白英提取物抑瘤有效成分的初步篩選

王衛(wèi)芳，劉 悅，吳廣謀，楊 唐，張 迪，徐雅娟*

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117；2.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，長春 130012；

3.軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所，長春 130122）

白英（Solanum lyratum Thunb.），是一種常用抗癌中草藥[1]，為茄科多年生草質(zhì)藤本植物，別名白毛藤、蜀羊泉等[2]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對白英的藥理活性做了大量的研究，其熱點主要集中于抗肺癌[3]、肝癌[4-5]、抗炎[6]、抗過敏[7-8]、保肝[9]、增強免疫作用[10]等方面。并對成分進(jìn)行了分析[11-16]，目前對不同的白英提取物的作用機制有了初步的了解[17-20]，但仍需進(jìn)一步明確。本研究初步篩選白英水提液的不同部位對人宮頸癌細(xì)胞HeLa、人胃癌細(xì)胞BGC -823細(xì)胞是否具有抑制增殖活性及誘導(dǎo)凋亡作用，從而確定白英水提液抗腫瘤作用有效部位，為進(jìn)一步探討其分子水平機制及抗癌新藥的開發(fā)，奠定一定的理論及實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM培養(yǎng)基（HyClone公司）、胎牛血清（Gibco公司）、Cell Counting Kit-8 試劑盒（MCE公司）。

1.2 細(xì)胞株培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%抗菌藥物（青霉素100 U/mL，鏈霉素100 mg/L）的DMEM高糖培養(yǎng)基中，放置于37 ℃、含5% CO2、飽和濕度條件的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞呈單層貼壁生長，依細(xì)胞生長情況換液，待細(xì)胞長至鋪滿瓶底，以0.25%胰酶消化傳代。

1.3 實驗分組 空白對照組（加入等量的完全培養(yǎng)基）；實驗組按白英提取物的濃度分為5個劑量組；陰性對照組為含細(xì)胞的DMEM培養(yǎng)液；陽性對照組為DMEM培養(yǎng)液倍比稀釋的5-Fu注射液。

1.4 CCK-8法測定細(xì)胞增殖抑制率 每種藥物濃度設(shè)6個平行孔，培養(yǎng)48 h，加入10 μL CCK-8培養(yǎng)1h后，酶標(biāo)儀測定450 nm各孔的OD值，以培養(yǎng)液調(diào)零。按公式計算細(xì)胞生長抑制率（IR，inhibition rate）。

抑制率IR = [（Ac-As）/（Ac-Ab）] × 100% 。其中，As：實驗孔吸光度 （含細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8 溶液和藥物溶液）； Ac：對照孔吸光度（含細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8 溶液，不含藥物）； Ab：空白孔吸光度（含培養(yǎng)基、CCK-8 溶液，不含細(xì)胞、藥物）。

1.5 形態(tài)學(xué)觀察 將人宮頸癌HeLa細(xì)胞鋪于六孔板內(nèi)，細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的白英藥物作用24 h，吸棄培養(yǎng)基，PBS沖洗2次，每孔加入1 mL培養(yǎng)基，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)并拍照。

1.6 HE（蘇木精/伊紅）染色 胰酶消化貼壁生長的HeLa細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 ×105個/mL，滴加到置于24孔板底部的蓋玻片上，制作細(xì)胞爬片，24 h后加入不同濃度白英藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24 h取出爬片，PBS清洗2次，95%乙醇固定15 min，PBS清洗3次，每次1 min。蘇木素染色10 min，蒸餾水沖洗1 min。1%鹽酸酒精分化1 min，蒸餾水沖洗1 min，1%稀氨水返藍(lán)5 min，蒸餾水沖洗1 min，浸入0.5%伊紅中5 min，蒸餾水沖洗1 min，分別浸入80%、90%、95%乙醇1 min，共2次，無水乙醇1 min共2次，自來水清洗l min。伊紅染色1 min，自來水清洗30 s。普通光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.7 AO/EB（吖啶橙/溴化乙啶）染色 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以0.25%胰酶消化，收集細(xì)胞，計數(shù)，接種在24孔板中。細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞培養(yǎng)液換為含不同濃度白英藥物的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗去除殘余培養(yǎng)基和未貼壁細(xì)胞，加入新的PBS。按照每毫升PBS中加入20 μL工作液（100 μg/mL AO溶液和100 μg/mL EB溶液按1：1混合）。室溫放置2～5 min后于熒光顯微鏡下觀察。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x± s ）表示，組間比較采用單因素ANOVA方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q法檢驗。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白英提取物體外對HeLa細(xì)胞、BGC-823細(xì)胞的增殖抑制作用 實驗結(jié)果顯示，白英提取物5個濃度對人宮頸癌HeLa細(xì)胞和胃癌BGC-823細(xì)胞作用72 h后，有明顯的抑制作用。統(tǒng)計學(xué)分析表明，不同濃度的藥物對細(xì)胞抑制率存在差異，但藥物濃度超過0.135 3 mg/mL時，大部分細(xì)胞都產(chǎn)生形變，貼壁能力下降，呈漂浮現(xiàn)象，抑制率反而下降。濃度為0.067 6 mg/mL時，對2種細(xì)胞的抑制率達(dá)到最大，分別為86.21%和88.91%。白英提取物干預(yù)后，對相同的細(xì)胞，與0.541 mg/mL濃度組比較，5個濃度組之間比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與5-Fu組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意 義（P＞0.05）；與BGC-823細(xì)胞組的抑制作用相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 白英提取物體外對HeLa細(xì)胞、BGC-823細(xì)胞的增殖抑制作用（x± s ）

