診斷結(jié)核病的主要方法[10-11]。其原理是以結(jié)核菌特異性抗原ESAT-6、CFP-10為刺激原，刺激患者外周血單核細(xì)胞中活化的T細(xì)胞，使其釋放 γ-干擾素，可以對能有效釋放 γ-干擾素的 T 細(xì)胞進(jìn)行定量，從而進(jìn)行診斷機(jī)體是否對活動性結(jié)核感染。且其不受大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌和卡介苗的影響，且該檢驗24 h即可出結(jié)果，結(jié)果客觀、準(zhǔn)確，判斷標(biāo)準(zhǔn)簡單明確。國內(nèi)研究表明T-SPOT.TB試驗在疑似結(jié)核病患者、活動性肺結(jié)核及肺外結(jié)核及診斷中均具有較好的臨床診斷價值[12-14]，也為兒童肺結(jié)核的高效診斷提供了新的思維方式。本研究表明，T-SPOT.TB診斷兒童肺結(jié)核靈敏度87.72%，特異度90.19%，與國內(nèi)外研究結(jié)果比較一致[15-16]，顯著高于PPD試驗靈敏度及特異度（P<0.05），提示T-SPOT.TB檢測診斷兒童肺結(jié)核病的顯著優(yōu)勢在于靈敏度及特異度均較高，且不受BCG接種大多數(shù)和非結(jié)核分枝桿菌影響，診斷價值較高。本實驗血清T-SPOT.TB檢測對兒童肺結(jié)核患者的靈敏度與結(jié)核蛋白芯片檢測比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），與結(jié)核蛋白芯片檢測相比，特異度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。本研究結(jié)果表明，與結(jié)核蛋白芯片法及PPD 法比較，T-SPOT.TB法診斷兒童結(jié)核病，具有快速、敏感性較高和特異性強等優(yōu)點，是輔助診斷兒童結(jié)核病的重要依據(jù)，具有一定的參考價值。

兒童肺結(jié)核早期診斷困難，晚期易引起嚴(yán)重的并發(fā)癥及后遺癥，因此，早期診斷或鑒別診斷意義非常重要。為了更好提高兒童結(jié)核病的診斷靈敏度，將以上三種診斷試驗聯(lián)合應(yīng)用是更好的選擇。

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（收稿日期：2018-02-08）