2.2 HE染色 HE染色觀察不同濃度白英提取物作用Hela細(xì)胞48 h后細(xì)胞凋亡情況。隨著藥物濃度增加，實驗組可見凋亡細(xì)胞逐漸增多，高濃度組細(xì)胞呈碎塊狀致密濃染，中低濃度組可見部分細(xì)胞變圓，邊界較清晰，細(xì)胞漿被伊紅染成深淺不同的淡紅色。

2.3 AO/EB染色檢測白英提取物對細(xì)胞的作用 AO是DNA染料，能進(jìn)入細(xì)胞膜正常的細(xì)胞中，與DNA結(jié)合發(fā)出綠色熒光；EB膜不通透性染料，可使壞死的細(xì)胞或者凋亡后期繼發(fā)性壞死細(xì)胞呈橙紅色。

未經(jīng)藥物作用的陰性對照細(xì)胞被AO染成綠色，高濃度（5 mg/mL）藥物作用后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯的變化，形態(tài)由正常的梭形變成了橢圓形或圓形，細(xì)胞核被染成桔紅色，膜出現(xiàn)泡狀突起，凋亡細(xì)胞比例逐漸增多，細(xì)胞核碎裂，呈現(xiàn)出凋亡性死亡，同時出現(xiàn)一些被染成致密橙紅色的壞死細(xì)胞；中濃度藥物（2.5 mg/mL）作用后，一些細(xì)胞的胞質(zhì)被染成黃綠色，一些細(xì)胞的細(xì)胞核碎裂，胞漿濃縮，聚集于一邊，呈塊狀或新月狀；低濃度藥物作用時，少量細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。

3 討論

腫瘤是目前嚴(yán)重威脅人類健康的主要疾病之一。尋找有效的抗癌藥物與方法，使人們的生活遠(yuǎn)離癌癥，是引起世界醫(yī)學(xué)界重視的一個重要的研究課題。傳統(tǒng)的治療方法在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時也會對正常細(xì)胞有一定的影響，治療中出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)，因此天然藥物、靶向藥物、傳統(tǒng)中藥的作用效果和作用機制越來越受到人們的關(guān)注和應(yīng)用。

細(xì)胞凋亡又稱程序性細(xì)胞死亡（PCD），多種因素可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可以影響癌細(xì)胞的生長和繁殖。目前發(fā)現(xiàn)多種傳統(tǒng)中藥能有效的對抗癌癥的進(jìn)展，但是中藥治療腫瘤、引起細(xì)胞凋亡的機制還不是非常明確。細(xì)胞凋亡途徑一般可以分為死亡受體通路、線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑。影響細(xì)胞凋亡的基因有細(xì)胞凋亡過程中的表達(dá)基因、促凋亡基因和抑胞凋亡基因。其異常與多種疾病密切相關(guān)，如腫瘤、免疫疾病等。Bcl-2家族是迄今為止被研究較多的細(xì)胞凋亡基因之一。其中包括Bcl-2和Bcl-xL等抗凋亡蛋白及Bax和Bak等促細(xì)胞凋亡蛋白。一些傳統(tǒng)中藥被報道通過影響B(tài)ax/Bcl-2比例的變化來調(diào)控細(xì)胞凋亡。以及caspase、Fas等蛋白、線粒體膜電位變化、NF-κB 途徑等都會影響細(xì)胞凋亡[21-22]。因此，細(xì)胞凋亡的發(fā)生及調(diào)控機制非常復(fù)雜，需要我們進(jìn)一步去深入研究。

綜上所述，白英提取物能誘導(dǎo)HeLa、BGC-823細(xì)胞的凋亡，有效部位的抑瘤率不同。然而，白英提取物的有效部位活性成分及其抗癌機制還有待進(jìn)一步的實驗研究。